để xác ựịnh ựộ bền nhiệt của CMCase chúng tôi tiến hành cho chế phẩm enzym giữ trong dung dịch ựệm photphat (1:1) ở nhiệt ựộ từ (30 Ờ 1000C). Với hoạt lực chế phẩm enzym ban ựầu ở 40C (3.325 UI/g) và hoạt lực còn lại sau khi ựể chế phẩm enzym ở các nhiệt ựộ khác nhau trong 1 giờ. Kết quả ựược thể hiện ở bảng 4.13
Bảng 4.13. độ bền nhiệt của CMCase
Nhiệt ựộ (0C) Hoạt lực còn lại (%)
4 100 30 98.01 40 93.00 50 86.21 60 81.32 70 76.45 80 31.34 90 2.31 100 0.00
Kết quả thu ựược cho thấy nhiệt ựộ càng cao thì hoạt ựộ của cellulase càng giảm; ựặc biệt là từ 800C Ờ 1000C, hoạt ựộ giảm mạnh ở 800C và gần như mất hoạt ựộ ở 900C. Ở nhiệt ựộ từ 40 Ờ 700C hoạt ựộ cellulase giảm ắt. Vậy hoạt ựộ cellulase của chủng Bs4 là tương ựối bền nhiệt.
Những cellulase bền nhiệt có ý nghĩa rất lớn trong thực tế sản xuất và bảo quản sản phẩm sau này. Vì nhiệt ựộ không những ảnh hưởng ựến thời gian bảo quản sản phẩm mà còn ảnh hưởng ựến cách thức tạo chế phẩm. Nếu chúng ta nén sản phẩm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 59
thành viên có thể bảo quản chúng dễ dàng hơn là dạng bột hoặc dạng dịch lỏng. Nhưng nếu ở dạng viên nén phải xử lý ở 1000C trong vòng 30 phút, mà các cellulase thu ựược ở trên sẽ mất hoạt tắnh ở 1000C nên chúng chỉ thắch hợp bảo quản ở dạng bột hoặc dạng lỏng.
Ngoài ra, các enzym bền nhiệt còn có nhiều lợi thế trong quá trình xử lý thức ăn. Thức ăn ựược ủ ở mhiệt ựộ cao trong vài giờ mà vẫn không làm giảm hoạt ựộ mhiều mà còn tăng tốc ựộ phản ứng. Hơn nữa việc trộn enzym vào thức ăn ở nhiệt ựộ cao trước khi cho vật nuôi ăn còn có tác dụng làm giảm sự tạp nhiễm VSV có hại thường phát triển ở nhiệt ựộ 30 Ờ 400C. Mặt khác, các enzym cellulase bền nhiệt còn có lợi thế trong xử lý các phế thải nông nghiệp trong quá trình làm phân bón hữu cơ, thường các ựống ủ có nhiệt ựộ tương ựối cao 49 Ờ 700C
4.8. Xác ựịnh ựộ bền pH của CMCase
pH là yếu tố ảnh hưởng nhiều lên hoạt ựộng của enzym nói chung và của cellulase nói riêng. Vì thế chúng tôi ựã tiến hành xác ựịnh ảnh hưởng của pH lên ựộ bền của cellulase. Theo phương pháp ựã trình bày ở mục 3.2.11. Kết quả thu ựược như sau: Bảng 4.14. độ bền pH của CMCase pH Hoạt lực còn lại (%) 4.0 30.21 4.5 71.38 5.0 90.54 5.5 95.71 6.0 100 6.5 70.02 7.0 63.09 7.5 57.78 8.0 50.68
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 60
Cellulase tương ựối bền ở pH từ 4.5 ựến 8.0; ở pH = 4.0 hoạt ựộ chỉ còn 30% và bền nhất ở pH là 6.0. Vậy enzym CMCase của chủng B. Subtilis Bs4 tương ựối bền ở môi trường axit yếu hoặc bazơ yếu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. đã chọn ựược 1 chủng vi khuẩn Bs4 có khả năng sinh enzym CMCase cao nhất. 2. Nghiên cứu ựặc ựiểm sinh học và thử các phản ứng hóa sinh thấy chủng Bs4 gần giống với loài Bacillus subtilis.
