Tối ưu hóa lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng micromonospora n 0 9

BỘ GIÁO DỤC - ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DƯỢC S ĩ NGUYỄN VĂN LỊCH Tối ƯU HOÁ LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪCHỦNG MICR0M0N0SP0RA N°9 Luận Văn : THẠC SĨ DƯỢC HỌC C huyên ngành : CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẩ M - BÀO C H Ế THUỐC M ã sô Người hướng dẫn : 607301 :TIẾN SĨ CAO VĂN THU M ỤC LỤC T LỜI CẢM ƠN CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU PHẨN 1: TỔNG QUAN 1.1- Đại cương vê KS 1.1.1- Lịch sử phát triển thuốc KS 1.1.2- Định nghĩa kháng sinh 1.1.3- Những vấn đề phân lập kháng sinh nghiên cứu đưa vào sản xuất 1.2 Phân lập cải tạo chọn giống VSV: 1.2.1- Các phương pháp phân lập vỉ sinh vật sinh kháng sinh 1.2.1.1- Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch 1.2.1.2- Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch chứa sẵn v s v kiểm định 1.2.1.3- Phương pháp làm giàu đất 1.2.1.4- Phương pháp thêm KS vào môi trường phân lập 1.2.1.5- Phương pháp phân lập v s v sinh KS chống ung thư 1.2.2- Các phương pháp cải tạo giống v s v 1.2.2.1- Đột biến ánh sáng u v 1.2.2.2- Phương pháp sàng lọc 1.2.2.3- Chọn giống bậc thang 1.3- Đại cương Micromonospora 1.3.1- Đặc điểm lớp xạ khuẩn Actinomycetes 1.3.2- Lớp phụ Acãnomycetales 1.3.3- Micromonosporaceae 1.3.4- Micromonospora 1.3.5- Một sô KS tạo thành từ Mỉcromonospora 1.4- Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1- Lên men bề mặt 1.4.2- Lên men chìm 1.4.2.1- Lên men gián đoạn 1.4.2.2- Lên men có bổ sung 1.4.2.3- Lên men liên tục 1.4.3- Một sơ nghiên cứu mói vê lên men sản xuất kháng sinh 1.4.3.1- Ánh hưởng tác nhân gây thoái hoá biến acid clavulanic lên men có bổ sung chủng Streptomyces clavulỉgerus 1.4.3.2- Ảnh hưởng giai đoạn tiền lên men lên men acid cỉavulanic 1.5- Chiết tách tinh chế 1.5.1- Chiết xuất 1.5.1.1- Chiết đơn 1.5.1.2- Chiết lặp 1.5.2- Các phương pháp sắc ký 1.5.2.1- Định nghĩa 1.5.2.2-Phân loại 1.5.2.3-Sắc ký lớp mỏng 1.5.2.4Sắc ký cột 1.5.2.5- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.6- Phương pháp quy hoạch đơn hình tìm điều kiện tối ưu 1.6.1- Giới thiệu phương pháp 1.6.2- Nội dung phương pháp quy hoạch đơn hình PHẨN 2; ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1- Đối tượng 2.1.1- Vi sinh vật 2.1.2- Các môi trường sử dụng: 2.1.3- Một sơ dung mơi, hố chất sử dụng 2.1.4- Thiết bị máy móc nghiên cứu 2.2- Các phương pháp nghiên cứu 2.2.1- Phương pháp giữ giống thạch nghiêng 2.2.2- Phương pháp lên men 2.2.2.1- Lên men gián đoạn máy lắc 2.2.22- Lên men gián đoạn thiết bị Bioflo 110 2.2.3- Phương pháp thử hoạt tính KS 2.2.4- Phương pháp chiết KS dung môi hữu 2.2.5- Phương pháp sắc ký 2.2.5.1- Sắc ký lớp mỏng 2.2.52- Phương pháp sắc ký cột 2.2.6- Phương pháp định lượng đường Schoorl - Regenbogen PHẨN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1- Kết