Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc aspergillus oryzae

TÓM LƯỢC Đề tài thực hiện nghiên cứu “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae” sử dụng kết quả nghiên cứu của Chiêm Thị B

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

TS Lý Nguyễn Bình Phạm Hoàng Thái

MSSV: 2071771

Cần Thơ, 2011

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận tình dạy

dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu suốt bốn năm đại học

Xin gửi lòng biết ơn đến Thầy Lý Nguyễn Bình và Chị Lâm Mộng Thúy đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành bài luận văn này

Chân thành cảm ơn sự đoàn kết và hỗ trợ của các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm khoá 33 trong suốt bốn năm học và trong quá trình thực hiện luận văn

Cảm ơn Thầy Cô và các bạn đã quan tâm, đóng góp ý kiến để bài luận văn hoàn chỉnh hơn

Chân thành cảm ơn! Phạm Hoàng Thái

TÓM LƯỢC

Đề tài thực hiện nghiên cứu “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus oryzae” sử dụng kết quả nghiên cứu của Chiêm Thị Bích Vân (2008) về các điều kiện tối ưu để tổng hợp enzyme amylase có hoạt tính cao

- Nhiệt độ: 30 o C

- pH: 5,0

- Độ ẩm môi trường: 55%

- Thời gian nuôi: 50 giờ

Đề tài tiếp tục khảo sát thêm yếu tố nguồn dinh dưỡng và hàm lựợng bổ sung như nguồn carbon: glucose, fructose, lactose; nguồn nitơ: NaNO 3 , NH 4 NO 3 , NH 4 H 2 PO 4 ; nguồn khoáng: KCl, CaCl 2 , MgSO 4 7H 2 O; Hàm lượng kết hợp các nguồn NH 4 NO 3 và CaCl 2 thích hợp nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ Aspergillus oryzae Quá trình nghiên cứu cho thấy khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase tăng lên khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy Cụ thể như sau:

- Nguồn carbon từ lactose với hàm lượng 5%

- Nguồn nitơ vô cơ từ NH 4 NO 3 với hàm lượng 0,3%

- Nguồn khoáng CaCl 2 0,3% hoặc MgSO 4 0,1%

- Hàm lượng kết hợp 0,5% NH 4 NO 3 và 0,3% CaCl 2 là thích hợp

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH HÌNH v

DANH SÁCH BẢNG vi

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Hệ enzyme amylase 3

2.1.1 Amylase có trong canh trường nấm mốc Aspergillus 3

2.1.2 Hoạt độ enzyme amylase 6

2.2 Nấm mốc Aspergillus oryzae 8

2.2.1 Đặc điểm chung 8

2.2.2 Nguồn nấm mốc và điều kiện sinh trưởng, phát triển 8

2.3 Sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc 9

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 10

2.3.2 Môi trường nuôi cấy cám gạo và trấu 11

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 12

2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 12

2.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 13

2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng 14

2.4.4 Ảnh hưởng của pH nguyên liệu 14

2.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy 15

2.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ 15

2.4.7 Thời gian nuôi cấy 15

2.5 Ứng dụng chế phẩm enzyme amylase 15

2.5.1 Một số chế phẩm enzyme thương mại 15

2.5.2 Enzyme amylase trong công nghiệp thực phẩm 16

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 18

3.1 Phương tiện thí nghiệm 18

3.1.1 Địa điểm và thời gian 18

3.1.2 Nguyên liệu 18

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 18

3.1.4 Hóa chất và môi trường 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Phương pháp thí nghiệm 19

3.2.2 Phương pháp phân tích 19

3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm 19

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon (đường) bổ sung riêng lẻ đến

hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae 19

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae 21

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn khoáng bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae 22

3.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung kết hợp nguồn nitơ và khoáng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase 24

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 27

4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon (đường) bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp oryzae 27

4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bởi Asp.oryzae 28

4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng bổ sung riêng lẻ đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bời Asp.oryzae 29

4.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ và khoáng bổ sung kết hợp đến hoạt tính enzyme amylase được tổng hợp bời Asp.oryzae 31

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤC LỤC A PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH vii

PHỤ LỤC B CÁC KẾT QUẢ THỐNG KÊ ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Nấm mốc Apsergillus 9

Hinh 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 20

Hình 3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 22

Hình 4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 23

Hình 5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 25

Hình 6 Một số mẫu nấm mốc nuôi cấy trong các thí nghiệm 26

Hình 7 Dịch trích enzyme thô 32

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Các chủng nấm mốc Aspergillus có sinh enzyme amylase 9