3. Các ựiều kiện nuôi thắch hợp ựể sinh enzym CMCase của chủng Bacillus subtilis
Bs4 như sau: Chất cảm ứng CMC 1%, nhiệt ựộ môi trường: 370C, pH ban ựầu: 6.5, nồng ựộ muối CaCO3 : 0.5%, nhiệt ựộ phản ứng: 500 C, pH phản ứng: 6.0.
4. Bước ựầu tách enzyme CMCase bằng etanol 960 cho hoạt ựộ cao (1.512 UI/ml), hoạt ựộng tốt trong khoảng 30 - 70 oC, chịu ựược pH khoảng rộng 4.5 Ờ 8.0, tốt nhất ở pH 6.0
Kiến nghị
Vì thời gian có hạn, nếu có ựiều kiện cần khảo sát thêm:
1. Nghiên cứu qui trình sản xuất cellulase ở quy mô lớn hơn với các thiết bị lên men chìm (reactor) ựể thu nhận cellulase có hàm lượng và hoạt ựộ cao.
2. Nghiên cứu tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng nhằm nâng cao hoạt ựộ và ựộ bền của cellulase.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Cao Thị Hạnh (2007) Nghiên cứu nuôi vi khuẩn Bacillus thu sinh khối ựể sản xuất chế phẩm EMINA dùng trong chăn nuôi và bảo vệ môi trường, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
2. Lương đức Phẩm (2009) Cơ sở khoa học trong công nghệ bảo vệ môi trường, tập hai, nhà XBGDVN
3. Lương đức phẩm (2005) Sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học dùng trong nông nghiệp, nhà XBGDVN
4. Lương đức Phẩm (1979) Vi sinh tổng hợp, NXBGD Việt Nam
5. Lương đức Phẩm (2004) Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp Hà Nội
6. Lương đức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông Nghiệp
7. Lê đỗ Mai Phương (2004) phân lập, khảo sát ựặc ựiểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu khả năng sinh enzym (protease, amylase) của vi khuẩn ựể sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học, Trường đại Học Nông Lâm TPHCM.
8. Lê Xuân Phương (2001) Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Xây dựng Hà Nội.
9. Nguyễn Lân Dũng (1989) Công nghệ vi sinh, NXBGD
10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn đăng đức, đặng Hồng Nguyên, Phạn Văn Ty, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Phùng Tiến (1976) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập I, II, III, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật
11.Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1983) Thực hành Vi Sinh Vật Học, NXB đại Học và Trung Học Chuyên Nghiệp Hà Nội
12.Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007) Vi sinh vật học, NXBGD
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 63
13.Nguyễn Thị Huyền Thu (2007) Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzym thủy phân từ ựất vườn, Viện đại học Mở Hà Nội
14. Nguyễn đức Lượng (chủ biên), Cao Cường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Oanh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền (2004) Công Nghệ Enzym, NXB đại Học Quốc Gia TP Hồ Chắ Minh.
15. Phan Tuấn Nghĩa, Phạm Thị Trân Châu (2008) Công nghệ Sinh học Ờ tập 3: Enzym và ứng dụng, NXBDG, trang 196.
16.Trần Xuân Ngạch (2005) Công nghệ enzym, đại học Bách Khoa đà Nẵng.
17.Trần đỗ Quyên (2004) nuôi cấy Bacillus subtilis thu nhận α Ờ amylaza và ứng dụng trong sản xuất dextrin, Trường đại Học Nông Lâm TPHCM.
18.Tô Minh Châu (2000) Giáo trình thực tập vi sinh học.