sàng lọc chọn giống 3.2- Kết tối ưu hoá điều kiện lên men STHKS từ Micromonospora N°9 3.2.1- Kết tơi ưu hố điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Micromonospora N09 phương pháp quy hoạch đơn hình máy lấc trịn 3.2.1.1- Tham số đơn hình so kết quảquy hoạch đợt 3.2.2.2- Tham số đơn hình kết quy hoạch đợt 3.2.2.3- Tham số đơn hình kết quy hoạch đợt 3.3- Kết lên men thiết bị lên men Bioflo 110 3.4- Kết chiết xuất - tinh chế 3.4.1- Kết chiết KS từ dịch lên men sang dung môi hữu 3.4.2- Kết sắc ký lớp mỏng 3.4.2.1- Sắc ký lớp mỏng chiều 3.4.3.2- Sắc ký lớp mỏng chiều 3.4.4- Sắc ký cột 3.4.5- Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.5- Bàn luận số kết PHẨN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 4.1- Kết luận 4.2- Đê xuất TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 22 23 24 25 26 26 26 30 30 30 30 31 31 32 32 32 32 33 36 37 38 38 39 39 41 41 41 41 41 42 47 50 50 51 51 52 53 53 54 56 56 56 58 61 LỜI CẢM 0N Tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Cao Văn Thu trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ tơi thực cơng trình nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Nguyễn Đình Luyện giúp tơi việc phân tích số mẫu q trình nghiên cứu Cơng trình cịn có giúp đỡ : - Các thầy giáo, cô giáo truyền đạt kiến thức cho chương trình đào tạo Thạc sĩ - Ban giám hiệu, Phịng Đào tạo sau Đại học, thư viện, thầy giáo, cô giáo, kỹ thuật viên môn công nghiệp dược, mơn phịng ban liên quan Trường Đại học Dược Hà Nội Với thời gian thực đề tài khơng nhiều nên cơng trình khơng khỏi có chỗ cịn khiếm khuyết Rất mong thầy bạn bè đồng nghiệp đóng góp ý kiến đ ể cơng trình hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn ỉ Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2003 DS Nguyễn Văn Lịch CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT -B p Bacillus pumilus ATCC 10241 -D Đường kính vịng vơ khuẩn trung bình(mm) 3- Ec Eschericha coli ATCC 25922 4-HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao 5- s Độ lệch thực nghiệm hiệu chỉnh -SK 7- SKLM - VK 9- v sv Sắc ký Sắc ký lớp mỏng Vi khuẩn Vi sinh vật MỎ ĐẦU Mặc dù có nhiều kháng sinh (KS) tìm số đưa vào ứng dụng có hiệu điều trị Hơn ngày tìm nhiều tính số KS đưa vào ứng dụng ngành kinh tế khác nghiên cứu khoa học Đồng thời nhiều nguyên nhân xuất nhiều chủng, loài vi khuẩn gây bệnh kháng kháng sinh Cơng việc tìm kiếm kháng sinh có hiệu sử dụng, thuận lợi sản xuất có nhiều tính ln nhà khoa học giới quan tâm nghiên cứu Hướng nghiên cứu tìm kiếm kháng sinh từ lồi vi sinh vật quan tâm Từ năm 1990 môn công nghiệp dược tổ vi nấm Trường Đại học Dược Hà Nội tiến hành nghiên cứu phân lập chủng Micromonospora có khả sinh tổng hợp KS Các chủng cải tạo giống qua số hệ đột biến, có chủng Micromonospora N°9 Micromonospora N°108 có hoạt lực KS mạnh Trên sở kết nghiên cứu tơi lựa chọn đề tài