Nghiên cứu các điều kiện tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp enzyme glucoamylase từ một số chủng nấm mốc và ứng dụng

KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE CỦA CANH TRƯỜNG NẤM MỐC TRÊN CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU .... DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số enzyme sản xuất công nghiệp từ các chủng vi sinh v

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến

PGS TS Đồng Thị Thanh Thu

Người đã luôn luôn tận tình hướng dẫn, định hướng cho tôi từ lúc bắt đầu cho đến khi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa Trường Đại học Khoa học tự nhiên Tp.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi làm việc trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn Ths Trần Quốc Tuấn đã luôn động viên, hỗ trợ, giúp

đỡ tôi trong quá trình làm đề tài

Xin cảm ơn chị Hiền, chị Mai, các bạn Tú Minh, Hồng Vân, Thùy Nhi,

Bảo Trân, Bảo Yến và các bạn lớp cao học Hóa Sinh K17 đã giúp đỡ,

chia sẽ kinh nghiệm với tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn

Cảm ơn các em Khuê, Khoa, Nguyên, Phát, Nhã, Vy đã luôn động viên và khích lệ tinh thần để tôi hoàn thành tốt luận văn

Cuối cùng con xin gửi lòng biết ơn vô hạn đến Ba Mẹ và những người thân trong gia đình đã hỗ trợ cả vật chất lẫn tinh thần để con bước tiếp trên con đường học vấn của mình

Tác giả

Nguyễn Thị Lệ Ngọc

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng biểu

Danh mục các hình, biểu đồ, đồ thị

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 3

1.1.1 Bản chất sinh học của enzyme 3

1.1.2 Cấu trúc phân tử enzyme 4

1.1.3 Cơ chế xúc tác của enzyme 5

1.1.4 Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác 6

1.1.5 Công nghệ enzyme và ứng dụng 7

1.2 ENZYME GLUCOAMYLASE 10

1.2.1 Giới thiệu chung 10

1.2.2 Cơ chế tác động 10

1.2.3 Tính chất của glucoamylase 11

1.2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ……….…….……… 13

1.2.5 Ứng dụng của enzyme glucoamylase 13

1.2.6 Đặc điểm các chủng nấm mốc tổng hợp glucoamylase 14

1.2.6.1 Aspergillus 14

1.2.6.2 Rhizopus 15

1.3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN ENZYME TỪ

VI SINH VẬT 16

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 16

1.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn 16

1.3.1.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng 17

1.3.2.Phương pháp nuôi cấy chìm 17

1.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme 17

1.3.3.1 Chủng giống vi sinh vật 18

1.3.3.2 Môi trường dinh dưỡng 18

1.3.3.3 Nhiệt độ 19

1.3.3.4 Độ ẩm 19

1.3.3.5 pH 19

1.3.3.6 Cung cấp oxy 19

1.3.4 Thu nhận enzyme từ canh trường nuôi cấy 20

1.3.5 Phương pháp tinh sạch enzyme 21

1.3.5.1 Kết tủa enzyme dựa trên tính hoà tan 21

1.3.5.2 Tủa bằng muối 21

1.3.5.3 Tủa bằng dung môi hữu cơ 21

1.3.5.4 Tủa bằng điểm đẳng điện 21

1.3.5.5 Tủa bằng vật liệu polymer không ion 22

1.3.5.6 Tủa bằng ion kim loại 22

1.4 NẤM MEN VÀ NUÔI CẤY NẤM MEN THU SINH KHỐI

GIÀU PROTEIN 22

1.4.1 Nấm men 22

1.4.2 Các chất dinh dưỡng cho nấm men 24

1.4.2.1 Dinh dưỡng Carbon 24

1.4.2.2 Dinh dưỡng nitơ 26

1.4.2.3 Dinh dưỡng khoáng 26

1.4.2.4 Dinh dưỡng các chất sinh trưởng 28

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng dến hoạt động sống của nấm men 28