Bảng 2 Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của Asp oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt 10

Bảng 3 Thành phần hóa học trung bình của cám 11

Bảng 4 Sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc phụ thuộc vào các chất cảm ứng 12

Bảng 5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp các enzyme amylase 14

Bảng 6 Các chế phẩm α-amylase vi sinh vật dùng trong sản xuất bia 16

Bảng 7 Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 4 24

Bảng 8 Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn carbon bổ sung 27

Bảng 9 Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn nitơ bổ sung 28

Bảng 10 Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn khoáng bổ sung 30 Bảng 11 Hoạt tính enzyme amylase theo nguồn nitơ và khoáng bổ sung kết hợp 31

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương là một loài nấm sợi có

tên khoa học là Aspergillus oryzae Đây cũng chính là loài mà người Nhật dùng để

đường hóa gạo khi làm rượu Sake Những nghiên cứu sớm nhất về loài nấm này do

một nhà khoa học Nhật Bản tên là Jokichi Takamine vào năm 1894 Chính vì thế

enzyme từ Aspergillus oryzae tên là taka-diastatic

Thời đó để đường hóa tinh bột lúa mì và ngô ở phương Tây người ta dùng mầm đại

mạch (malt) Hoạt tính taka-diastatic cao hơn nhiều so với trong mầm đại mạch Hoạt

tính taka-diastatic làm cho quá trình đường hóa rút ngắn lại và giá thành rẻ hơn rõ rệt Các nghiên cứu vào đầu những năm 1940 đã xác định sự có mặt của glucoamylase

(hay taka-diastatic) trong các chủng Aspergillus

Ngày nay, nấm sợi Aspergillus oryzae đã được chọn lọc để có các chủng sinh amylase

có hoạt tính cao Bộ gen di truyền của Aspergillus oryzae đã được phân tích và biết

vào năm 2001 Ngoài amylase nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất nhiều loại enzyme khác nhau, lipase, hemicellulase, cellulase, oxydoreductase, phytase, pectinesterase…

Trong lĩnh vực thực phẩm amylase từ nấm mốc Asp.oryzae được sử dụng rộng rãi để

đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu bia, bánh mì, xirô,…Các enzyme có độ tinh sạch cao, tính chất phù hợp có triển vọng trong công nghiệp dược phẩm và hóa chất tinh khiết

Cho tới nay đã có nhiều nghiên cứu enzyme amylase từ Aspergillus oryzae được công

bố nhưng vẫn tồn tại nhiều vấn đề chưa thỏa mãn Một trong những động lực thúc đẩy

sự phát triển của ngành công nghiệp enzyme nói chung là kiến thức có được từ nghiên cứu các vấn đề: Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme, cơ chế điều hòa sinh tổng hợp enzyme và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp để thu được enzyme

có hoạt tính cao

1.2 Mục đích nghiên cứu

Ứng dụng kết quả từ những nghiên cứu trước về các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến khả

năng sinh tổng hợp enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae và củng cố, bổ

sung thêm những hiểu biết về ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng trong canh trường nuôi cấy nấm mốc Cụ thể như sau:

- Xác định nguồn carbon bổ sung và hàm lượng thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme amylase

- Xác định nguồn nitơ vô cơ và hàm lượng thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme amylase

- Xác định nguồn muối khoáng và hàm lượng thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme amylase

- Xác định được hàm lượng bổ sung kết hợp các nguồn nitơ vô cơ và nguồn khoáng (xác định ở trên) cho việc sinh tổng hợp enzyme amylase

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Amylase là một trong những hệ enzyme quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện nay do có những ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm và công nghệ lên men

Enzyme amylase có nhiều trong dịch tiêu hóa động vật, hạt nảy mầm thực vật và canh trường vi sinh vật: vi khuẩn, nấm mốc, nấm men Ngày nay, do ưu thế về nhiều mặt vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme chủ yếu

Để thu enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus và một số loài của Mucor, Neurospora

2.1 Hệ enzyme amylase

Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân có sự tham gia của nước (hydrolase), xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside trong mạch polysaccharide của tinh bột và glycogen Enzyme amylase chia làm hai nhóm, α-1,4-glucanase và α-1,6- glucanase trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase, dextrinase, maltase, pullulanase…là những enzyme phổ biến

2.1.1 Amylase có trong canh trường nấm mốc Aspergillus

2.1.1.1 α-Amylase (EC 3.2.1.1)

