Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc trichoderma koningii và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HĨA MƠI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : CN ĐỖ THỊ TUYẾN Sinh viên thực MSSV: 1151110242 : TRẦN THỊ YẾN NHI Lớp: 11DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đề tài nghiên cứu cá nhân em Những kết số liệu báo cáo tốt nghiệp thực Viện sinh học nhiệt đới phòng thí nghiệm trường Đại học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, khơng chép nguồn khác Em hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường tất q thầy tận tình dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho em suốt q trình học tập trường Đó hành trang quý giá giúp em hòa nhập tốt vào xã hội, góp phần sức lực nhỏ bé vào cơng xây dựng đất nước Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người tạo điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên em suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp HCM anh chị phụ trách phòng hoạt chất có hoạt tính sinh học tạo điều kiện hướng dẫn em hồn thành số thí nghiệm q trình nghiên cứu Chân thành cảm ơn thầy phòng thí nghiệm cơng nghệ sinh học tất bạn phòng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ lúc thực đề tài Con xin gửi tình thương u lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, người gia đình người bên cạnh sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động viên chỗ dựa tinh thần vững cho bước đường Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015 Sinh viên Trần Thị Yến Nhi Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ x CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Tình hình nghiên cứu 1.3 Mục đích nghiên cứu 1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu 1.5 Phương pháp nghiên cứu 1.6 Các kết đạt đề tài 1.7 Kết cấu đồ án .4 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung enzyme 2.1.1 Sơ lược enzyme .5 2.1.2 Tính chất enzyme 2.1.2.1 Bản chất sinh học 2.1.2.2 Bản chất hóa học 2.2 Giới thiệu sơ lược cellulose 2.3 Giới thiệu sơ lược enzyme cellulase 2.3.1 Định nghĩa 2.3.2 Phân loại 10 2.3.3 Tính chất 10 i Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.1 Tính đặc hiệu 10 2.3.3.2 Đặc tính vật lý hóa học 10 2.3.3.3 Các chất ức chế 10 2.3.4 Cơ chế tác động enzyme 11 2.3.4.1 Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) 11 2.3.4.2 Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) 11 2.3.4.3 Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) 12 2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase 12 2.3.5.1 Thành phần môi trường nuôi cấy .12 2.3.5.2 Nhiệt độ nuôi cấy .13 2.3.5.3 pH môi trường 14 2.3.5.4 Độ ẩm 14 2.3.5.5 Mơi trường khơng khí 14 2.3.6 Ứng dụng enzyme cellulase .14 2.3.6.1 Cải thiện giá trị dinh dưỡng thức ăn gia súc .14 2.3.6.2 Tăng hiệu suất trích ly chất từ nguyên liệu thực vật 15 2.3.6.3 Thủy phân gỗ phế liệu giàu cellulose .15 2.4 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15 2.4.1 Nấm sợi 15 2.4.2 Nấm mốc Trichoderma koningii .16 2.5 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase .17 2.5.1 Bã mía 17 2.5.2 Cám gạo 17 2.6 Phương pháp lên men bề mặt 19 ii Đồ án tốt nghiệp 2.7 Giới thiệu sơ lược phương pháp tách chiết tinh enzyme 20 2.8 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase 22 2.8.1 Xác định hoạt tính exoglucanase 23 2.8.2 Xác định hoạt tính endoglucanase 23 2.9 Sơ lược sắc ký lọc gel .24 2.9.1 Bản chất phương pháp .24 2.9.2 Đặc tính gel .25 2.10 Sơ lược phân tách protein điện di gel polyacrylamide .26 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .28 3.2 Vật liệu 28 3.2.1 Nguồn vi sinh vật .28 3.2.2 Cơ chất .28 3.2.3 Hóa chất 28 3.3 Thiết bị dụng cụ .29 3.3.1 Thiết bị .29 3.3.2 Dụng cụ 30 3.4 Môi trường 31 3.5 Nội dung phương pháp nghiên cứu 31 3.5.1 Phương pháp phân tích độ ẩm