Khảo sát sổ yếu tố ẳnh hưởng đến phản ứng bán tổng hỢp artesunat với xúc tác natri bicarbonat N guyễn Văn Hân Trường Đại học Dược Hà Hội Đặt vấn đề Artesunat (artesunic acid, dihydroartemisinin-10a-hemisuccinat) dẫn xuất ester artemisinin, m ột thuốc then chốt điéu trị bệnh sốt rét Plasmodium falciparum đa kháng thuốcởĐông Nam Á [1] Artesunat bán tổng hợp từdihydroartemisinin (DHA) phản ứng aq^l hóa với anhydrid succinic có mặt xúc tác thích hợp (hình 1) CH3 °Y ^ C H X ú c tá c OH D ih y d ro a rte m is in in ^CHs M etller Toledo, tủ sấy điện Memmert Hệ thống sắc ký lỏng Shimazu Các th iết bị phân tích dụng cụ thủy tinh Phương pháp nghiên cứu Đánh giá ảnh hưởng điều kiện phản ứng tỉ lệ chất tham gia phản ứng đến hiệu suất tổng hợp artesunat phương pháp qui hoạch thực nghiệm phân tích thống kê thích hợp Từ chọn phản ứng cho hiệu suất cao Xác định nồng độ artesunat hỗn hợp phản ứng sắc ký lỏng [5] Kiểm tra chất lượng sản phẩm theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam [6] Ổ C O C H 2C H C O O H Kết nhận xét A rt es un a í Hìn/í Nguỵên tóc phán ứng bán tổng hợp oỉtesunot Sản xuất artesunat qui mô công nghiệp thường dùng xúc tác pyridin hay 4-dim ethylam ino-pỵridin dung môi dicloromethan [2], [3], [4], Nhưng xúc tác dung môi đểu hóa chất độc hại gây ô nhiễm Quá trình nghiên cứu nhằm giảm độc hại sản xuất artesunat, đả sử dụng m ột xúc tác vô natri bicarbonat thay cho pyridin Khảo sát bước đẩu cho thấy với xúc tác natri bicarbonat, phản ứng xảy thuận lợi dung môi aceton [5], Bài báo trình bày kết khảo sát m ột số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp artesunat xúc tác natri bicarbonat Nguyên liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Dihydroartemisinin (Công tỵ Dược khoa -Trường Đại học Dược Hà Nội) Các dung môi, hoá chất khác thuộc loại tinh khiết phân tích Thiết bị Bản mỏng Silicagel G tráng sẵn, đế thủy tinh (Merck) Máy khuấy từ Heidolph MR3001, máy đo độ chảy Qui hoạch thực nghiệm Các biến độc lập Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất mức độ triệt để phản ứng bao gồm điểu kiện phản ứng tỉ lệ chất tham gia phản ứng Qua m ột số phản ứng thăm dò với khối lượng DHA 2,84 g (biến cố định), biến độc lập lựa chọn bảng Báng l Cóc bién độc lộp n Biến độc lập Kí hiệu Mức Mức Thể tích dung môi (mL) Xl 15 30 Lượng natri bicarbốnat (g) x2 ĩ ỉ lệ anhỵdrid succinic/DHA (m ol/m ol) x3 1,8 3,6 N hiêtđôphản lin g K ) x4 20 35 Các biến phụ thuộc Yêu cẩu m ột phản ứng tổng hợp có hiệu suất cao phải xảy nhanh, hoàn toàn gắn hoàn toàn, tạo tạp chất cho hiệu suất cao Hơn tỉ lệ DHA lại sau phản ứng phải thấp (tỉ lệ DHA thể mức độ triệt để phản ứng tạp chất số tạp chất liên quan sản - Ế Bảng Hiệu quà cùa biẽn độc lộp phẩm) DĐVN III qui định tỉ lệ tạp chất liên quan không 1% Do đó, biến phụ thuộc yêu cầu chúng lựa chọn trình bày bảng Hiệu tác động đến Biến độc lập Bàng Các biển phụ thuộc TT Biến phụ thuộc Kí hiệu Yêu cẩu Thời gian phản ứng (giờ) yi - > Tỉ lệ DHA lại sau phản ứng (%) y2 max Thiết kế tiến hành thí nghiệm Sửctụng th iết kế nhân tố phận 24-1 gồm thí nghiệm [7] Các th í nghiệm tiến hành theo thứ tự ngẫu nhiên Mỗi th í nghiệm lặp lại lẩn Các bước tiến hành thí nghiệm sau: cho vào bình cẩu 2,84 g (10 mmol) DHA 15 mL dung môi aceton Khuấy cho tan thêm vào bình cẩu tác nhân anhydrid succinic xúc tác natri bicarbonat Khuấy liên tục hỗn hợp máy