α-Amylase có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 glycoside trong mạch amylose và amylopectin α-Amylase phân cắt bên trong mạch polysaccharide một cách ngẫu nhiên, không theo thứ tự nào nên gọi là endoenzyme Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, tinh bột có thể chuyển hóa dần thành dextrin phân tử thấp, maltotetrose, maltose và glucose, làm giảm nhanh độ nhớt dung dịch hồ tinh bột, có tác dụng dịch hóa

Một số đặc điểm hóa học và hóa lý của enzyme α-amylase

- Trung tâm hoạt động chứa nhóm – COOH và NH3

- Dễ tan trong nước, dung dịch muối và cồn loãng

- Protein của amylase có tính acid yếu và tính chất của globulin Điểm đẳng điện trong khoảng pH 4,2 - 4,7

- Phân tử lượng 45 – 50 kDa

- Là một metaloenzyme, chứa từ 6-30 nguyên tử gram Calci/mole Calci đảm bảo tính xúc tác enzyme α-amylase, làm bền trước tác nhân gây biến tính như nhiệt độ, pH và

sự phân giải protease

- Bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng Cu2+, Hg2+, Fe3+

α-Amylase của Asp.oryzae có phần phi protein là polysaccharide gồm 8 mole maltose,

1 mole glucose, 1 mole hexoamine trên 1 mole enzyme (Akabori, 1965)1 α-Amylase

từ nấm mốc vừa có khả năng dextin hóa vừa có khả năng đường hóa lớn tạo ra

maltose và glucose Khả năng dextrin hóa của chế phẩm α-amylase từ Asp.oryzae cao

hơn khả năng đường hóa 1,75 lần (Lifsitx và Baznitsenko, 1967)1 Tỉ lệ đường glucose: maltose = 1: 3,79 cho α-amylase nấm sợi và 1: 5 cho vi khuẩn (Hanrahan và Caldwell, 1953)1 Khi dùng nồng độ α-amylase nấm mốc tương đối lớn có thể đường hóa đến glucose và maltose đạt 84 - 87% tinh bột Vận tốc thủy phân của α-amylase từ

Asp.oryzae ở giai đoạn đầu thấp hơn amylase từ vi khuẩn 25%

pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm enzyme

α-amylase từ Asp.oryzae khoảng 6,0 - 6,2

α-Amylase của nấm sợi Asp.oryzae bền acid hơn α-amylase của malt và vi khuẩn Bac subtillis Ở pH 3,6 và nhiệt độ 0oC hoạt lực α-amylase của nấm sợi hầu như không giảm, amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút, α-amylase của vi khuẩn

bị vô hoạt 50% (Fenilxova và Rmoshinoi, 1989)1

Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH 5-5,5, α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen chịu được pH từ 2,5-2,8 Ở nhiệt độ 0oC và pH 2,5 nó chỉ bị vô hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

α-Amylase của nấm sợi rất nhạy đối với tác động của nhiệt Nhiệt độ tối thích ở 50oC

và bị mất hoạt lực ở 70oC (Kozima, 1991)1 và gần như vô hoạt ở 75oC

Trong dung dịch đệm pH 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với nhiệt độ cao Ở

nhiệt độ 40oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85% Còn ở nhiệt độ 50oC trong 2 giờ α-amylase của nấm này bị

vô hoạt hoàn toàn (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004)

2.1.1.2 Glucoamylase (EC 3.2.1.3)

Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glycoside tách lần lượt các gốc glucose từ đầu không khử trong phân tử amylose và thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glycoside trong phân tử amylopectin, glycogen Do đó, glucoamylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) Phần lớn sản phẩm thủy phân bởi glucoamylase chứa glucose

Glucoamylase được tách ra lần đầu tiên từ Asp awamori (Katihara, Kurushima,

1966)1 Sau đó nó được tìm thấy trong Rhizopus delemar, Asp.niger, Asp.oryzae và

mô động vật Glucoamylase còn có tên gọi khác là: γ-amylase, amyloglucosidase, taka- amylase Bac, matulase…

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Glucoamylase thủy phân cơ chất có cấu tạo phân nhánh, phân tử lớn với vận tốc nhanh hơn các cơ chất không phân nhánh và phân tử thấp

Theo khả năng thủy phân tinh bột, glucoamylase được chia thành hai kiểu: kiểu

Rhizopus delemar và kiểu Asp niger Glucoamylase của Asp.oryzae thuộc kiểu Asp niger

Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzyme như sau

còn thay đổi theo nhiệt độ và thời gian tác dụng Glucoamylse của Rh.delemar có

hiệu lực cao nhất 4,7 - 5,0 và nhiệt độ 55 - 60oC, nhưng khi hạ nhiệt độ 40oC thì pH

tối thích là 4,5 Chế phẩm glucoamylase từ Endomycopsis có pH tối thích 5,4 - 5,6 với

thời gian tác dụng 30 phút Nếu tăng thời gian tác dụng lên thì pH mở rộng 4,7 - 5,6 (Azepoba, 1971)1

Theo khả năng bền acid, glucoamylse được chia thành hai loại: Glucoamylse acid và glucoamylase trung tính Nếu nấm sợi sinh trưởng trong môi trường acid hơn thì sinh

ra glucoamylase acid nhiều hơn và trong môi trường gần trung tính hơn thì glucoamylase trung tính nhiều hơn Nhiệt độ hoạt động tối thích của loại bền acid là

50oC (Barker và Fleetwood, 1957)1, của loại trung tính thấp hơn 50oC

Phân từ lượng glucoamylase từ 33 – 97 kDa

Glucoamylase bị kìm hãm bởi sufuahydryl do chúng liên kết với nhóm –SH trong trung tâm hoạt động của enzyme

2.1.1.3 Dextrinase (EC 3.2.1.10)

Enzyme dextrinase thủy phân các liên kết α-1,6 glucoside trong isomaltose, panose,

dextrin giới hạn và tạo sản phẩm là các đường lên men được Các loài nấm sợi Asp awamori, Asp.oryzae, Asp.usamii sinh tổng hợp enzyme này mạnh hơn cả

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

(Karpukhina và Xoxfenov, 1977; Pankratov và Kirxanov, 1969; Rukhlideva và Goriatreva, 1967)1 Các dextrinase hoạt động tối thích ở nhiệt độ 40oC và pH 5,1

2.1.1.4 Maltase (EC 3.2.1.20) Nhiều nấm sợi sinh enzyme này, nó có khả năng thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân được tinh bột Khi nghiên cứu tính chất của maltase tách từ canh trường bề mặt nấm mốc Asp.oryzae, các nhà nghiên

cứu Nhật cho biết rằng maltase và glucozyltransferase là một enzyme, vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong các glucopyranose vừa có khả năng chuyển các gốc glucosise sang đường và rượu

2.1.1.5 Transglucosyldase (EC 2.4.1.3)

Enzyme transglucosyldase có hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân Transglucosyldase thực hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang các nhóm mono, di và oligosaccharide, xúc tác tạo thành các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside Rodzevit và Butova (1965)1 tìm thấy trong canh trường nấm sợi Asp.niger, Asp.oryzae và Asp awamori có glucosyltransferase, đồng thời cho biết rằng enzyme này xúc tác sự tổng

hợp các oligosaccharide từ các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ maltose Sự có mặt của transglucosyldase trong các chế phẩm amylase là không mong muốn Glucoamylse xúc tiến thủy phân tinh bột , còn transglucosyldase lại tổng hợp các isosaccharide từ các sản phẩm thủy phân này, làm giảm mức độ thủy phân sâu sắc tinh bột, làm dịch thủy phân có vi đắng Transglucosyldase của nấm sợi bị vô hoạt hoàn toàn ở pH 1,9 - 2,0 sau 24 giờ

2.1.2 Hoạt độ enzyme amylase

Trong enzyme học, người ta không định lượng enzyme một cách trực tiếp mà xác định gián tiếp thông qua mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme Bởi vì, khi có mặt của enzyme thì sự hoạt động của nó được biểu hiện ra ở chỗ nó làm thay đổi các tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của hỗn hợp phản ứng Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzyme thông qua xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng (Lê Ngọc

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Đo mật độ quang của dung dịch khi thực hiện phản ứng màu với iod Khi có amylase thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau với iod

Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất

Hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau

Hoạt độ của enzyme α- amylase theo Rukhliadeva1 dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu quang phổ sẽ tính được hoạt độ của enzyme Đơn vị hoạt độ của α- amylase là lượng enzyme chuyển hóa được một gam tinh bột tan thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30oC trong một giờ ở pH 4,7 (α- amylase từ nấm mốc) Hoạt độ glucoamylase đặc trưng cho khả năng chế phẩm thủy phân tinh bột đến glucose Muốn xác định được cần đo được lượng glucose tạo thành Đơn vị hoạt độ của glucoamylase là lượng chế phẩm enzyme khi tác dụng lên tinh bột ở 30oC và pH tối thích trong 1 giờ tạo ra 1mg glucose (xác định bằng phương pháp Zikhetar- Bleyer) hay cũng trong những điều kiện nhiệt độ và pH tương tự làm giải phóng được