với tựa đề "Tối ưu hoá lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng Micromonospora N°9" với mục tiêu sau: - Tiến hành lên men sinh tổng hợp KS qui mơ phịng thí nghiệm mắy lắc tìm điều kiên lên men tối ưu - Bước đầu lên men sinh tổng hợp kháng sinh quy mơ phịng thí nghiêm bình lên men 7,51 - Cải tiến phương pháp chiết tách tinh chế kháng sinh Phán 1: TỔNG QUAN 1.1- ĐẠI CƯƠNG VỂ KS: [7] [9] 1.1.1, Lịch sử phát triển thuốc KS Trong năm đầu kỷ XX, nhiễm khuẩn nguyên gây bệnh tử vong “Thời đại kháng sinh” mở đầu qua việc phát penicilin - kháng sinh Mặc dù Fleming phát Penicillium notatum sinh tổng hợp penicilin từ năm 1928, penicilin bắt đầu đưa vào ứng dụng lâm sàng chiến tranh giới thứ II kỷ XX Trong thập kỷ 70, với phát triển kỹ nghệ dược phẩm, công ty dược phẩm chun khoa hố vào hai loại kháng sinh Đến đầu thập niên 80, người ta đưa vào thị trường 50 loại penicilin 70 loại cephalosporin, 12 loại tetracyclin, loại aminoglycosid Và ngày số lượng thuốc kháng sinh tăng mạnh 1.1.2, Định nghĩa kháng sinh (KS): [9] KS sản phẩm đặc biệt nhận từ vi sinh vật (VSV) hay nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao có tác dụng kìm hãm tiêu diệt cách chọn lọc lên nhóm v s v xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật ) hay tế bào ung thư nồng độ thấp 1.1.3, Những vấn đề phân lập kháng sinh nghiên cứu đưa vào sản xuất Hiện người phân lập nhiều chủng loại v s v với đặc trưng đa dạng Tuy nhiên có nhiều ý kiến cho nhân loại phân lập khoảng % số v s v tồn tự nhiên mà quan niệm mà thực khách quan khả phân lập chủng lồi v s v qua phát hoạt chất có KS hồn tồn có sở thực tế có nhiều hội thành cơng Các khả có xác suất lớn tìm KS - Phân lập v sv từ mẫu chất đặc thù riêng hoàn toàn - Sử dụng phương pháp phân lập - Sử dụng hệ thống thử Các bước cụ thể hợp lý đường phân lập KS giới thiệu hình 1.1 Hình 1.1: Chiến lược sàng lọc vsv sản xuất KS - Cơ chất phân lập Micromonospora N09 phân lập từ mẫu đất lấy huyện Hoành Bồ tỉnh Quảng Ninh cho thấy số dấu khả quan tìm kháng sinh - Các phương pháp phân lập sàng lọc để chủng khiết có hoạt tính kháng sinh cao trình bày phần cải tạo chọn giống v s v - Nuôi cấy bề mặt, lên men chìm trình bày phần lên men sinh tổng hợp kháng sinh - Hiện chủng Mỉcromonospora N09 phân lập khiết qua số bước sàng lọc, cải tạo đột biến ni cấy bề mặt có hoạt tính kháng sinh tốt Lên men chìm thử hoạt tính có kháng sinh mạnh Kháng sinh Micromonospora N°9 sinh q trình lên men có hoạt lực mạnh có khả diệt nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh gram (-), gram (+) có khả chống lại số chủng nấm gây bệnh [ ] Tuy nhiên ngồi cơng việc tìm cách phân tách kháng sinh thu sau lên men đủ lượng đủ tinh khiết để xác định xem sản phẩm nguyên gốc hay không Tiếp tục bước nghiên cứu đặc trưng kháng sinh tiếp tục bước để phát triển kháng sinh Đồng thời phải tiếp tục cải tạo sàng lọc để thu chủng có