chất 31 3.5.2 Phương pháp tính độ ẩm bổ sung môi trường nuôi cấy 32 3.5.3 Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii 32 3.5.3.1 Cấy giống môi trường thạch nghiêng PGA 32 3.5.3.2 Nhân giống môi trường lúa 33 iii Đồ án tốt nghiệp 3.5.3.3 Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase 34 3.5.4 Phương pháp mơ tả hình thái T koningii 35 3.5.5 Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc buồng đếm hồng cầu 36 3.5.6 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô 36 3.5.7 Khảo sát khả phân hủy cellulose 36 3.5.8 Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford 37 3.5.9 Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) 40 3.5.10 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase 42 3.5.10.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất .43 3.5.10.2 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm môi trường ban đầu .43 3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu 44 3.5.10.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dinh dưỡng 45 3.5.10.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy .45 3.5.10.6 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống .45 3.5.11 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 46 3.5.12 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dịch enzyme dung môi tủa enzyme.47 3.5.12.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dịch enzyme dung môi tủa 47 3.5.12.2 Khảo sát ảnh hưởng loại dung môi tủa enzyme 48 3.5.13 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase .48 3.5.13.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase 48 3.5.13.3 Hoạt tính enzyme cellulase dịch chiết thô 48 iv Đồ án tốt nghiệp 3.5.14 Phương pháp tinh enzyme cellulase sắc ký lọc gel 49 3.5.14.1 Nguyên tắc .49 3.5.14.2 Hóa chất dụng cụ 49 3.5.14.3 Tiến hành thí nghiệm .49 3.5.15 Phương pháp điện di phân tách protein gel polyacrylamide .51 3.5.16 Phương pháp bố trí xử lý số liệu 55 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1 Khảo sát hình thái đại thể vi thể chủng T.koningii 56 4.2 Khả sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose đĩa thạch 57 4.3 Kết định lượng mốc giống buồng đếm hồng cầu 57 4.4 Kết xác định độ ẩm chất 58 4.5 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase môi trường lên men bán rắn .59 4.5.1 Ảnh hưởng tỷ lệ BM:CG đến khả sinh tổng hợp cellulase 59 4.5.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến khả sinh tổng hợp cellulase 60 4.5.3 Ảnh hưởng pH ban đầu khả sinh tổng hợp cellulase 61 4.5.4 Ảnh hưởng nồng độ dinh dưỡng đến khả sinh tổng hợp cellulase 62 4.5.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp cellulase 64 4.5.6 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp cellulase .65 4.6 Quy hoạch thực nghiệm .66 4.7 Khảo sát tỷ lệ tủa chọn loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt .71 v Đồ án tốt nghiệp 4.7.1 Khảo sát tỷ lệ tủa dịch chiết enzyme dung môi ethanol 71 4.7.2 Khảo sát tỷ lệ tủa dịch chiết enzyme dung môi acetone 73 4.7.3 Khảo sát chọn dung môi tủa enzyme tối ưu 74 4.8 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase 75 4.8.1 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase .75 4.8.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase .76 4.9 Tinh enzyme cellulase sắc lọc gel .77 4.10 Kết phân tách hệ cellulase phương pháp điện di gel SDS – PAGE 79 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 5.1 Kết luận 82 5.2 Kiến nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BM:CG : Bã mía cám gạo CBB : Coomasie brilliant blue CMC : Carboxymethyl cellulose CMCase : Carboxymethyl cellulase DNS : 3,5-dinitrosalicylic acid DTT : Dithiothreitol EC : Enzyme commission number (tiểu ban enzyme) FPA : Filter paper activity (hoạt tính giấy lọc) HEC : Hydroxyethyl cellulose HL : Hàm lượng protein (mg) HT : Hoạt tính enzyme (U) HTR : Hoạt tính riêng (U/mg) MT : Môi trường MW : Molecular weight (trọng lượng phân tử) NĐC : Nồng độ chuẩn OD : Optical density (trị số mật độ quang) PGA : Potato glucose agar SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide Electrophoresis T koningii : Trichoderma koningii TEMED : N, N, N’, N’ – Tetramethyl – ethylenediamine U : Đơn vị hoạt tính enzyme VSV : Vi sinh vật vii Gel Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 15 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy kết phụ lục 14 ANOVA Table Sum of Source Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 2621.56 0.0000 Between groups 94835.8 13 7295.06 Within groups 77.9162 28 2.78272 Total (Corr.) 94913.7 41 Summary Statistics Count Average Standard deviation Standard error 104 gio 46.26 2.12812 1.22867 138.78 112 gio 34.7 1.1732 0.677348 104.1 16 gio 43.37 1.42032 0.82002 130.11 24 gio 101.2 1.56847 0.905557 303.6 32 gio 138.79 2.21962 1.2815 416.37 40 gio 170.6 1.51555 0.875005 511.8 48 gio 159.03 1.17427 0.677963 477.09 56 gio 130.12 1.58811 0.916897 390.36 64 gio 109.88 2.76917 1.59878 329.64 72 gio 104.09 0.208087 0.120139 312.27 gio 8.67 0.714353 0.412432 26.01 80 gio 72.29 1.39173 0.803513 216.87 88 gio 66.5 1.41481 0.816844 199.5 96 gio 57.83 2.30007 1.32794 173.49 Total 42 88.8093 48.1141 7.42417 3729.99 95 Sum Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 16 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy kết phụ lục 14 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan Count Mean Homogeneous Groups gio 8.67 X 112 gio 34.7 X 16 gio 43.37 X 104 gio 46.26 X 96 gio 57.83 X 88 gio 66.5 X 80 gio 72.29 X 24 gio 101.2 X 72 gio 104.09 X 64 gio 109.88 X 56 gio 130.12 X 32 gio 138.79 X 48 gio 159.03 X 40 gio 170.6 X Phụ lục 17 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase Nghiệm thức (0,5 x 107 bào tử/MT) (1 x 107 bào tử/MT) (1,5 x 107 bào tử/MT) (2 x 107 bào tử/MT) (2,5 x 107 bào tử/MT) (3 x 107 bào tử/MT) 146,33 151,72 151,53 148,21 150,75 150,83 Lần lặp lại 147,61 153.17 149,87 148,19 150,84 148,11 96 146,13 149,55 145,84 149,04 149,25 150,10 Trung bình 146,69 151,48 149,08 148,48 150,28 149,68 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 18 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống kết phụ lục 17 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 40.1642 8.03285 Within groups Total (Corr.) 31.0822 71.2464 12 17 2.59018 F-Ratio P-Value 3.10 0.0502 Summary Statistics Count Average Standard deviation Standard error Sum 146.69 0.802994 0.463609 440.07 151.48 1.82189 1.05187 454.44 3 149.08 2.92611 1.68939 447.24 148.48 0.485077 0.28006 445.44 150.28 0.893141 0.515655 450.84 149.68 1.4078 0.812794 449.04 Total 18 149.282 2.04719 0.482526 2687.07 Phụ lục 19 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy kết phụ lục 17 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan Count Mean Homogeneous Groups 146.69 X 148.48 XX 3 149.08 XXX 149.68 XX 150.28 XX 151.48 X 97 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 20 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bình 103,51 106,17 103,31 104,33 145,81 142,11 143,48 143,80 165,12 162,83 162,67 163,54 191,78 189,96 193,48 191,74 51,76 55,64 53,31 53,57 148,34 147,07 144,45 146,62 152,56 153,45 150,77 152,26 157,99 156,53 159,18 157,90 100,23 102,42 101,88 101,51 10 138,69 137,52 138,27 138,16 11 158,23 161,44 162,49 160,72 12 175,65 173,59 175,22 174,82 13 49,28 47,87 46,64 47,93 14 140,35 139,19 143,40 140,98 15 149,58 149,23 149,51 149,44 16 156,21 154,82 154,21 155,08 17 183,76 182,23 183,85 183,28 18 178,68 180,11 182,89 180,56 19 190,13 188,21 188,42 188,92 98 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 21 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm kết phụ lục 20 