1 micromol glucose (xác định bằng phương pháp glucooxydase)

Hoạt độ đường hóa phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột đến các đường khử Đơn vị hoạt độ đường hóa là lượng chế phẩm enzyme trong 1 giờ

ở nhiệt độ 30oC và pH thích hợp làm phân giải được 1 gam tinh bột thành đường khử khi mức độ thủy phân cơ chất không vượt 30%

Hoạt độ maltose đặc trưng cho khả năng thủy phân maltose tới glucose của chế phẩm enzyme Đơn vị hoạt độ maltose là lượng chế phẩm enzyme phân giải được 1 gam maltose tới glucose trong vòng 1 giờ ở 30oC, độ thủy phân maltose trong phản ứng này không vượt quá 30% (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004)

Đơn vị hoạt độ

Đơn vị enzyme quốc tế (UI) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được micromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 UI = 1µmol cơ chất (10-6) mol/phút

Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1 Kat = 1mol/ giây

1 UI = 10-6/60 Kat 16.67 nKat (nano Katal)

1

Được trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng (2004)

Hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hoặc số đơn vị Katal ứng với 1 mililite dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc là 1 miligram protein ( nếu là bột khô của chế phẩm) Ví dụ một dung dịch enzyme chứa 10 UI (hoặc 166.7 nKatal) trong một

ml ( hoặc mg protein) Nếu chế phẩm enzyme đã tinh sạch, hoat độ được biểu thị bằng

số UI hoặc Katal trên một mg protein Khi đã biết khối lượng phân tử của enzyme thì

có thể tính hoạt độ riêng phân tử

Hoạt độ riêng phân tử là số phân tử cơ chất chuyển hóa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian

Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý những điểm sau:

Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở một giới hạn thích hợp vừa đủ để bão hòa enzyme nhưng không quá cao đến mức kìm hãm enzyme Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào enzyme trước khi cho

cơ chất vào hỗn hợp phản ứng Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định Nhưng cần chú ý là pH có thể thay đổi khá nhiều tùy thuộc vào cơ chất và thành phần dung dịch đệm, lực ion của dung dịch đệm (thường trong phạm vi từ 0,01-0,1) Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ cần phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để phòng tác dụng kìm hãm enzyme ở nhiệt độ cao

Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5-30 phút Trong một số trường hợp có thể kéo dài 24 giờ nếu hoạt độ enzyme quá thấp Trong trường hợp đó có thể thêm các chất tiêu diệt vi sinh vật vào dung dịch và tránh dùng dung dịch đệm thuận lợi cho sự phát

triển vi sinh vật (Lê Thanh Mai và cộng sự, 2009)

có vô vàn những mầm nhỏ gọi là thể bình mọc ra khắp mọi hướng, ở phần cuối các

mầm này là các bào tử đính Cơ sở phân loài nấm mốc thuộc giống Asperillus là đặc điểm cấu tạo, màu sắc của cuốn bào tử đính Asp.oryzae có bào tử màu vàng hoa cau

(Lê Xuân Phương, 2001)

2.2.2 Nguồn nấm mốc và điều kiện sinh trưởng, phát triển

Asp oryzae sinh ra nhiều enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease,

pectinase,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa bột, gạo đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu,… chúng mọc và phát

triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng,… do các bào tử già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị cuốn theo gió (Nguyễn Đức Lượng, 2001)

Trong tự nhiên, Aspergillus oryzae có trong không khí, có thể có trên vỏ trái cam sành Tam Bình (Đỗ Thị Tuyết Nhung, 2005) Trong thực tế Asp oryzae được phân lập từ

đất bởi Nguyễn Văn Phùng, từ giày da bởi Đặng Hồng Nhiên, từ thóc gạo, lạc nhân bởi Bùi Xuân Đồng (2004)

Nấm mốc Asp oryzae sinh trưởng ở điều kiện độ ẩm 45 55%, pH môi trường 4,5

-6,5 độ ẩm không khí 85-95%, nhiệt độ nuôi 27 - 30oC

Hình 1 Nấm mốc Aspergillus

(Nguồn: http://www.emlab.com/m/media/Aspergillus.jpg)

2.3 Sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc

Nấm mốc Aspergillus được coi là những vi sinh vật sung mãn trong sản xuất các

enzyme ngoại bào Hiệu xuất sinh tổng hợp có thể tăng lên nhờ thay đổi điều kiện

nuôi và thành phần dinh dưỡng của môi trường (Hoàng Kim Anh và cộng sự, 2005)