khuấy từ Theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng (hỗn hợp phản ứng chấm sắc ký lớp mỏng sau giờ) Phản ứng kết thúc mỏng không vết DHA vết DHA không giảm Sau phản ứng kết thúc, xác định nống độ artesunat DHA hỗn hợp phản ứng sắc ký lỏng, qua tính hiệu suất phản ứng tỉ lệ DHA lại sau phản ứng Kết trình bày bảng Phân tích kết quà Các tính toán phần thực với hỗ trợ phán mềm M odde 5.0 Kết xu hướng mức độ ảnh hưởng biến độc lập trình bày bảng Nhận xét: - Thể tích dung môi (x1) ảnh hưởng ý nghĩa thống kê tới biến phụ thuộc - Tăng lượng natri bicarbonat (x2) làm tăng tốc độ phản ứng (ỵ1) tăng nhẹ hiệu suất phản ứng Thể tích dung môi (x l) Natri bicarbonat (X2) Thời gian phản ứng (yi) Tỉ lệ DHA(y2) Hiêu suất phãn ứng (ý^ỉ) * * * -16,25 Anhydrid succinic/DHA (x3) -36,25 N hiêtđôphản ứng (x4) -12,75 3,20 -2,72 8,20 * *Ảnh hưầg không cóỷnghĩũ Ếỗng kê vớip > 0,05 (y3), ảnh hưởng ý nghĩa đến tỉ lệ DHA lại sau phản ứng (y2) - Tỉ lệ anhydrid succinic (x3) ảnh hưởng đến biến phụ thuộc Tăng tỉ lệ anhydrid succinic làm tăng tốc độ hiệu suất phản ứng, giảm tỉ lệ DHA lại sau phản ứng - Tăng nhiệt độ phản ứng (x4) làm tăng tốc độ phản ứng, ảnh hưởng ý nghĩa thống kê đến tỉ lệ DHA hiệu suất phản ứng Lựa chọn điều kiện phản ứng: Thể tích dung môi ảnh hưởng ý nghĩa lên biến phụ thuộc nên chọn mức (15mL) Không giảm dung môi thêm hỗn hợp phản ứng đặc khó khuấy trộn, ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng Tỉ lệ anhydrid succinic/DHA chọn mức (3,6mmol/mol) lượng natri bicarbonat chọn mức (4g) để đảm bảo mức độ triệ t để phản ứng Cuối cùng, nhiệt độ ảnh hưởng ý nghĩa đến hiệu suất phản ứng nên chọn nhiệt độ phòng (20 - 28°C) Phản úng tiến hành với tỉ lệ chất trên, khối lượng tăng lên để hạn chê' sai số hư hao tinh chế Hỗn hcfp phản úTig có thành phẩn sau: Bảng Gá trị thực nghiệm cũo cóc biến phụ thuộc (n=3) Thí nghiệm Thể tích dung môi (XI, mL) Natri bicarbonat (x2, g) Anhydrid succinic/DHA (x3, mol/mol) Nhiêt đô phản iing(x4,“C) Thời gian phản ứng (y1,giờ) Tỷ lê DHAcòn Iai(y2,%) Hiêu suất phản ứng(y3,%) 15 1,8 20 92±4 3,8 ± ,1 84,5 ± ,8 30 1,8 35 74±4 2,5 ± ,2 83,9 ± ,8 15 1,8 35 58±2 2,7 ± ,2 88,4 ± ,5 30 1,8 20 72±4 3,7 ± ,2 88,6 ± ,8 15 3,6 35 41 ± 0,3 ± ,2 93,2 ± ,6 30 3,6 20 49±2 0,6 ± ,2 93,8 ± ,3 15 3,6 20 36±4 0,6 ± ,2 95,9 ± ,8 30 3,6 35 25±2 0,3 ± ,1 95,3 ± ,2 Sổ 1/2011 ^Nghiên cứu duợcThớng tln thuõc ■3 Dihydroartem isinin 14,20g A nhydrid succinic 18,00g Natri bicarbonat 20 Aceton 75 Vết tạp chất (50 m m ol) (180 m m ol) mL —> Vết DHA Vết artesunat —> Hình Sác k ị đô lớp mỏng DHA (1) hỗn hợp phán ứng (2) Kết thúc phản ứng, hỗn hợp lọc để loại natri bicarbonat, rửa natri bicarbonat aceton (2 x mL) Gộp dịch lọc dịch rửa Thêm 50 mL nước cất điểu chỉnh đến pH = với dung dịch acid acetic 10% Tiếp tục thêm 300 mL nước cất, khuấy mạnh rối để yên 15 phút cho artesunat kết tủa Lọc rửa tủa nước cất (3 X 10 mL) sấy tủa 50“C thu sản phẩm Hiệu suất phản ứng đạt 94,8 ± 1,5% hiệu suất artesunat sau tinh chế đạt 89,4 ±2 ,4 % (n -12 ) Sản phẩm artesunat kiểm tra chất lượng Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương xác nhận đạt tấ t tiêu chất lượng theo qui định DĐVN III Trong đó, tiêu hàm lượng artesunat đạt 99,7% Bàn luận Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp artesunat, đáng ý dung môi, xúc tác, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng tỉ lệ chất tham gia phản ứng Kết bảng cho thấy tron g số yếu tố khảo sát, tỉ lệ anhydrid succinic yếu tố ảnh hưởng mạnh Với tỉ lệ anhydrid succinic gấp 1,8 lẩn (m ol/ mol) so với dihydroartem isinin, phản ứng xảy khoảng 58 - 92 giờ, tỉ lệ dihydroartem isinin lại từ 2,5 - 3,8% hiệu suất artesunat khoảng 84,5 - 88,6% Trong đó, với lượng anhydrid succinic gấp 3,5 lẩn dihydroartem isinin, phản ứng xảy tron g khoảng 25 - 49 giờ, tỉ lệ dihydroartem isinin lại 0,3 - 0,6% cho hiệu suất từ 93,2 - 95,9% Như vậy, tăng tỉ lệ anhydrid succinic làm tăng hiệu suất phản ứng, làm giảm tỉ lệ dihydroartem isinin lại sau phản ứng rút ngắn thời gian phản ứng Qua nghiên cứu, nhận thấy vết tạp chất (vết màu hổng có R /= 0,82 sắc ký lớp mỏng, hình 2) tăng tỉ lệ với thời gian phản ứng Những phản ứng xảy chậm sau phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng không xử lý vết tạp chất tăng lên Như sản phẩm phân hủy artesunat dihydroartem isinin môi trường kiểm Tăng lượng chất xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng, dẫn đến hạn chế phân hủy sản phẩm thành tạp chất, kết hiệu suất phản ứng tăng lên Trong đó, tăng nhiệt độ phản ứng vừa làm tăng tốc độ phản ứng, đồng thời thúc đẩy trình phân hủy tạo tạp chất, hai trình triệt tiêu nên việc thay đổi nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Phản ứng dùng xúc tác natri bicarbonat có ưu điểm quan trọng so với phản ứng truyền thống dùng xúc tác pỵridin Thứ nhất, natri bicarbonat aceton độc gây ô nhiễm pyridin dicloromethan [8], Thứ hai phản ứng có trình tinh chế đơn giản Hỗn hợp phản ứng trung hòa cẩn pha loãng nước thu kết tủa artesunat Các tạp chất với lượng nhỏ (kể DHA chưa phản ứng hết), hòa tan hỗn hợp aceton-nước dễ loại phương pháp lọc Trong đó, phản ứng dùng xúc tác pỵridin/dicloromethan cẩn trình tinh chế phức tạp Trước tiên, hỗn hợp cẩn loại pyridin cách trung hòa với dung dịch acid hydrocloric rửa nước, sau phải cất thu hổi dicloromethan Cuối thu lấy artesunat phương pháp kết tinh hỗn hợp dung môi dicloromethan n-hexan [2] Việc tinh chế phức tạp, nhiều giai đoạn phải dùng thêm dung môi n-hexan Kết luận Artesunat bán tổng hợp từ dihydroartemisinin anhydrid succinic với xúc tác natri bicarbonat dung môi aceton Hiệu suất phản ứng đạt 94,8 ± 1,5% hiệu suất artesunat sau tinh chế đạt 89,4 ± 2,4% Phản ứng với xúc tác có ưu điểm độc hại gây ô nhiễm Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, bao gồm thể tích dung môi, lượng chất xúc tác, tỉ lệ anhydrid succinic/dihydroartemisinin, nhiệt độ phản ứng đươc khảo sát SUMMARY Artesunate have been synthesized w ith the yield o f 89,4% from dihydroartemisinin and anhydride succinic using sodium bicarbonat as catalyst and acetone as solvent This new catalyst has the advantage o f less toxic, less polution and simple purification process in comparision w ith pyridine catalyst Influence o f solvent volume, catalyst ratio, anhydride sucdniơdihydroartem isinin ratio and reaction temperature on the product yield were studied TÀI LIỆU THAM KHÀO World Health Organisation (2006), Guidelines for the Treatment o f Malaria, WHO, Geneva ĐỔ Hữu Nghị (1996) Nghiên cứu chiết xuất, bán tổng hợp đưa vào sản xuất m ột số hợp chất tự nhiên có tác dụng điểu trị sốt rét từ nguón dược liệu Việt Nam Luận án phó tiến sĩ khoa học Y Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội China Cooperative