khả cho hiệu suất tạo kháng sinh tăng cách mạnh mẽ tìm điều kiện tối ưu để lên men sinh tổng hợp kháng sinh tối đa đưa nhanh cơng việc tìm kiếm kháng sinh từ Micromonospora N°9 tới đích cuối 1.2- Phân lập cải tạo chọn giống VSV: 1.2.1- Các phương pháp phản lập vi sinh vật sinh kháng sinh Để phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh người ta phải lấy mẫu từ nguồn chất khác nhau: đất ruộng, đất quanh rễ cây, đất chuồng gia cầm, nước sông hồ từ mẫu đem phân lập khiết vi sinh vật sinh kháng sinh mà ta mong muốn phương pháp đặc trưng môi trường chọn lọc 1.2.1.1- Phương pháp cấy dịch chiết đất đất lên bề mặt thạch Cân xác lượng đất nghiền cối sứ với lượng nước sau cho vào bình lắc khoảng phút, dùng nước vơ trùng pha loãng thành nồng độ cần thiết, nhỏ dịch pha lỗng mơi trường thạch dinh dưỡng gạt nhẹ lên bề mặt cho phân tán Nuôi tủ ấm 28-30°C sau thời gian đến ngày xuất khuẩn lạc mọc riêng rẽ Cấy tách khuẩn lạc lên thạch nghiêng cho khiết sau nghiên cứu hoạt tính kháng sinh cho vsv phân lập 1.2.1.2- Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch chứa sẵn v s v kiểm định Trên hộp petri có mơi trường dinh dưỡng chứa v s v kiểm định đem gieo cấy trực tiếp hạt đất lên bề mặt thạch, để tủ ấm 24 - 48 mang quan sát, xung quanh khuẩn lạc từ đất mọc vịng vơ khuẩn ta biết v s v hạt đất có sinh KS chống lại v s v kiểm định, từ khuẩn lạc ta cấy truyền thạch nghiêng v s v sinh KS để nghiên cứu tiếp Phương pháp cho ta biết v s v đối kháng phân lậpđượccó khả ức chế v s v gây bệnh thuộc loại 1.2.1.3- Phương pháp làm giàu đất Đất trước đem phân lập v s v sinh KS cho vào cơi thuỷ tinh giữ độ ẩm xác định, lại cho thêm v s v kiểm định vào trộn Nuôi tủ ấm sau thời gian đem phân lập theo số phương pháp trên, phương pháp người ta dễ dàng thu v sv đối kháng với vsv kiểm định ban đầu v s v đối kháng đất 1.2.1.4- Phương pháp thêm KS vào môi trường phân lập Xạ khuẩn phát triển chậm vi khuẩn nấm mốc để dễ dàng phân lập xạ khuẩn người ta thêm KS chống nấm kháng khuẩn với nồng độ từ - 25 mcg/ml vào môi trường phân lập Các KS thường dùng tetracyclin, neomycin, nystatin, steptomycin, penicilin, cloramphenicol 1.2.1.5- Phương pháp phân lập v s v sinh KS chống ung thư Hầu hết KS chống ung thư vừa có tác dụng diệt tế bào ung thư lại vừa có tác dụng diệt tế bào vi khuẩn Vì để sàng lọc v s v tạo KS chống ung thư ta dùng vi khuẩn làm test để thử ban đầu vừa đỡ nguy hiểm lại vừa đỡ tốn Nguyên lý phương pháp tóm tắt sau: Trao đổi chất tế bào ung thư khác với tế bào bình thường, khác biệt đặc 54 Do chưa xác định chất kháng sinh thu thuộc nhóm nên phải khảo sát qua độ hấp thụ u v chúng tơi chọn bước sóng 258nm làm bước sóng để phát chất khỏi cột Với hệ dung môi acetonnitril: nước = 10:90 tạo pic chất tan dung môi rõ Kết với hệ dung mơi chạy mẫu mẫu chứa cốc , , , , cho pic chất tan tách hoàn toàn với dung mơi đồng thời khơng có pic lạ khác, (hình P.7) Cịn mẫu chứa cốc 17, 18, 19, 20 ngồi pic dung mơi cịn pic giống phân đoạn pic nhỏ chứng tỏ lượng chất tan Ngồi khơng cịn pic lạ khác, (hình P ) Như phương pháp sắc ký lỏng áp suất cao xác định dịch chạy sắc ký cột chạy từ cốc thứ đến cốc có dung mơi chất tan có hoạt tính kháng sinh 3.5- Bàn luận số kết - Do thời gian có hạn nên thời gian làm luận văn làm sàng lọc cải tạo giống nên sử dụng chủng giống theo chúng tơi chủng tốt để làm nghiên cứu Nhưng việc cải tạo giống vấn đề quan trọng để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh giống phân lập Nó đóng vai trị lớn để kháng sinh có đưa vào sản xuất lưu thơng hay khơng Bởi kháng sinh phát từ chủng sau phân lập được, hoạt lực kháng sinh thấp Sau nhiều lần đột biến cải tạo giống đưa vào sản xuất cơng nghiệp có hiệu kinh tế - Bằng phương pháp qui hoạch đơn hình tìm điều kiện tối ưu với biến thiên đồng thời tác nhân nồng độ KNO , tinh bột K H P kết lên men sinh tổng hợp kháng sinh chủng Micromonospora N°9 tăng lên rõ rệt Đường kính vịng vơ khuẩn chủng vi sinh vật kiểm định tăng so với điền kiện tối ưu cũ khoảng mm Do chưa biết kháng sinh - kháng sinh - khơng có mẫu chuẩn để so sánh Nhưng thơng thường pha lỗng dịch lần đường kính vịng vơ khuẩn giảm khoảng 4mm 55 với tăng kết chứng tỏ với điều kiện tối ưu Micromonospora N°9 cho tăng trưởng sinh tổng hợp kháng sinh cao Tuy nhiên trình thay đổi tác nhân chủ yếu chứa thành phần chủ yếu N, p - K hydratcacbon nguyên tố vi lượng khác môi trường Gauze - Đây môi trường dễ tiêu chuẩn hố thực chưa phải mơi trường hồn hảo Để cho vi sinh vật phát triển cần phải có mơi trường có nguồn dinh dưỡng nguyên tố vi lượng phong phú Kết lên men thiết bị Bioflo 110 dung tích 5,5 lít cho kết không tương đương với lên men máy lắc chứng tỏ thay đổi qui mô đổi cách cấp ôxy cần phải nghiên cứu thông số phù hợp Việc chiết tách kháng sinh thu số kết Bằng sắc ký cột tách chất có hoạt tính kháng sinh chất có hoạt tính kháng sinh mạnh dịch lên men Tuy nhiên cần phải tăng quy mô nghiên cứu có lượng dịch nhiều để nghiên cứu chiết tách hy vọng thu lượng kháng sinh nguyên chất đủ để nghiên cứu số thuộc tính kháng sinh 56 Phán : KỂT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1- Kết luận : Qua thời gian thực nghiệm hoàn thành tốt mục tiêu đặt thu số kết sau : 4.1.1- Bằng phương pháp qui hoạch đơn hình với biến thiên đồng thời tác nhân tìm điều kiện lên men tối ưu chủng Micromonospora N°9, với điều kiện Micromonospora N°9 có khả sinh tổng hợp KS tăng lên rõ rệt So sánh hoạt lực kháng sinh dịch lên men toạ độ tối ưu cũ toạ tối ưu tìm đường kính vịng vô khuẩn tăng khoảng 28% 4.1.2 - Từ điều kiện tối ưu tìm tiến hành lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Micromonospora N°9 thiết bị lên men có sục khí Bioflo 110 dung tích 5,5 lít, bước đầu khảo sát chu kỳ sinh trưởng v sv chu kỳ sinh kháng sinh 4.1.3 - Ngồi cloroform