Bảng 1 Các chủng nấm mốc Aspergillus có sinh enzyme amylase

Aspergillus sp -amylase Glucoamylase

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Theo phương pháp này giống vi sinh vật hiếu khí sau khi cấy sẽ phát triển trên bề mặt

và dần dần lan xuống phía dưới theo các kẽ hở giữa các cấu tử thành phần môi trường

và giữ ở nhiệt độ thích hợp Thời gian của quá trình này ngắn và sản phẩm thu được ít lẫn các sản phẩm chuyển hóa trung gian và do đó dễ chiết tách và tinh chế Nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme thường dùng môi trường rắn,

là các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh, đậu tương…

Độ ẩm môi trường rắn khoảng 60% thích hợp cho nấm mốc nôi cấy bề mặt trên khay

hở Nếu độ ẩm trên 60% vi khuẩn dễ phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí, còn nếu thấp hơn 50% thì môi trường khô nhanh, sinh bào tử mạnh và giảm hoạt tính enzyme, muốn vậy độ ẩm phòng nuôi phải từ 90 - 100% (Nguyễn Đức Lượng và cộng

sự, 2004)

Bảng 2 Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo amylase của

Asp oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt

Phương án thí

%

Hoạt độ amylase *

Độ ẩm

%

Hoạt độ amylase *

Độ ẩm

%

Hoạt độ amylase *

(Nguồn:Nguyễn Đức Lượng và cộng sự , 2004)

Ghi chú: (*) đv/g canh trường khô

Môi trường được rải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với bề dày khoảng 2 - 2,5

cm và để nguội khoảng 30oC mới tiến hành cấy giống Nhiệt độ thích hợp với đa số nấm mốc khoảng 30 - 32oC Nếu nhiệt độ thấp hơn 24oC nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi kéo dài dẫn đến giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme

Việc tạo thành α- amylase ở nấm mốc Asp oryzae không bị kìm hãm ở nhiệt độ

40 - 45oC trong khoảng từ 10 -12 giờ Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 30 - 36

giờ Nấm mốc Asp.oryzae và Asp.awamori trên môi trường cám để sản xuất amylase khoảng 36 - 40 giờ Nhiều chủng Asperillus sinh enzyme cao nhất lúc mới tạo bào tử

nhưng cũng có trường hợp vào lúc đã sinh nhiều bào tử

Quá trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi trường rắn chia làm 3 thời kỳ

Khoảng 10 - 14 giờ đầu, bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm, thời kỳ này chưa hình thành enzyme Giống rất nhạy cảm với nhiệt độ, ở những giờ này thể tích buồng nuôi cần giữ 29 - 31oC

14-18 giờ tiếp theo, mốc phát triển nhanh hô hấp mạnh Sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng, xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết bánh lại Các chất dinh dưỡng tiêu hao nhanh để phục vụ cho quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 - 90 Kcal/giờ, làm nhiệt độ môi trường có thể tăng lên từ 37 - 40oC hoặc hơn nữa Nhiệt độ

ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 29oC và độ ẩm trong phòng khoảng 100%

Thời kỳ thứ ba kéo dài trong khoảng từ 10 - 20 giờ Thời gian này các quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần, lượng nhiệt tạo ra giảm và việc tạo thành enzyme vẫn tiếp tục giữ nhiệt độ buồng nuôi khoảng 30oC

Tùy thuộc đặc tính sinh lý của từng nấm mốc, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại thời điểm mà lượng enzyme được tạo thành tối đa

Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô xuống độ ẩm 12%, nghiền nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm Sản phẩm này là chế phẩm enzyme thô, tiếng Nhật gọi “Koji” có nghĩa là “hoa mốc” có thể dùng trực tiếp đường hóa trong công nghiệp rượu bia…hoặc được dung làm nguyên liệu để chiết tách ra những chế phẩm enzyme tinh khiết

Trong nước chiết các môi trường rắn sau khi nuôi cấy nấm mốc thường chứa một lượng lớn các phân tử thấp Phần lớn các enzyme dễ hòa tan trong nước, cho nên rất

dễ tách chúng từ những tế bào gốc đã trưởng thành, những tế bào này hầu như đã ngừng quá trình trao đổi chất, độ thẫm thấu của hệ sợi tăng, enzyme dễ tiết ra môi trường và dễ hòa tan vào nước