1.4.3.1 Nhiệt độ 28

1.4.3.2 pH của môi trường 28

1.4.3.3 Thành phần môi trường 29

1.4.3.4 Oxy hòa tan 29

1.4.4 Ý nghĩa của việc sản xuất và ứng dụng của sinh khối nấm men 30

1.4.4.1 Ý nghĩa của việc sản xuất sinh khối nấm men [48] 30

1.4.4.1 Ứng dụng của sinh khối nấm men……… 31

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 32

2.1 VẬT LIỆU: 32

2.1.1 Chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu 32

2.1.2 Nguyên liệu 32

2.1.3 Môi trường nuôi cấy nấm mốc 32

2.1.3.1 Môi trường giữ giống 32

2.1.3.2 Môi trường bán rắn nuôi nấm mốc thu enzyme 32

2.1.4 Môi trường nuôi nấm men 33

2.1.4.1 Môi trường giữ giống 33

2.1.4.2 Môi trường nuôi nấm men thu sinh khối 33

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.2.1 Phương pháp xác định pH 33

2.2.2 Phương pháp xác định độ ẩm 33

2.2.3 Phương pháp xác định lượng đường khử theo Miller 34

2.2.3.1 Nguyên tắc 34

2.2.3.2 Hoá chất: 34

2.2.3.3 Cách tiến hành 34

2.2.4 Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid 35

2.2.5 Xác định Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl 36

2.2.5.1 Nguyên tắc 36

2.2.5.2 Cách tiến hành……….36

2.2.6 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật 38

2.2.6.1 Định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu 38

2.2.6.2 Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang 39

2.2.7 Phương pháp nuôi vi sinh vật 39

2.2.7.1 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc thu enzyme 39

2.2.7.2 Phương pháp nuôi cấy nấm men thu sinh khối 40

2.2.8 Phương pháp xác định thời gian thích hợp để thu nhận enzyme glucoamylase có hoạt độ cao nhất 41

2.2.9 Phương pháp tách chiết và thu nhận dung dịch enzyme 41

2.2.9.1 Phương pháp tách chiết và thu nhận dịch enzyme thô 41

2.2.9.2 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase từ dịch enzyme bởi tác nhân tủa cồn 42

2.2.9.3 Phương pháp tính hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme 42

2.2.10 Phương pháp xác định hoạt độ glucoamylase 43

2.2.11 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 44

2.2.12 Phương pháp xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme 46

2.2.13 Phương pháp khảo sát đặc tính enzyme glucoamylase 46

2.2.14 Phương pháp ứng dụng chế phẩm enzyme glucoamylase để thủy phân các loại tinh bột 47

2.2.15 Phương pháp sử dụng phần mềm Microsoft Excel trong xử lý tính toán kết quả 48

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………48

3.1.XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH BỘT TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU LÀM CƠ CHẤT 49

3.2 KHẢO SÁT HOẠT ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE CỦA CANH TRƯỜNG NẤM MỐC TRÊN CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG KHÁC NHAU 49

3.2.1 Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường cám gạo 49

3.2.2 Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc nuôi trên môi trường

bã khoai mì 51

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ phối trộn thích hợp giữa cám gạo và bã khoai mì để làm môi trường nuôi nấm mốc thu nhận enzyme glucoamylase 53

3.2.3.1 Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.awamori 53

3.2.3.2 Hoạt độ enzyme glucoamylase trong canh trường Asp.niger 54

3.2.3.3 Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Rhizopus.sp 56

3.3 KHẢO SÁT THỜI GIAN NUÔI CẤY THÍCH HỢP ĐỂ THU NHẬN ENZYME GLUCOAMYLASE 57

3.3.1 Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.awamori 57

3.3.2.Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Asp.niger 59

3.3.3.Hoạt độ enzyme glucoamylase của canh trường Rhizopus.sp 61

3.4 THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME GLUCOAMYLASE 63

3.4.1.Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori 63

3.4.1.1 Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori 63

3.4.1.2 Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Asp.awamori 64

3.4.1.3 Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE thu nhận từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori 65

3.4.2 Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.niger 65

3.4.2.1.Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.niger 66

3.4.2.2 Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Asp.niger 66

3.4.2.3 Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE thu nhận từ canh trường nuôi cấy Asp.niger 67

3.4.3 Thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy Rhizopus.sp 67

3.4.3.1 Hiệu suất thu nhận CPE thu nhận từ canh trường Rhizopus.sp 68

3.4.3.2 Hàm lượng protein của CPE thu nhận từ canh trường Rhizopus.sp 68

3.4.3.3 Xác định hoạt độ chung, hoạt độ riêng CPE thu nhận từ canh trường nuôi cấy Rhizopus.sp 69

3.4.4 So sánh hoạt độ của các CPE thu nhận từ các chủng nấm mốc 70

3.5 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH ENZYME GLUCOAMYLASE 71

