Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA MƠI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực : TRẦN THỊ YẾN NHI MSSV: 1151110242 Lớp: 11DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đề tài nghiên cứu cá nhân em Những kết số liệu báo cáo tốt nghiệp thực Viện sinh học nhiệt đới phòng thí nghiệm trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, khơng chép nguồn khác Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tất q thầy tận tình dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt q trình học tập trường Đó hành trang quý giá giúp em hòa nhập tốt vào xã hội, góp phần sức lực nhỏ bé vào cơng xây dựng đất nước Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp HCM anh chị phụ trách phòng hoạt chất có hoạt tính sinh học tạo điều kiện hướng dẫn em hồn thành số thí nghiệm q trình nghiên cứu Chân thành cảm ơn thầy phòng thí nghiệm cơng nghệ sinh học tất bạn phòng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ lúc thực đề tài Con xin gửi tình thương u lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, người gia đình người bên cạnh sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động viên chỗ dựa tinh thần vững cho bước đường Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ x CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Tình hình nghiên cứu 1.3 Mục đích nghiên cứu 1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu 1.5 Phương pháp nghiên cứu 1.6 Các kết đạt đề tài 1.7 Kết cấu đồ án .4 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung enzyme 2.1.1 Sơ lược enzyme .5 2.1.2 Tính chất enzyme 2.1.2.1 Bản chất sinh học 2.1.2.2 Bản chất hóa học 2.2 Giới thiệu sơ lược cellulose 2.3 Giới thiệu sơ lược enzyme cellulase 2.3.1 Định nghĩa 2.3.2 Phân loại 10 2.3.3 Tính chất 10 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.1 Tính đặc hiệu 10 2.3.3.2 Đặc tính vật lý hóa học 10 2.3.3.3 Các chất ức chế 10 2.3.4 Cơ chế tác động enzyme 11 2.3.4.1 Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) 11 2.3.4.2 Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) 11 2.3.4.3 Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) 12 2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 12 2.3.5.1 Thành phần môi trường nuôi cấy .12 2.3.5.2 Nhiệt độ nuôi cấy .13 2.3.5.3 pH môi trường 14 2.3.5.4 Độ ẩm 14 2.3.5.5 Mơi trường khơng khí 14 2.3.6 Ứng dụng enzyme cellulase .14 2.3.6.1 Cải thiện giá trị dinh dưỡng thức ăn gia súc .14 2.3.6.2 Tăng hiệu suất trích ly chất từ nguyên liệu thực vật 15 2.3.6.3 Thủy phân gỗ phế liệu giàu cellulose .15 2.4 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15 2.4.1 Nấm sợi 15 2.4.2 Nấm mốc Trichoderma koningii 16 2.5 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase 17 2.5.1 Bã mía 17 2.5.2 Cám gạo 17 2.6 Phương pháp lên men bề mặt 19 ii Đồ án tốt nghiệp 2.7 Giới thiệu sơ lược phương pháp tách chiết tinh enzyme 20 2.8 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22 2.8.1 Xác định hoạt tính exoglucanase 23 2.8.2 Xác định hoạt tính endoglucanase 23 2.9 Sơ lược sắc ký lọc gel .24 2.9.1 Bản chất phương pháp 24 2.9.2 Đặc tính gel .25 2.10 Sơ lược phân tách protein điện di gel polyacrylamide .26 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .28 3.2 Vật liệu 28 3.2.1 Nguồn vi sinh vật 28 3.2.2 Cơ chất .28 3.2.3 Hóa chất 28 3.3 Thiết bị dụng cụ .29 3.3.1 Thiết bị .29 3.3.2 Dụng cụ 30 3.4 Môi trường 31 3.5 Nội dung phương pháp nghiên cứu 31 3.5.1 Phương pháp phân tích độ ẩm chất 31 3.5.2 Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy 32 3.5.3 Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii 32 3.5.3.1 Cấy giống môi trường thạch nghiêng PGA 32 3.5.3.2 Nhân giống môi trường lúa .33 Đồ án tốt nghiệp 3.5.3.3 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase 34 3.5.4 Phương pháp mơ tả hình thái T koningii 35 3.5.5 Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu 36 3.5.6 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô 36 3.5.7 Khảo sát khả phân hủy cellulose 36 3.5.8 Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford 37 3.5.9 Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) 40 3.5.10 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase 42 3.5.10.