Research Group on Qinghaosu and its derivatives as antimalarials (1982), 'The chemistry and synthesis of qinghaosu derivatives", J T rad Chin Med., 2,9-16 Li Ying, Pei-Lin Yu, Yi-Xin Chen, Ru-Yun Ji (1982), "Studies on analogs o f arteannuin", Acta Chimica Sinica, 40,557-561 ĐỖ Hữu Nghị, Nguyễn Văn Hân (2008), 'Tổng hợp artesunat với xúc tác natri bicarbonat", Tạp chí Dược học, 384, tr 29-31, Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tô Cẩm Tú (1999), Thiết kễ phân tích thí nghiệm (quy hoạch hoá thực nghiệm), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội United States Pharmacopeial convention Inc (2005), The United States Pharmacopeia, Twenty-Eighth Revision and the National Formulary, Twenty-Third Edition (USP 28-NF 23) Nghiên cứu tương quan in vitro-in vivo viên nang dìitiazem giải phóng kéo dài Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Trần Linh, Nguyễn Hóng Vân* Tạ Mạnh Hùng, Phùng Thị Vinh** *Trường Đại học Dược Hà Nội: ** Viện Kiềm nghiệm thuốc trung ương Đặt vấn đề Diltiazem thuốc chẹn kênh calci dùng phổ biến điểu trị đau thắt ngực tăng huyết áp có thời gian bán thải ngắn phải dùng nhiểu lẩn ngày Để khắc phục hạn chế này, giới diltiazem thường dùng dạng tác dụng kéo dài nước, gần đây, Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội nghiên cứu bào chế diltiazem dạng viên nang chứa pellet giải phóng kéo dài 12 [1] đánh giá tương đương sinh học so với viên Diacor đối chiếu Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương Tiếp theo nghiên cứu trên, tiến hành đánh giá tương quan in vitro-in vivo chế phẩm Nguyên liệu, thiết bị, pKương pháp nghiên cứu Nguyên liệu, thiết bị -Diltiazem đạt tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc Các nguyên liệu, hóa chất dùng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dược dụng tinh khiết phân tích -Viên nang diltiazem giải phóng kéo dài 12 Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội bào chế, đạt TCCS, lô 070709, lĩạn dùng 07/2011 -Các th iết bị nghiên cứu chính: máy thử hòa tan VANKEL-VARIAN, máy lắc xoáy Vorter genie 2, HPLCMS Thermo Phương pháp nghiên cứu Thử nghiệm hòa tan Tiến hành theo test 2, test chuyên luận nang giải phóng kéo dài USP 30 với pH thiết bị thay đổi (pH: 1,2 - 4,5 - 6,8 7,2 giỏ quay cánh khuấy) Mô hình hóa đồ thị hòa tan Sửdụng phần mềm MathCAD, khớp số liệu môi trường lựa chọn mô hình phù hợp dựa tiêu chuẩn thông tin Akaike Mô hình có giá trị AIC nhỏ xem mô hình phù hợp Đánh giá sinh khả dụng: Đánh giá 12 người tình nguyện theo quy định chung FDA, lấy 6ml máu thời điểm: 0;1;2;3;4;5;6;7;8;10;12;24 36h sau uống thuốc Ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút, lấy lớp huyết tương, bảo quản -40°c±10°c phân tích ... lượng artesunat đạt 99,7% Bàn luận Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng bán tổng hợp artesunat, đáng ý dung môi, xúc tác, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng tỉ lệ chất tham gia phản ứng Kết... thay đổi nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Phản ứng dùng xúc tác natri bicarbonat có ưu điểm quan trọng so với phản ứng truyền thống dùng xúc tác pỵridin Thứ nhất, natri bicarbonat aceton... succinic làm tăng tốc độ hiệu suất phản ứng, giảm tỉ lệ DHA lại sau phản ứng - Tăng nhiệt độ phản ứng (x4) làm tăng tốc độ phản ứng, ảnh hưởng ý nghĩa thống kê đến tỉ lệ DHA hiệu suất phản ứng Lựa chọn