pháp ựịnh tắnh)
Xác ựịnh hoạt tắnh enzym cellulase sử dụng phương pháp khuếch tán trên ựĩa thạch (Laurent và cộng sự, 2000). Chủng vi khuẩn ựược nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 180 vòng/phút, ở 300C; sau 24 giờ thu dịch nuôi sinh khối vi khuẩn ựem li tâm với tốc ựộ 5000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch bên trên, nhỏ 50 - 100ộl này vào giếng thạch trên môi trường thử hoạt tắnh enzym cellulase có bổ sung cơ chất CMC 1%, ủ 300C; sau 24 giờ, ựĩa thạch ựược nhuộm bằng thuốc thử lugol ựể quan sát vòng sáng quanh giếng thạch. Vòng sáng quanh giếng thạch càng to, sáng rõ chứng tỏ hoạt tắnh enzym của vi khuẩn càng mạnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 32
Hoạt tắnh enzym ựược xác ựịnh bằng công thức: r = D Ờ d Trong ựó: r (cm): Hoạt tắnh enzym ngoại bào D (cm): đường kắnh vòng phân giải d (cm): đường kắnh giếng thạch
3.2.4. Xác ựịnh các ựặc ựiểm sinh học của chủng Bs4 bằng các phản ứng hóa sinh
(đồng Thị Thanh Thu, 2002; Phạm Thị Ánh Hồng, 2004).
3.2.4.1. Kiểm tra khả năng lên men ựường
ỚNguyên tắc: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men ựường thì ựường sẽ bị lên men
rượu, rượu hoá acid làm pH môi trường giảm làm chuyển màu môi trường.
Ớ Chuẩn bị:
- Môi trường sử dụng là môi trường Phenol broth base (g/l): cao thịt 5, pepton 10, ựường (glucose/saccharose/malttose) 10, phenol red 0,01; pH 7,4.
Ớ Tiến hành
- Cho môi trường Phenol broth base phân phối ựều vào các ống nghiệm, khử trùng 121oC/15 phút
- Cấy 2 chủng Bs1, Bs2 vào môi trường, ựặt 300C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày
Kết quả
- Phản ứng (-): môi trường có màu hồng ựỏ. - Phản ứng (+): môi trường có màu vàng.
3.2.4.2. Kiểm tra khả năng sinh Indol
Ớ Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym trytophanase chuyển hóa tryptophan tạo thành Indol.
Ớ Chuẩn bị:
- Môi trường TSB (Trypone Soy Broth). - Thuốc thử Kovacc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 33
Ớ Tiến hành :
Cấy vi khuẩn vào môi trường TSB, nuôi cấy ở 30oC trong 24 giờ. Sau ựó nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacc vào môi truờng và ựọc kết quả.
Ớ Kết quả
- Phản ứng (-): Lớp mặt có màu vàng. - Phản ứng (+): Lớp mặt có màu ựỏ.
3.2.4.3. Phản ứng Voges Proskauer ( VP)
Ớ Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzym chuyển hóa 2,3
butaneditol thành acetoin khi có oxy và chuyển hóa tiếp thành diacetyl. Diaxetyl kết hợp với guanidin trong pepton tạo phức diaxetyl Ờ guanidin có màu ựỏ hồng.
Ớ Chuẩn bị:
- Chủng thử
- Môi trường Clark Lubs.
- Alpha-naphtol 10%, NaOH 40%.
Ớ Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lubs, nuôi ở
nhiệt ựộ 30oC trong 24 giờ. Sau ựó nhỏ 3 - 5 giọt NaOH 40% và 3 - 5 giọt alpha-naphtol 10%. Sau 15 phút ựọc kết quả.
Ớ Kết quả
- Phản ứng VP (-): Môi trường có màu vàng. - Phản ứng VP (+): Môi trường có màu ựỏ hồng.
3.2.4.4. Phản ứng Methyl-Red (MR)
Ớ Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid.
Ớ Chuẩn bị:
- Môi trường Clark Lubs - Thuốc thử Methyl-Red
Ớ Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lubs, nuôi ở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 34
trường, và ựọc kết quả.
Ớ Kết quả
- Phản ứng (-): Môi trường có màu vàng. - Phản ứng (+): Môi trường có màu ựỏ.
3.2.4.5. Phản ứng khử Nitrat (NO3)
Ớ Nguyên tắc: phát hiện enzym nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrrit và nitơ
phân tử.
NO3 NO2 NH3 hoặc N2
Ớ Chuẩn bị:
- Môi trường Nitrat.
- Dung dịch thuốc thử Griess A, Griess B.
Ớ Tiến hành: Dùng que cấy lấy vi khuẩn vào môi trường thạch Nitrate bán lỏng, nuôi ở 30oC. Sau 24 giờ, nhỏ vào môi trường 2 - 3 giọt Giess A, sau ựó nhỏ tiếp 2 - 3 giọt Giess B.
Ớ Kết quả
- Phản ứng (-): Môi trường có màu vàng. - Phản ứng (+): Môi trường có màu ựỏ.
3.2.4.6. Khả năng sử dụng Citrat.
Ớ Chuẩn bị:
- Chủng thử
- Môi trường Citrat.
Ớ Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường citrat, nuôi ở 30oC trong 24 giờ.
Ớ Kết quả
- Phản ứng (-): Môi trường có màu xanh lá mạ non. - Phản ứng (+): Môi trường có nàu xanh dương.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 35
3.2.4.7. Hoạt tắnh Catalase
Ớ Tiến hành: thực hiện trên phiến kắnh hoặc trên ựĩa petri có môi trường LB ựặc.
Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 10% lên khuẩn lạc. Quan sát hiện tượng và ựọc kết quả
Ớ Kết quả
- Phản ứng (-): Môi trường có màu xanh lá mạ non. - Phản ứng (+): Môi trường có nàu xanh dương.
3.2.4.8. Hoạt tắnh một số enzym ngoại bào củaBacillus subtilis
Xác ựịnh hoạt tắnh của các enzym ngoại bào sử dụng phương pháp khuếch tán trên ựĩa thạch (Laurent và cộng sự, 2000), nuôi lỏng lắc chủng vi khuẩn, sau ựó ly tâm với tốc ựộ 5000 vòng trong 15 phút, thu dịch bên trên, nhỏ dịch vào giếng thạch trên môi trường có bổ sung cơ chất thắch hợp. Ủ 300C trong 24h, sử dụng dung dịch nhuộm phù hợp ựể phát hiện vòng phân giải. Chủng nào có enzym ngoại bào sẽ cho vòng sáng quanh giếng thạch là vòng phân giải cơ chất tương ứng của enzym ựó.
Bảng 3.3. Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh một số enzym ngoại bào của Bacillus subtilis
Hoạt tắnh Phân giải Thành phần môi trường Dung dịch nhuộm
Protease Protein Casein 1%, Agar 2% HgCl2 Amylase Tinh bột Tinh bột 1%, Agar 2% Lugol Cellulase Cellulose CMC 1%, Agar 2% Lugol