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất .43 3.5.10.2 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm môi trường ban đầu .43 3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu 44 3.5.10.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dinh dưỡng 45 3.5.10.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy .45 3.5.10.6 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống .45 3.5.11 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 46 3.5.12 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dịch enzyme dung môi tủa enzyme.47 3.5.12.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dịch enzyme dung môi tủa 47 3.5.12.2 Khảo sát ảnh hưởng loại dung môi tủa enzyme 48 3.5.13 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase .48 3.5.13.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.3 Hoạt tính enzyme cellulase dịch chiết thô .48 Đồ án tốt nghiệp 3.5.14 Phương pháp tinh enzyme cellulase sắc ký lọc gel 49 3.5.14.1 Nguyên tắc .49 3.5.14.2 Hóa chất dụng cụ .49 3.5.14.3 Tiến hành thí nghiệm .49 3.5.15 Phương pháp điện di phân tách protein gel polyacrylamide .51 3.5.16 Phương pháp bố trí xử lý số liệu 55 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1 Khảo sát hình thái đại thể vi thể chủng T.koningii 56 4.2 Khả sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose đĩa thạch 57 4.3 Kết định lượng mốc giống buồng đếm hồng cầu 57 4.4 Kết xác định độ ẩm chất 58 4.5 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase môi trường lên men bán rắn .59 4.5.1 Ảnh hưởng tỷ lệ BM:CG đến khả sinh tổng hợp cellulase 59 4.5.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến khả sinh tổng hợp cellulase 60 4.5.3 Ảnh hưởng pH ban đầu khả sinh tổng hợp cellulase 61 4.5.4 Ảnh hưởng nồng độ dinh dưỡng đến khả sinh tổng hợp cellulase 62 4.5.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase 64 4.5.6 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp cellulase .65 4.6 Quy hoạch thực nghiệm .66 4.7 Khảo sát tỷ lệ tủa chọn loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt .71 Đồ án tốt nghiệp 4.7.1 Khảo sát tỷ lệ tủa dịch chiết enzyme dung môi ethanol 71 4.7.2 Khảo sát tỷ lệ tủa dịch chiết enzyme dung môi acetone 73 4.7.3 Khảo sát chọn dung môi tủa enzyme tối ưu 74 4.8 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 75 4.8.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase .75 4.8.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase .76 4.9 Tinh enzyme cellulase sắc lọc gel .77 4.10 Kết phân tách hệ cellulase phương pháp điện di gel SDS – PAGE 79 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 5.1 Kết luận 82 5.2 Kiến nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC Đồ án tốt nghiệp D A BN MH CCo Bo CCa M rb CCa M rb D3, N5DDi Tthi EEn Czy FFil Pter HHy Edr HHà Lm HHo Tạt HHo Tạt M M Tôi M M W ole NNồ Đng OOp Dtic PPo Gtat SSo G Ddi e El ec T.Tr kic TN, EN, UĐ :ơn VVi Ssin vii Phụ lục 21 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm kết phụ lục 20 ANOVA Table SSu om Be tw W it T o 8 DM f ea 8 F P Summary Statistics C A S S S o v t t u 1.5 0.3 01 90.5 90 14 31 61 92.2 1.14 11.0 20 85 74 17 81.3 21 22.1 1.44 41 41 70.1 20 24 81.0 44 51 81 20.9 65 12.1 1.45 81 81 41.0 20.45 51.8 61.64 14 71.3 00 43 61 71.7 1.95 95 13 61.9 01.71 51.9 11.64 41 51 81.3 10 34 61.3 54 15 21.1 37 T 10 44 5.82 o 134305 Phụ lục 22 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm kết phụ lục 20 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan C M Ho o e mo 4X 5X 3 X X X 3 X X X X X X X X X X X X X X Phụ lục 23 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung mơi ethanol đến hoạt tính enzyme cellulase Lần lặp lại Nghiệm thức (1 (1 (1 (1 (1 (1 (1 71 01 26 22 01 81 13 01 26 22 01 91 10 01 26 22 01 81 Trung bình 39 10 416 22 520 418 916 Phụ lục 24 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi ethanol kết phụ lục 23 ANOVA Table S S uD M F o mf ea Be 6 tw 32 W 21 itT 98 42 o 00 P Summary Statistics C o t y t y t y t y t y t y t y T o 3 3 3 A S St S v t a u 2.8 1 0.4 1 0.4 6 1.1 2 1.2 1 1.1 1.4 13 32 Phụ lục 25 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi ethanol kết phụ lục 23 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan C M H t o e3X o yt 01X yt 10 X yt 61 X yt 61 X yt 29 X yt 02 X y Phụ lục 26 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung mơi acetone đến hoạt tính enzyme cellulase N g h 21 L ầ Trung bì 91 12 01 01 01 72 72 72 51 10 21 61 31 61 016 516 61 51 61 2 112 31 61 nh 317 623 Phụ lục 27 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi acetone kết phụ lục 26 ANOVA Table SSu D M F P B om f6 ea 5- -0 etW 92 91 itT 45 42 o 90 Summary Statistics C A o v t y t y t y t y t y t y t y T 21 o 14 S S S t t u 1.6 1.8 1.0 0.8 1.2 1.6 4 0.4 13 5561 Phụ lục 28 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi acetone kết phụ lục 26 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan t y t y t y t y t y t y t y C M H o e o 5X 1X X X X X X Phụ lục 29 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase Lần lặp lại Nghiệm thức (p 2 (p 3 (p (pH1 (p 2 2 2 2 3 2 Trung bình 2 3 2 Phụ lục 30 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 29 ANOVA Table SSu D M om f ea Be 4 tw W 21 it 60 T 11 o 94 F P Summary Statistics p H p H p H p H p H T o C A St St S o v a a u 6 2.6 1.4 6 1.4 0.7 6 12 33 52 891 Phụ lục 31 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 29 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan p H p H p H p H p H C M H o e o 2X 2X X X X Phụ lục 32 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase L N T ầ g r n h 15 1 u1 30° C 40°422 52 52 52 C 2 50°25 2 C 5 60°16 1 C 6 70°12 1 C Phụ lục 33 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 32 ANOVA Table SSu D M F P om f ea - Be tw 0 W 31 it 90 T 31 o 24 Summary Statistics T o C A S S S o v t t u 0.8 1.6 2.01 15 0.9 3.3 98 1 12 1242 Phụ lục 34 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 32 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan C M H o e o 1X 1X 1X X 2 X Phụ lục 35 Một số hình ảnh máy móc, thiết bị sử dụng nghiên cứu Hình P1 Máy ly tâm Hình P2 Kính hiển vi quang học Hình P4 Buồng đếm hồng cầu Hình P3 Autoc lave Hìn h P5 Cân phân tích Hình P6 Kính hiển vi điện tử Hình P8 Hệ thống máy sắc ký cột Hình P10 Máy đo quang phổ kế UV – Vis Hình P7 Bể ủ nhiệt Hình P9 Thiết bị điện di đứng Hình P11 Tủ sấy Hình P12 Bếp điện Hình P13 Máy đo pH Phụ lục 36 Hình ảnh thí nghiệm a b Hình P14 Mơi trường lên men bán rắn trước cấy nấm T koningii (hình a) sau cấy nấm 48 (hình b) Hình P15 Mẫu đo hoạt tính enzyme c e l l u l a s e Hình P16 Mẫu đo hàm lượng protein enzyme cellulase ... .15 2.4 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15 2.4.1 Nấm sợi 15 2.4.2 Nấm mốc Trichoderma koningii 16 2.5 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase 17... cellulase từ nấm Trichoderma koningii cách tối ưu 1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu - Quan sát đại thể vi thể hình thái nấm mốc Trichoderma koningii - Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma. .. enzyme cellulase - Có thơng số tối ưu q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Trichoderma koningii Đồ án tốt nghiệp - Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase phương pháp kết tủa - Tinh enzyme cellulase