2.3.2 Môi trường nuôi cấy cám gạo và trấu

Trong các nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên, cám gạo được sử dụng nhiều trong nuôi cấy vi sinh vật, thích hợp nhất là nấm sợi vì trong cám chứa đầy đủ các hợp chất cần thiết cho sự phát triển (bảng 2)

Bảng 3 Thành phần hóa học trung bình của cám

Vitamin B1 0,96 mg/100g

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Trong thành phần của cám chứa nhiều tinh bột, khi thanh trùng, tinh bột bị hồ hóa và trở nên kết dính, ngăn cản sự chuyển vận oxy có trong khối môi trường Nhằm làm tăng độ xốp, trấu thường được cho vào với lượng khoảng 20 - 25% Trấu tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường Vi sinh vật phát triển ở giữa pha rắn và pha khí của môi trường Trong trường hợp này vi sinh vật

có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình nuôi cấy bề mặt

2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme cảm ứng

Quá trình sinh tổng hợp được gọi là cảm ứng, nếu như nó xảy ra ở mức độ đáng kể khi môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hoặc các chất trao đổi có cấu trúc tương tự cơ chất Các enzyme thuộc loại này gọi là enzyme cảm ứng Các cơ chất kích thích quá trình tổng hợp này được gọi là các chất cảm ứng

Như vậy, có chất cảm ứng trong môi trường nuôi cấy là điều kiện hết sức cần thiết để thu được những enzyme mong muốn Trong công nghiệp sản xuất enzyme cần phải lựa chọn những chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu quả sinh tổng hợp cao nhất

2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Tinh bột là chất cảm ứng tốt đối với enzyme α-amylase Song nấm mốc Asp.oryzae có

thể sinh ra enzyme này khi có mặt trong môi trường các chất cảm ứng khác như maltose, isomaltose và panose Như vậy, chất cảm ứng của enzyme α-amylase ở

Asp.oryzae là những hợp chất có nối α-1,4 glycoside cũng như các olidosaccharide có mối liên kết α-1,6 (Tonomurs et al., 1961)1

Bảng 4 Sinh tổng hợp enzyme của nấm mốc phụ thuộc vào các chất cảm ứng

enzyme (%)

Asp.oryzae α-amylase Tinh bột

Maltose Maltose

100

125

100

2

Được trích dẫn bởi Lương Đức Phẩm (1998)

2

Asp.niger pectinase Pectin và lactose 250

(Nguồn: Lương Đức Phẩm, 1998)

Nấm mốc có thể đồng hóa được 75 hợp chất không chứa nitơ như carbonhydrate, rượu

đa nguyên tử và nhiều acid hữu cơ Carbonhydrate như saccharose, fructose, glucose

có trong môi trường làm cho nấm mốc phát triển mạnh, nhưng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme thấp Nấm mốc đồng hóa kém glalactose nhưng đối với lactose giống phát triển yếu nhưng hoạt lực α-amylase lại cao

Hiệu suất sinh tổng hợp amylase trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau với các nguồn carbon được thể hiện như sau:

- Đối với α-amylase: Tinh bột > dextrin > maltose > glucose > saccharose > galactose

2.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase người ta dùng muối vô cơ NaNO3 là nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi sinh amylase Hàm lượng thường sử dụng là 0,91% NaNO3 và NH4NO3 có hiệu quả hơn các loại muối khác (KNO3, Mg(NO3)2, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4) khi nuôi Aspergillus oryzae-3-9-15 trên môi trường bột ngô (Fenikxova và Dvatxatova, 1960)1 chủng này tạo α-amylase hoạt động khi có mặt (NH4)2HPO4 và NH4NO3 ngoài ra còn có các

chủng của nấm sợi Asp.oryzae 153 lại tổng hợp mạnh mẽ amylase khi có (NH4)2SO4 Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích sinh tổng hợp amylse này

và ức chế tổng hợp amylse khác Theo mức độ tiêu thụ muối môi trường bị acid hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp glucoamylse và ức chế tổng hợp α-amylase Fenikxova1 và cộng tác viên đã tiến hành thí nghiệm với NH4H2PO4 và thấy rằng sinh tổng hợp α-amylase giảm di 10 lần mà sự tạo thành glucoamylase hầu như không ảnh hưởng

Bảng 5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp các enzyme amylase

Hoạt độ enzyme sau 6 ngày nuôi U/100 ml Nguồn nitơ Liều lượng muối,

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp enzyme amylase chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzyme cực lớn sự thiếu hụt của cấu tử này không thể bù đắp được

sự dư thừa cấu tử kia Hàm lượng carbon trong môi trường 10 - 40 lần hàm lượng nitơ