3.5.1 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme glucoamylase 71

3.5.1.1 CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.awamori 71

3.5.1.2 CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.niger 72

3.5.1.3 CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Rhizopu.sp 74

3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzyme glucoamylase 76

3.5.2.1 CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.awamori 76

3.5.2.2 CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp.niger 78

3.5.2.3 CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Rhizopus.sp 80

3.6 BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG CPE THỦY PHÂN TINH BỘT TẠO DUNG DỊCH GLUCOSE ĐỂ NUÔI NẤM MEN THU SINH KHỐI GIÀU PROTEIN 82

3.6.1 Khảo sát sự thủy phân tinh bột của CPE thu nhận từ canh trường nấm mốc Aspergillus niger 82

3.6.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến sự thủy phân tinh bột 83

3.6.1.2 Hàm lượng đường khử tạo thành theo thời gian thủy phân 84

3.6.2 Nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae trên dịch đường sau thủy phân để thu sinh khối giàu protein 86

3.7.2.1 Khảo sát sự tạo thành sinh khối nấm men 86

3.6.2.2 Xác định hàm lượng N tổng số và hàm lượng protein thô từ sinh khối nấm men thu được 87

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 89

4.1 KẾT LUẬN 89

4.2 ĐỀ NGHỊ 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ODtb: giá trị OD trung bình

DOD: hiệu số giữa mật độ quang thử thật và thử không TB: trung bình

TN: thí nghiệm

UI: đơn vị hoạt độ (International Unit – đơn vị quốc tế)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số enzyme sản xuất công nghiệp từ các chủng vi sinh vật

Bảng 1.2: Một số chủng nấm men tương ứng với nguyên liệu sử dụng

Bảng 3.1: Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu

Bảng 3.2: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường cám gạo Bảng 3.3: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường bã khoai mì Bảng 3.4: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi

trường nuôi cấy Asp.awamori

Bảng 3.5: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi

trường nuôi cấy Asp.niger

Bảng 3.6: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi

trường nuôi cấy Rhizopus.sp Bảng 3.7: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi Asp.awamori

Bảng 3.8: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi

Asp.niger

Bảng 3.9: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi

Rhizopus.sp

Bảng 3.10 : Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường Asp.awamori

Bảng 3.11: Hàm lượng protein của CPE từ canh trường nuôi cấy Asp.awamori

Bảng 3.12: Hoạt độ chung, hoạt độ riêng của CPE từ canh trường nuôi cấy

Bảng 3.17 : Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường Rhizopus.sp

Bảng 3.18: Hàm lượng protein của CPE từ canh trường nuôi cấy Rhizopus.sp

Bảng 3.19: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ CPE thu nhận từ canh trường nấm

Bảng 3.27: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo sinh khối

Bảng 3.28: Hàm lượng Nitơ tổng và hàm lượng protein thô

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ

HÌNH

Hình 1.1: Cơ chế xúc tác của enzyme

Hình 1.2: Sơ đồ phân giải của glucoamylase

Hình 1.3: Đặc điểm hình thái Aspergillus awamori

Hình 1.4: Đặc điểm hình thái Aspergillus niger

Hình 1.5: Đặc điểm hình thái Rhizopus sp

Hình 2.1: Cơ sở hóa học của phản ứng định lượng đường khử

BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường cám gạo Biểu đồ 3.2: Hoạt độ enzyme glucoamylase nấm mốc trên môi trường bã khoai

mì

Biểu đồ 3.3: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi

trường nuôi cấy Asp.awamori

Biểu đồ 3.4: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi

trường nuôi cấy Asp.niger

Biểu đồ 3.5: Sự thay đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo tỉ lệ phối trộn môi

trường nuôi cấy Rhizopus

Biểu đồ 3.6 : So sánh hoạt độ của các CPE thu nhận từ các chủng nấm mốc Biểu đồ 3.7: Sự thay đổi nồng độ đường khử tạo thành theo nồng độ enzyme sử dụng

Đồ thị 3.11: Trọng lượng sinh khối nấm men thu được theo thời gian

Đồ thị 3.12: Biến thiên hàm lượng đường khử theo thời gian nuôi

MỞ ĐẦU

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức

độ công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được

là các chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các ngành công nghiệp dệt, thuộc da,… hoặc dạng tinh khiết cho thực phẩm, y dược học Nhật là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này với hơn 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase,

8906 tấn protease, 2200 tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme khác … Ở các nước phát triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v… ngành công nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh

Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại a-amylase, b-amylase, g-amylase hay glucosamylase, oligo-1,6- glucosidase, transglucosyldase Trong đó glucoamylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm

Hiện nay GA là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm Do khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là a-glucose, nên GA được sử dụng trong quy trình sản xuất a-glucose Glucose

có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm Sử dụng GA trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt nguyên liệu như Việt Nam

Tuy nhiên, cho đến nay ngành công nghệ enzyme của Việt Nam chưa được phát triển mạnh, lượng enzyme sử dụng đa phần phụ thuộc vào nguồn

nhập khẩu Do đó việc nghiên cứu, tìm hiểu, phát triển sản xuất enzyme nói chung và GA nói riêng có ý nghĩa thực tế quan trọng

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu các điều kiện tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp enzyme glucoamylase từ một số chủng nấm mốc và ứng dụng”, tập trung vào các nội dung chính sau

đây:

- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu để đạt hiệu suất thu nhận

enzyme GA cao nhất từ 3 chủng nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus sp

- Thu nhận CPE GA từ các canh trường

- Xác định điều kiện hoạt động tối ưu của CPE

- Bước đầu ứng dụng CPE để thủy phân tinh bột tạo dung dịch glucose

để nuôi nấm men thu sinh khối giàu protein

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất, sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Các quá trình trao đổi chất này là kết quả của hàng loạt các phản ứng hóa học kế tiếp nhau Hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống đều do các protein đặc biệt xúc tác, các protein này gọi là enzyme hay là fecment (ferment) [3] Enzyme là những protein có cấu tạo phức tạp và đóng vai trò xúc tác sinh học Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong

cơ thể sống

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học

1.1.1 Bản chất sinh học của enzyme [14] ,[24], [27]

Enzyme là những đại phân tử, hầu hết enzyme có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia xúc tác các phản ứng sinh học

Bản chất sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học, thực hiện xúc tác các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh vật Các enzyme đều có đặc tính sinh học chung:

- Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật

- Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được tách ra khỏi tế bào sống

- Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa

- Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học

- Enzyme có thể thực hiện một phản ứng Các phản ứng này thường xảy ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện chúng trong ống nghiệm) Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzyme đơn mà thường xảy

ra các phản ứng theo chuỗi

- Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng

1.1.2 Cấu trúc phân tử enzyme [3], [23]

Nếu ta tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa học của enzyme, ta sẽ thấy enzyme thuộc hai nhóm:

· Enzyme đơn cấu tử: bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo từ một thành phần hóa học duy nhất là protein Tính xúc tác của những enzym này hoàn toàn do cấc trúc không gian quyết định: ví dụ như enzym amylase, urease…

· Enzyme đa cấu tử: bao gồm những enzyme có hai thành phần:

- Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzyme

- Phần không phải là protein gọi là cofactor (yếu tố phối hợp) có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác Các cofactor có thể

là các ion kim loại (Cu2+, Zn2+, Fe2+,…), nhóm prostetec (nhóm ngoại) chứa vòng hem, các coenzyme là dẫn xuất của các vitamin hòa tan trong nước

v Trung tâm hoạt động của enzyme: một phần nhỏ của phân tử enzyme

kết hợp với cơ chất biến đổi cơ chất thành sản phẩm phản ứng Số trung tâm hoạt động của enzyme có thể là 1 hay nhiều hơn Mỗi trung tâm hoạt động của

enzyme thường gồm 2 vùng:

- Vùng gắn cơ chất: còn gọi là trung tâm tiếp xúc hay trung tâm cơ

chất, là vùng liên quan tới tính đặc hiệu của enzyme đối với cơ chất Trong vùng này có chứa 1 số nhóm định chức có chức năng đặc biệt gắn

cơ chất lên vị trí xác định của enzyme, tạo điều kiện cho vùng xúc tác

hoạt động như:

Nhóm –SH (của Cystein)

Nhóm –OH (của Serin)

e - NH2 (của Lizin)

w - COOH (của acid Aspactic và acid Glutamic)

a - COOH (của acid amin cuối mạch)