dung mơi chiết tốt kháng sinh từ dịch lên men pH 11 xác định dicloromethan chiết tốt pH 11 áp dụng vào công nghiệp 4.1.4 - Bằng phương pháp SKLM xác đinh có thành phần có hoạt tính kháng sinh dịch chiết dịch lên men Micromonospora N°9 4.1.5 - Dùng phương pháp sắc ký cột chất nhồi cột Sillicagel cỡ hạt 0,lm m chạy hệ dung môi H & Hj thu phân đoạn chứa chất có hoạt tính kháng sinh Các kết SKLM HPLC xác định không bị lẫn vết tạp 57 4.2- Đề x u ấ t : Kết nghiên cứu cho thấy nhiều dấu hiệu khả quan việc tìm kiếm chất kháng sinh từ chủng Micromonospora N°9 phân lập từ chất Việt Nam Cơng trình cần nghiên cứu hướng tăng cường cải tạo giống hoàn thiện qui trình chiết xuất tinh chế nhằm thu lượng tinh khiết cần thiết để xác định cấu trúc, tính chất lý hố đặc trưng tiền lâm sàng KS để có định cho bước nghiên cứu đường tìm KS từ Micromonospora N°9 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1- Bộ mơn hố phân tích trường Đại học dược Hà Nội (2002), ỉlố phân tích tập II, Trung tâm thơng tin - thư viện ĐHD-HN 2- Nguyễn Lâm Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập II, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 3- Nguyễn Lân Dũng, Phan Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, T3 - NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội 4- Kiều Khắc Đơn, Nguyễn Lệ Chi (1999), Giáo trình vi sinh học Hà Nội 5- Nguyễn Thế Đông (1999), Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Micromonospora N°09, cơng trình tốt nghiệp dược sĩ Đại học Hà Nội - Nguyễn Thị Hương (2001), Nghiên cứu cải tạo giống phát triển công nghệ lên men kháng sinh nhờ chủng Micromonospora N°09, cơng trình tốt nghiệp dược sĩ đại học Hà Nội 7- Từ Minh Koóng (1997), Bài giảng sản xuất kháng sinh, Hà Nội - Nguyễn Tiên Phong (2000), Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora N°09, cơng trình tốt nghiệp dược sĩ đại học Hà Nội tốt nghiệp dược sỹ đại học, Hà Nội 9- Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh NXB khoa học kỹ thuật 10- Cao Văn Thu, Chu Thị Lộc, Lương Quốc Tuấn (1993), "Góp phần nghiên cứu số loại Micromonospora sinh tổng hợp kháng sinh từ bùn, bùn cát Việt Nam", Tạp chí dược học (số 5) trang - 11- Cao Văn Thu, Nguyễn Thị Hoa (1999), "Quy hoạch đơn hình lên men sinh tổng hợp kháng sinh", tập chí dược học (số ), trang 12-14 12- Nguyễn Tín Trung (2002), Góp phẩn nghiên cứu kháng sinh từ chủng Micromonospora N°09, cơng trình tốt nghiệp dược sĩ đại học 2002 13- Andre A Neves, Luis M Vieria and Jose C.Menezes (2001), "Effect of Preculture variability on clavulanic acid Fermentation," Biotechnology and Bioengineering, Vol 72, (No ), p.628 - 632 14- Erdely L (1966), Bevezetes a Kémỉai Analizisbe,Tankỡhyv Kiadó, Budapest 15- Johanes A Roubos, Preben Krabben, Wim T.A.M de Laat, Robert Babuska and Joseph J.Heijnen (2002): "Clavulanic acid degradation in Steptomyces clavuligerus Fed - Batch