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 90113.2 18 5006.29 2150.11 0.0000 Within groups 88.4786 38 2.32838 Total (Corr.) 90201.7 56 Summary Statistics Count Average Standard deviation Standard error Sum 104.33 1.59662 0.92181 312.99 10 138.16 0.592706 0.342199 414.48 11 160.72 2.21939 1.28137 482.16 12 174.82 1.08669 0.627402 524.46 13 47.93 1.32102 0.762693 143.79 14 140.98 2.17456 1.25548 422.94 15 149.44 0.185203 0.106927 448.32 16 155.08 1.02504 0.591805 465.24 17 183.28 0.910439 0.525642 549.84 18 180.56 2.14077 1.23597 541.68 19 188.92 1.05314 0.60803 566.76 143.8 1.87064 1.08002 431.4 3 163.54 1.37066 0.791349 490.62 191.74 1.76034 1.01633 575.22 53.57 1.95302 1.12758 160.71 146.62 1.98366 1.14527 439.86 152.26 1.36495 0.788057 456.78 157.9 1.32729 0.766312 473.7 101.51 1.14092 0.658711 304.53 Total 57 143.956 40.1341 5.31589 8205.48 99 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 22 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát tối ưu hóa thực nghiệm kết phụ lục 20 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan Count Mean Homogeneous Groups 13 47.93 X 53.57 X 101.51 X 104.33 X 10 138.16 X 14 140.98 X 143.8 X 146.62 X 15 149.44 X 152.26 X 16 155.08 X 157.9 X 11 160.72 X 3 163.54 X 12 174.82 X 18 180.56 X 17 183.28 X 19 188.92 X 191.74 X 100 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 23 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung mơi ethanol đến hoạt tính enzyme cellulase Nghiệm thức (1:1) (1:2) (1:3) (1:4) (1:5) (1:6) (1:7) Lần lặp lại 33,26 104,21 168,03 223,25 203,12 191,53 164,07 27,55 105,11 167,14 225,11 205,55 189,27 162,42 Trung bình 30,36 105,02 168,20 227,48 204,89 188,69 157,02 30,39 104,78 167,79 225,28 204,52 189,83 161,17 Phụ lục 24 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi ethanol kết phụ lục 23 ANOVA Table Between groups Sum of Squares 80374.1 Within groups 29.6559 14 Total (Corr.) 80403.8 20 Source Df Mean Square F-Ratio P-Value 13395.7 6323.86 0.0000 2.11828 Summary Statistics Count Average Standard deviation Standard error Sum ty le 1:1 30.39 2.85512 1.6484 91.17 ty le 1:2 104.7 0.455302 0.262869 314.1 ty le 1:3 167.653 0.460471 0.265853 502.96 ty le 1:4 224.547 1.12616 0.650188 673.64 ty le 1:5 204.397 1.21969 0.704186 613.19 ty le 1:6 190.21 1.17695 0.67951 570.63 ty le 1:7 162.553 1.45459 0.839808 487.66 Total 21 154.921 63.405 13.8361 3253.35 101 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 25 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi ethanol kết phụ lục 23 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan ty le 1:1 ty le 1:2 Count 3 Mean 30.39 104.7 ty le 1:7 162.553 ty le 1:3 ty le 1:6 ty le 1:5 ty le 1:4 3 3 167.653 190.21 204.397 224.547 Homogeneous Groups X X X X X X X Phụ lục 26 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa với dung môi acetone đến hoạt tính enzyme cellulase Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bình (1:1) 52,11 49,69 52,73 51,51 (1:2) 103,20 105,77 102,25 103,74 (1:3) 176,03 176,54 178,04 176,87 (1:4) 229,59 230,36 231,28 230,41 (1:5) 166,34 163,78 165,24 165,12 (1:6) 162,30 159,31 161,99 161,20 (1:7) 124,33 124,47 125,12 124,64 Phụ lục 27 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi acetone kết phụ lục 26 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 59504.4 9917.4 Within groups 24.4686 14 1.74776 Total (Corr.) 59528.8 20 102 F-Ratio 5674.36 P-Value 0.0000 Đồ án tốt nghiệp Summary Statistics Count Average Standard deviation Standard error Sum ty le 1:1 51.51 1.60636 0.927434 154.53 ty le 1:2 103.74 1.82107 1.0514 311.22 ty le 1:3 176.87 1.04484 0.603241 530.61 ty le 1:4 230.41 0.846109 0.488501 691.23 ty le 1:5 165.12 1.28421 0.74144 495.36 ty le 1:6 161.2 1.64411 0.949228 483.6 ty le 1:7 124.64 0.421545 0.243379 373.92 Total 21 144.784 54.5568 11.9053 3040.47 Phụ lục 