19. Lê Ngọc Tú (2002) Hóa sinh công nghiệp, NXB khoa học và kỹ thuật HN
20. Trịnh đình Khá, đỗ Thị Thanh Huyền (2008). Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật phân hủy cellulose và ựánh giá một số ựặc ựiểm hóa sinh của cellulase, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV. Nxb khoa học và kỹ thuật, Hà Nội: 823- 826
Tài liệu tiếng Anh:
21.Ariffin H, Abdullah N, Umi Kalsom MS, Shirai Y and Hassan MA (2006) Production and Characterisation of cellulase by Bacillus pumilus EB3, Internation Journal of Engineering and Technology, Vol. 3, pp. 47-53,.
22. Cherry JR and Fidantsef (2003) Directed evolution of industrial enzym: an update. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 438 Ờ 443.
23.Ghose TK (1987) Measurement of cellulase activities, Pure & Appl. Chem, Vol. 59, pp. 257Ở268
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 64
24.Hakamada Y, Koike K, Yoshimatsu T, Mori H, Kobayashi T, ItoS (1997) Thermostable alkaline cellulose from an alkaliphilic isolate, Bacillus sp. KSM Ờ S273, Extremophiles 1 (3), 151 Ờ 6.
25.Kim CH, (1995) Characterization and substrate specificity of an endo-beta-1,4-D- glucanase I (Avicelase I) from an extracellular multienzym complex of Bacillus circulans. Applied and Environmental Microbiology Vol.61, No.3, pp. 959-965
26. Lagerkvist A and Chen H (1993) Control of two-step anaerobic degradation of Municipal Solid Waste (MSW) by enzym addition. Water Science and Technology Vol.27, pp 47 Ờ 56.
27.Li-Jung Yin, Hsin-Hung Lin, and Zheng-rong Xiao (2010). Purification and characterization of a cellulase from Bacillus subtilis YJ1. Journal of Marine Science and Technology Vol. 18, No. 3, pp. 466-471
28. Laurent P, L Buchon, JFG. Michel, N Orange (2000). Production of pectate lyases and cellulase by Chyrseomonas luteola strain MFCL0 depends on the growth temperature and the nature of the culture medium: evidence for two critical temperature. Aps and Env. Micro. 66 (4) 1538 Ờ 1543.
29.Mawadra C, Boogerd F C, Zvauya R, Van Verseveld HW (1996) influence of environmental factors on endo-beta-1,4-glucocanase production by Bacillus HR
68, isolated from a Zimbabwean hot spring, Antonie Van Leeuwenhoek 69 (4), 363-9
30.M Paul, B Setlow and P Setlow (2006) Killing of spores of Bacillus subtilis by tert- butyl hydroperoxide plus a TAML_ activator, Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072.
31. Mawadza C, Hatti-Kaul R, Zvauya R, and Matiasson B (2000) Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains. Journal of Biotechnology, Vol. 83, No. 3, pp. 177-187.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 65
32.Ozaki K, Ito S (1991) Purification and properties of an acid endo Ờ beta Ờ 1,4 Ờ glucocanase from Bacillus sp. KSM Ờ 330, J. Gen. Mcrobiol. 137 (1), 41 Ờ 8.
33.Palonen (2004) Hetti Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Espoo VTT Publications 520. 80 p. + app. 62 p.
34. Vijayalakshmi K Sushma, S Abha, and P Chander Isolation
Characterization of Bacillus Subtilis KC3 for Amylolytic Activity Vol. 2, No. 5, September 2012.
Từ trang Wed:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 66
PHỤ LỤC
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 67
Bảng 1. Số liệu ựường chuẩn ựể xác ựịnh hoạt tắnh CMCase
Ống số 1 2 3 4 5 6
Hàm lượng glucose (%) 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 OD (540nm) 0 0.108 0.296 0.475 0.706 0.925
Công thức tắnh hoạt tắnh OD = OD2 Ờ OD1
Từ giá trị OD dựa vào ựường chuẩn xác ựịnh hàm lượng ựường khử B (g/100ml)
CMCase = B*4*10^6 / (180*20*100) (UI/ml)
Trong ựó OD2, OD1 kết quả ựo mẫu 2 và mẫu 1
trong phần 2.3.4
4: là thể tắch dung dịch trong curvet ựem ựo ựộ hấp thu (ml)
180: phân tử lượng của glucose 20: thời gian phản ứng (phút)