cultivations", Biotechnology Progress, Vol 18, (No 3), p.451-457 16- Laipent J.P., Sanglier J J (1989), Biotechnologie des Antibiotiques, Masson 17- Nelder J.A., Mead R (1965), Computer J Vol , p.308 18- Spendley w Hext G.R, Himsworth F.G, (1962), Technometrics, Vol.4, p 441 19- Szabo Zuzsa (1982) Micromonospora Balatonica Spect Nov.”, MTA, Bio, Oszt, Kozl (25), 227-235 20- Wagman, G.H,and Weinstein, M J (1980), “Antibiotics from Micromonospora” , Ann Rev Microbiol (34), 537-557 09 61 Hình P.1: Thử hoạt lực kháng sinh hai pha nước dicloromethan sau lần chiết 1: Hoạt lực kháng sinh pha dicloromethan 2: Hoạt lực kháng sinh pha nước Hình P.2: Hiện hình vết sắc ký lớp mỏng vi sinh vật cốc 20 sắc ký cột chạy hệ dung mơi Hì 62 Hình P.3: Hiện hình vết sắc ký lớp mỏng vi sinh vật cốc số sắc ký cột chạy hệ dung mơi H., Hình P.4: Kết thử hoạt lực kháng sinh 1: Mầu tối ưu xác định 2: Mấu tối ưu trước 63 Hình P.5 Thiết bị lên men quy mơ phịng thí nghiệm Model Bioplo 110 (New brunswick Scientific) 64 Hình P.6 Máy Lắc sinh học Nhật Taitec Bio-Shaker BR 300LF 65 Hanoi t'ollc'iio o f Pharm acy« I* - M r labor Analysis report S a m p le II): lie liK N Run lime: / :1 : I’M M e llu n le nam e: CACl A S S - Y P 'M e lli o d s liin mot ! ilc nam e: C : \ r L A S S - V T \ I itìhK S006.đal Print lime: /9 /0 8:49:21 A M S a m p le ĨV serip lio n (S a n ip le D escription} I’l)A-22 mil I’k Namo R oioiition T im e Area 98Ị I ~I “> I n f il ls '1015 u Hình P.7 Kết phân tích HPLC mẫu phân đoạn - dịch phản hấp phụ sắc cột i 0 0 66 Hanoi college of Pharmacy GMP labor Analysis report Sample ID: Run tim e: Methode name: File name: Print time: Sample Description LichKS 12/8/03 2:53:58 PM C:\CLASS-VP\Methods\lan 2703.met C:\CLASS-VP\LicliKS007.dat 12/9/03 8:46:34 AM {Sample Description} PDA-262 mil Pk# Name Retention Time 2.080 2.240 2.485 Area Start Time Stop Time Area Percent 447028 19941 6143 1.99 2.20 2.38 2.20 2.38 2.56 94.49 4.21 1.30 I otnls 473112 150 H 100 Hình P.8 Kết phân tích HPLC mẫu phân đoạn 17-20 dịch phản hấp phụ sắc cột 100.00 67 BẢNG P.2: BẢNG XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG THEO SCHOORL Tiêu thụ Na2S20 30,lN ( m l) Maltose C12H22O u (m g ) 5,0 5,5 10,5 16,0 5,5 4,5 21,5 27,5 32,5 38,0 5,5 3,5 5,5 5,5 43,5 49,0 10 55,0 5,5 6,0 5,5 11 60,5 12 66,0 13 72,0 14 78,0 15 83,5 16 89,0 17 95,0 5,5 6,0 6,0 5,5 5,5 6,0 6,0 18 101,0 6,0 19 107,0 20 112,5 21 118,5 22 124,5 6,0 6,0 6,0 6,0 23 130,5 24 136,5 5,0 6,0 25 142,5 Galactose Q H I2o (m g ) 3,3 3,4 7,0 3,4 10,4 3,6 14,0 3,5 17,5 3,6 21,1 3,6 24,7 3,6 28,3 3,7 32,0 3,7 35,7 3,7 39,4 3,7 43,1 3,7 46,8 3,7 50,5 3,8 54,3 3,8 58,1 3,8 61,9 3,8 65,7 3,9 69,6 3,8 73,4 3,8 77,2 4,0 81,2 3,9 85,1 3,9 98,0 4,0 93,0 Mannose C6H i2O ế arabinose CsH10Os (m g ) (m g ) 3,1 3,0 3,2 6,3 3,2 3,7 57,9 3,6 3,9 69,2 3,9 3,9 4,0 3,9 3,9 4,0 3,8 82,4 4,0 57,0 3,9 85,7 3,8 78,0 51,0 81,8 