Ngoài ra các tương tác đồng hóa trị, các lực liên kết thứ cấp khác

đều có thể tham gia quá trình liên kết này

- Vùng xúc tác: có nhiệm vụ tạo ra khả năng cần thiết nhằm biến

đổi chuyển hóa cơ chất đã được gắn vào enzyme, làm cho các liên kết trong phân tử cơ chất trở nên lỏng lẻo, phân tử cơ chất bị biến dạng tạo điều kiện để chuyển thành sản phẩm phản ứng dễ hơn Vì vậy, vùng xúc tác liên quan tới

kiểu phản ứng

1.1.3 Cơ chế xúc tác của enzyme [27]

Điều kiện để enzyme tác dụng với cơ chất là trung tâm hoạt động của enzyme phải có cấu trúc không gian tương ứng phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất như “chìa khóa với ổ khóa” nhưng có sự “linh động” nhất định (Thuyết Fisher và Kosland)

Với:

- E: enzyme

- S: cơ chất

- ES: phức trung gian E và S

- P: sản phẩm phản ứng

Hình 1-1: Cơ chế xúc tác của enzyme [59]

phức trung gian

Trong quá trình hoạt hóa enzyme, có sự cắt bỏ một số peptide “kìm hãm” hoạt động enzyme hoặc “bao vây” các nhóm chức hoạt động enzyme, nhờ đó

có sự sắp xếp lại nội tại của phân tử enzyme để hình thành trung tâm hoạt động, giúp enzyme có khả năng hoạt động

Ví dụ: một số enzyme tiêu hóa như pepsin, trypsin, chymotrypsin,… khi mới tiết ra ở dạng không hoạt động gọi là pepsinogen, trypsinogen, chymotrypsinogen… Chúng chỉ hoạt động khi được hoạt hóa

1.1.4 Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác [11], [27]

Enzyme có nguồn gốc từ sinh vật (có thể từ động vật, thực vật hay vi sinh vật) nên enzyme hầu như không độc hại

Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ngay cả ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường thì sự xúc tác của enzyme vẫn cho hiệu quả phản ứng cao nhất

Enzyme có tính đặc hiệu cao hơn những các xúc tác khác, chỉ tác dụng lên những cơ chất nhất định và xúc tác cho những phản ứng nhất định do đó rất ít tạo sản phẩm phụ, hiệu suất thu được sản phẩm chính khá cao

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể được điều chỉnh dễ dàng thậm chí có thể ngừng phản ứng bằng cách tác động vào các yếu tố như nhiệt

độ, pH, hoặc áp suất, nồng độ cơ chất

Enzyme có cường lực xúc tác cao hơn hẳn xúc tác thông thường, chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất trong khoảng thời gian ngắn

Enzyme là chất xúc tác do đó không bị mất đi khi phản ứng kết thúc

1.1.5 Công nghệ enzyme và ứng dụng [4], [12], [14], [28], [31]

Chính vì những ưu điểm trên của enzyme so với chất xúc tác hóa học do

đó việc sử dụng enzyme vào các lĩnh vực sản xuất và đời sống trong những năm cuối thế kỷ XX đầu thế kỷ XXI rất đa dạng và phong phú Nhờ đó mà

những nghiên cứu về enzyme và các ứng dụng của chúng trong thực tiễn sản xuất đã trở thành ngành công nghệ enzyme

Cùng với sự bùng nổ của công nghệ sinh học, công nghệ enzyme đã sản xuất ngày càng nhiều các chế phẩm enzyme và được sử dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, công nghiêp dược phẩm, mỹ phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc và phân bón…

Nhờ có các chế phẩm enzyme mà các quy trình chế biến lương thực, thực phẩm được cải tiến ở nhiều khâu, nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm,

đa dạng hóa các mặt hàng công nghiệp nhẹ, cải thiện đáng kể về năng suất và chất lượng cây trồng, vật nuôi, biến phế thải thành nguồn thức ăn gia súc giàu dinh dưỡng, đồng thời tạo nguồn khí đốt phục vụ sản xuất trong sinh hoạt (biogas), cải tạo nhanh chóng tình trạng ô nhiễm môi trường ở khu vực sản xuất

và khu vực dân cư

Hiện nay, hàng năm trên thế giới đã sản xuất khoảng trên 300.000 tấn enzyme, giá trị khoảng trên 500 triệu USD (chủ yếu tập trung ở Châu Âu, Châu

Mỹ và Nhật Bản), đã đáp ứng được nhu cầu sử dụng enzyme của nhiều nước trên thế giới