28 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ tủa enzyme cellulase với dung môi acetone kết phụ lục 26 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan Count Mean ty le 1:1 51.51 X ty le 1:2 103.74 X ty le 1:7 124.64 X ty le 1:6 161.2 X ty le 1:5 165.12 X ty le 1:3 176.87 X ty le 1:4 230.41 X 103 Homogeneous Groups Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 29 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase Lần lặp lại Nghiệm thức Trung bình (pH 4) 206,28 206,33 204,46 205,69 (pH 5) 234,84 234,52 239,33 236,23 (pH 6) 232,50 229,71 230,31 230,84 (pH7) 219,15 219,01 216,65 218,27 (pH 8) 212,86 211,64 211,44 211,98 Phụ lục 30 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 29 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 1953.59 488.397 Within groups 26.1782 10 2.61782 Total (Corr.) 1979.77 14 F-Ratio P-Value 186.57 0.0000 Summary Statistics Count Average Standard deviation Standard error Sum pH 205.69 1.0655 0.615169 617.07 pH 236.23 2.68944 1.55275 708.69 pH 230.84 1.46857 0.84788 692.52 pH 218.27 1.40471 0.811008 654.81 pH 211.98 0.768635 0.443772 635.94 Total 15 220.602 11.8917 3.07042 3309.03 104 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 31 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 29 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan Count Mean Homogeneous Groups pH 205.69 X pH 211.98 X pH 218.27 X pH 230.84 X pH 236.23 X Phụ lục 32 Số liệu hoạt tính CMCase dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bình 30°C 154,34 155,74 154,23 154,77 40°C 223,13 224,08 226,38 224,53 50°C 252,05 249,61 253,65 251,77 60°C 161,84 160,17 161,92 161,31 70°C 124,79 126,52 131,25 127,52 Phụ lục 33 Bảng ANOVA thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 32 ANOVA Table Source Sum of Squares Df Mean Square Between groups 32384.0 8096.0 Within groups 39.5992 10 3.95992 Total (Corr.) 32423.6 14 Summary Statistics 105 F-Ratio P-Value 2044.49 0.0000 Đồ án tốt nghiệp Count Average Standard deviation Standard error Sum 30°C 154.77 0.841843 0.486038 464.31 40°C 224.53 1.67108 0.964797 673.59 50°C 251.77 2.0345 1.17462 755.31 60°C 161.31 0.988079 0.570468 483.93 70°C 127.52 3.34408 1.93071 382.56 Total 15 183.98 48.1246 12.4257 2759.7 Phụ lục 34 Bảng trắc nghiệm phân hạng thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase kết phụ lục 32 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent Duncan Count Mean 70°C 127.52 X 30°C 154.77 X 60°C 161.31 X 40°C 224.53 X 50°C 251.77 X 106 Homogeneous Groups Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 35 Một số hình ảnh máy móc, thiết bị sử dụng nghiên cứu Hình P2 Kính hiển vi quang học Hình P1 Máy ly tâm Hình P4 Buồng đếm hồng cầu Hình P5 Cân phân tích Hình P3 Autoclave 107 Đồ án tốt nghiệp Hình P7 Bể ủ nhiệt Hình P6 Kính hiển vi điện tử Hình P8 Hệ thống máy sắc ký cột Hình P9 Thiết bị điện di đứng Hình P10 Máy đo quang phổ kế UV – Vis 108 Hình P11 Tủ sấy Đồ án tốt nghiệp Hình P12 Bếp điện Hình P13 Máy đo pH Phụ lục 36 Hình ảnh thí nghiệm a b Hình P14 Mơi trường lên men bán rắn trước cấy nấm T koningii (hình a) sau cấy nấm 48 (hình b) Hình P16 Mẫu đo hàm lượng protein enzyme cellulase Hình P15 Mẫu đo hoạt tính enzyme cellulase 109 ... .15 2.4 Vi sinh vật tổng hợp cellulase 15 2.4.1 Nấm sợi 15 2.4.2 Nấm mốc Trichoderma koningii .16 2.5 Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase .17... cellulase từ nấm Trichoderma koningii cách tối ưu 1.4 Nhiệm vụ nghiên cứu - Quan sát đại thể vi thể hình thái nấm mốc Trichoderma koningii - Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma. .. Thu enzyme cellulase - Có thơng số tối ưu trình sinh tổng hợp enzyme cellulase Trichoderma koningii Đồ án tốt nghiệp - Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase phương pháp kết tủa - Tinh enzyme cellulase