3,7 74,8 77,0 77,9 85,0 3,9 3,9 4,0 3,8 71,0 73,1 74,0 81,0 3,7 3,7 3,9 77,0 3,7 67,3 69,2 70,2 3,8 63,3 3,7 3,6 3,9 73,1 59,8 65,3 66,5 4,5 3,7 62,6 62,9 3,6 56,0 3,6 3,6 60,3 65,3 3,6 3,4 3,7 3,6 52,4 51,2 55,8 62,6 3,5 3,4 3,7 3,6 48,3 50,6 52,4 57,9 3,5 3,4 3,6 3,6 45,2 47,0 49,0 54,2 3,5 3,4 3,6 3,6 41,5 43,5 45,6 50,6 3,5 3,4 3,5 3,6 38,0 40.4 42,2 47,0 3,5 3,4 3,5 3,6 34,4 36,5 38,8 43,5 3,4 3,4 3,5 3,8 30,8 33,0 35,4 40,0 3,4 3,4 3,5 3,5 27,2 29,6 32,0 36,5 3,4 3,4 3,4 3,3 23,7 26,2 28,6 33,0 3,4 3,3 3,4 29,8 20,2 22,8 25,2 3,4 3,3 3,2 3,4 3,5 18,8 19,4 21,2 26,2 3,3 3,2 3,4 3,4 13,3 16,1 18,7 3,4 9,9 3,3 3,2 3,3 22,8 3,2 12,8 15,5 3,3 6,5 9,6 12,3 19,4 89,9 6,3 3,3 3,3 3,2 3,2 3,1 3,3 16,1 C«HnOs ( m g) 3,1 9,2 12,8 Rhamnose 3,0 6,0 9,5 Xylose CsH,oOs (m g ) 3,8 86,2 4,0 89,0 3,8 90,0 68 BẢNG p l: BẢNG XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG THEO SCHOORL Tiêu thụ Na2S2OjO,lN (m l) Glucose C6H120 V 3,2 6,3 J Fructose c 6h 12o (m g ) 3,2 3,1 9,6 12,6 15,9 19,2 22,4 25.5 28,9 3,2 3,3 3,2 3,2 3,3 31,1 33,8 11 35,7 12 39,9 3,4 3,3 3,4 13 42,4 14 45,8 15 49,5 3,4 3,5 3,5 16 52,8 17 60,8 18 60,8 19 60,8 3,5 3,5 3,5 3,5 20 66,9 21 70,7 22 74,5 23 79,6 24 82,6 25 86,6 72,4 3,8 3,8 4,0 4,0 4,0 3,8 4,0 5,0 113,0 3,8 80,9 4,0 89,2 5,0 108,0 77,1 85,2 3,9 91,7 3,7 4,0 3,8 87,8 5,0 103,0 73,3 81,9 5,0 98,0 3,7 3,9 3,9 84,0 93,0 69,6 77,2 5,0 3,6 3,9 3,9 80,1 3,5 66,0 73,3 5,0 88,0 62,3 3,9 3,8 76,2 5,0 83,0 3,6 3,7 69,4 5,0 78,0 58,7 65,5 3,7 73,0 3,5 3,8 3,7 5,0 3,4 55,4 61,8 68,7 3,3 3,7 3,8 5,0 68,0 51,6 58,0 65,0 3,3 3,5 3,7 5,0 63,0 48,2 54,8 61,2 58,0 44,0 3,5 3,8 5,0 3,3 41,6 50,8 57,5 3,3 3,5 3,7 5,0 53,0 38,8 47.3 53,7 3,3 3,5 3,8 5,0 48,0 35,0 43,8 50,0 43,0 31,7 40,3 5,0 3,3 3,5 3,8 46,2 3,2 3,4 3,7 42,4 5,0 38,0 28,4 36,8 4,8 33,0 3,2 3,5 3,8 38,7 3,2 3,4 33,4 4,8 28,1 25,2 29,9 34,9 3,2 3,3 3,8 4,7 23,3 22,0 26,5 3,7 3,4 3,2 3,4 3,7 4,7 8,6 18,8 23,2 27,4 3,1 3,4 3,7 4,7 13,9 15,6 19,8 23,7 3,1 3,4 3,6 4,6 9,2 12,4 16,4 20,0 (m g ) 3,1 3,3 3,4 3,3 4,6 9,3 13,0 16,4 3,1 3,3 3,3 3,3 Lactose c 12h 22o ] H2o 6,2 9,7 13,0 Sacarose C12H22On (m g ) 3,2 6,4 9,7 3,2 10 ( m g) 3,2 6,4 3,1 G lucose/ Fructose = 1/1 5,0 118,0 3,8 84,7 5,0 123,0 ... thống lọc khí n? ?n phức tạp dễ gây ô nhiễm cho môi trường nuôi cấy L? ?n men chìm chia thành l? ?n men gi? ?n đo? ?n, l? ?n men có bổ sung, l? ?n men li? ?n tục l? ?n men b? ?n li? ?n tục 1.4.2.1- L? ?n men gi? ?n đo? ?n: ... Tr? ?n sở kết nghi? ?n cứu tơi lựa ch? ?n đề tài với tựa đề "Tối ưu hoá l? ?n men sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng Micromonospora N? ?9" với mục tiêu sau: - Ti? ?n hành l? ?n men sinh tổng hợp KS qui mơ phịng... mặt có hoạt tính kháng sinh tốt L? ?n men chìm thử hoạt tính có kháng sinh mạnh Kháng sinh Micromonospora N? ?9 sinh trình l? ?n men có hoạt lực mạnh có khả diệt nhiều chủng vi khu? ?n gây bệnh gram (-),