Nguyên liệu để thu nhận enzyme rất đa dạng và phong phú nhưng đa phần lấy từ động vật, thực vật và vi sinh vật Từ tuyến tụy, màng nhầy dạ dày của động vật có thể thu nhận chế phẩm của enzyme amylase, ligase, protease, ribonuclease, đặc biệt là thu nhận các enzyme có độ tinh sạch và tính đặc hiệu cao như enzyme pepsine, trypsine, chymotrypsine Từ tế bào thực vật này cũng

có thể thu nhận một số enzyme như tách chiết enzyme papain từ nhựa của cây

đu đủ ( carica papaya), chiết enzyme bromelain từ vỏ, lõi, thịt quả của quả dứa, tách enzyme Ficin từ các cây họ Ficus (sung, vả)

Trong ba nguồn enzyme được trình bày ở phần trên, nguồn enzyme từ vi sinh vật được quan tâm và sản xuất nhiều nhất không chỉ ở khối lượng mà ở cả chất lượng các loại enzyme

Khoa học nghiên cứu về vi sinh vật chậm hơn khoa học nghiên cứu về động vật và thực vật Mãi đến thế kỷ XVIII người ta mới biết về sự tồn tại của

vi sinh vật trong thế giới sinh vật, tuy nhiên về việc ứng dụng các công nghệ có hoạt động của vi sinh vật thì có từ rất lâu đời Dựa trên nền tảng đó nên vi sinh vật ứng dụng đã phát triển rất nhanh đặc biệt là trong thế kỷ XX Trong đó công nghệ enzyme từ vi sinh vật đặc biệt phát triển rất mạnh ở thế kỷ XX đầu thế kỷ XXI Nguồn enzyme này dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất Nguồn enzyme từ vi sinh vật cũng là nguồn enzyme duy nhất được đưa vào sản xuất theo quy mô công nghiệp Khác với động vật và thực vật, cơ thể vi sinh vật chỉ được cấu tạo từ một tế bào, chính vì cơ thể chỉ được cấu tạo từ một

tế bào nên vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn hẳn động vật và thực vật Có thể tóm tắt những ưu điểm của vi sinh vật dùng để sản xuất enzyme được như sau:

- Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm, đòi hỏi một khối lượng enzyme tương ứng Trong khi đó, động vật và thực vật không thể thực hiện được khối lượng chuyển hóa lớn như vậy Do đó, vi sinh vật phải tổng hợp một lượng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn, điều này cũng đồng nghĩa với khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật hơn hẳn khả năng tổng hợp enzyme ở động vật và thực vật

- Hoạt độ enzyme của vi sinh vật cao hơn hoạt độ enzyme được tổng hợp từ động vật và từ thực vật

- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất cao, trong khoảng thời gian ngắn ta có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn Đặc điểm này giúp

ta trong một thời gian ngắn ta thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao

- Đặc điểm quan trọng nhất ở vi sinh vật là chúng là những cơ thể rất nhỏ bé, ta có thể đưa chúng vào các thiết bị lên men Chuyển sản xuất

enzyme bởi vi sinh vật từ hình thức thủ công, sang hình thức công nghiệp hiện đại với sản phẩm được sản xuất hàng loạt và có kiểm soát

- Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật là những nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe các yếu

tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme, nhiều khi những nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme chỉ là phế liệu của một ngành sản xuất nào đó Điều này không những có ý nghĩa về mặt kinh tế (nguyên liệu rẻ tiền) mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống Chính

vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác

- Điểm cuối cùng cũng rất quan trọng là ta hoàn toàn có thể điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme trong khi sản xuất bằng cách điều chỉnh các điều kiện pH, nhiệt độ và đặc biệt là cơ chất cảm ứng để điều khiển quá trình tổng hợp enzyme

Bảng 1.1: Một số enzyme sản xuất công nghiệp từ các chủng vi sinh vật Tên enzyme Nguồn vi sinh vật Lĩnh vực sử dụng

α- Amylase Aspergillus oryzae

Bacillus subtilis Bacillus lichemiformic

Chế biến tinh bột, sản xuất rượu, bia, tương…

Cellulase Trichoderma viride

Protease Aspergillus sp

Rhizopus sp Bacillus subtilis Bacillus lichemiformic Bacillus alkalophicloc

Chất tẩy rửa, phân giải protein thuộc da, sản xuất bia

Catalase Aspergillusniger Phân giải H2O2

Penicillincylase E.coli Sản xuất penicillin

1.2 ENZYME GLUCOAMYLASE

1.2.1 Giới thiệu chung

Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ

Aspergillus awamori (Katihara, Kurushima, 1966) Sau đó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh

vật khác cũng như ở mô động vật [14]