2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng

Các nguyên tố đa vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzyme amylase của

vi sinh vật Mg2+ ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme Thiếu MgSO4 ức chế hoàn toàn sự tổng hợp α-amylase còn hàm lượng glucoamylase giảm xuống hang chục lần (Fenikxova và Muxaeva, 1967)1 Nồng độ tối ưu của muối này trong tổng hợp α-amylase và glucoamylase là 0,05% Thiếu muối này không ảnh hưởng mấy đến sự tạo thành oligo-1,6-glucosidase (Silova, 1967)1

Phosphor cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất và coenzyme (andenosinephosphate, thiamine) Phosphor ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm sợi, tăng cường sinh tổng hợp enzyme amylase Các muối phosphate thường dùng với nồng độ cao tới 1,5 M Hoạt độ α-amylase và oligo-1,6- glucosidase tăng cao khi có 0,1% KH2PO4, còn hoạt độ glucoamylase tăng cực lớn khi có 0,2% muối này

Ca2+ cần cho sự ổn định hoạt động bảo vệ α-amylase khỏi tác dụng của protease, muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca2+ trong môi trường là 0,01-0,05% (Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, 2004)

2.4.4 Ảnh hưởng của pH nguyên liệu

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường

có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển

của nấm mốc và sự tạo enzyme pH thích hợp cho Asp oryzae là môi trường acid yếu

khoảng 4,5 - 6,5 Trong nuôi cấy bề mặt môi trường đặc rất khó tạo sự đồng đều về

pH, việc ổn định pH trong suốt quá trình phát triển của nấm sợi lại càng khó khăn hơn.Tuy nhiên, môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nếu thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường

2.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường là 55 - 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó trong quá trình nuôi Độ ẩm mà tăng quá 60 - 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 - 55% thì kìm hãm sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo amylase

2.4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành emzyme là 28 - 32oC Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể nóng lên 40oC hoặc hơn Do vậy, cần giữ cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27oC và không cao hơn 36oC Toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc cám có thể chia thành hai thời kỳ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử trong 11 giờ đầu Trong thời kỳ này cần phải cung cấp nhiệt độ cho phòng nuôi không hơn 23 -

30oC Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (có thể đạt từ 4 - 18 giờ)

2.4.7 Thời gian nuôi cấy

Hầu hết các chủng nấm mốc Asp oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng

giờ thứ 30 – 38, rồi sau đó là cực đại của protease ở giờ thứ 36 - 42 Một số chủng có hai cực đại của enzyme, ví dụ: cực đại của enzyme amylase ở giờ thứ 36 và giờ thứ

60 Do đó, thời gian nuôi mốc có thể kéo dài từ 60 - 72 giờ Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm Sự tạo bào tử là hiện

tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzyme Đối với Asp oryzae, sự tạo hoạt lực tối đa thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử

Chế phẩm enzyme này có nhiệt độ tối ưu khoảng 60-65oC Sản phẩm nhận được sau khi thủy phân chứa nhiều maltose Enzyme có thể chịu được pH xuống tới 4,5 và không bị ảnh hưởng gì nếu thêm ion Ca2+

2.5.1.4 Ban 240L

Chế phẩm chứa chủ yếu enzyme α-amylase thường được sử dụng dịnh hóa tinh bột thành dextrin ở nhiệt độ 90oC

2.5.1.5 Super 240L

Là chế phẩm enzyme được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus chứa glucoamylase,

α-amylase và protease Chế phẩm ở dạng lỏng màu nâu, d = 1,25 g/ml, hoạt tính 240 AGU/ml

Bảng 6 Các chế phẩm α-amylase vi sinh vật dùng trong sản xuất bia

B.amyloliquefaciens Dextrin hòa tan

Oligosaccharide 60 - 80 5 - 7 250 - 500

Tăng khả năng lọc dịch đường Termamyl loại L

B Licheniformis

Dextrin hòa tan, oligosaccharide 85 - 100 6 - 7 50 - 150

Làm loãng dịch hồ hóa

(Nguồn: Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004)

2.5.2 Enzyme amylase trong Công nghiệp Thực phẩm

2.5.2.1 Trong sản xuất rượu

Ngày nay chế phẩm amylase của nấm mốc đã hoàn toàn thay thế malt và đem lại một

số ưu điểm

- Tiết kiệm nguyên liệu sản xuất

- Tăng hiệu suất rượu, do khả năng thủy phân sâu của phức hệ enzyme nấm mốc

- Thời gian sản xuất chế phẩm giảm