Glucoamylase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme Các glucoamylase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng Glucoamylase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại glucoamylase II không có cả hai tinh chất này

1.2.2 Cơ chế tác động [31]

Enzym glucoamylase có khả năng thủy phân mạnh mẽ liên kết 1,4 lẫn

-1,6 glucoside của phân tử tinh bột

Hình 1.2: Sơ đồ phân giải của glucoamylase [60]

Khả năng thuỷ phân mạnh mẽ liên kết -1,4 lẫn -1,6 glucoside glucoamylase để tạo thành glucose đã đưa enzyme này lên hàng đầu về hiệu lực xúc tác thuỷ phân tinh bột Vì thế việc dùng chế phẩm glucoamylase từ các chủng vi sinh vật trong việc sản xuất bia, rượu, mật, glucose… có một ý nghĩa triển vọng rất lớn

Enzyme glucoamylase xúc tác tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide Gốc glucose từ đầu không khử được gọi là glycone, chuỗi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra gọi là alglycone

Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O-glucoside là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base Khi tương tác với

cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid,

nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết O-glucoside) Acid glutamic ở vị trí 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết O-glucoside của phân tử cơ chất sẽ bị phá vỡ

1.2.3 Tính chất của glucoamylase [1], [31]

Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo sản phẩm là glucose Glucoamylase thuỷ phân tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loạt ở các liên -1,4 và -1,6 glucoside Nó có giá trị đặc biệt trong ngành sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành những hợp

Glucoamylase kiểu Rh delemar

Glucoamylase kiểu Asp.niger khác nhau

chất lên men được và do đó nâng cao hiệu suất lên men rượu từ các nguyên liệu

là tinh bột

Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ các tế bào vi sinh vật tuy có những điểm giống nhau, song chúng cũng có một vài điểm khác nhau

Ngay cả các chế phẩm được tách từ các chủng của nấm mốc Aspergillus cũng

khác nhau, thậm chí ngay cả các chủng cùng loài cũng khác nhau về các đặc điểm về tính chất lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu với cơ chất và điều kiện hoạt động

Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng sự thấy rằng

sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” chứ không phải theo cơ chế đơn mạch Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase:

oligosaccharide

Enzyme glucoamylase là enzyme ngoại bào thể hiện hoạt độ tối đa ở vùng

pH 3,5-5,5 So với a-amylase thì glucoamylase bền với acid hơn, nhưng lại kém bền dưới tác dụng rượu etylic, aceton, không được bảo vệ bằng Ca+2

1.2.4 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme glucoamylase

Đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về sinh tổng hợp GA theo phương pháp nuôi cấy chìm và phương pháp nuôi cấy bán rắn trên các chủng nấm mốc khác nhau J.M.Zaldivar-Aguero và cộng sự (1997) nghiên cứu

sự ảnh hưởng của phosphor trong quá trình sinh tổng hợp GA của

Aspergillus awamori theo phương pháp nuôi cấy bề sâu, kết quả đạt được

hoạt tính enzyme tăng từ 350U/l lên 1200U/l khi có bổ sung thêm

phospho[12] Ikram-ul-Haq và cộng sự (2002) sử dụng chủng Aspergillus niger GCUCM-36 nuôi cấy trên môi trường cám mì thu GA đạt hoạt tính

enzyme 1180UI/g/phút sau 48h nuôi cấy [10]

Hiện nay các nhà khoa học đang tiến hành nghiên cứu theo hướng tận dụng các phế liệu để giảm giá thành sản xuất enzyme đồng thời góp phần vào việc bảo vệ môi trường Nhóm các nhà nghiên cứu của Trung Quốc (2008) đã

sử dụng nguồn cơ chất là thức ăn thừa để tiến hành nuôi cấy chìm Aspergillus niger UV-60 thu nhận GA Tuy nhiên kết quả hoạt tính enzyme đạt được không

cao [12] Tiến sĩ Chellapandi Paulchamy (2008) nghiên cứu sự tổng hợp GA

của chủng Aspergillus niger NCIM 548 trên khô dầu đậu phộng bổ sung thêm

1% sucrose, 0.5% cao nấm men nuôi cấy trong 84h, thu được sản phẩm GA có hoạt tính 726 U/g canh trường [9]

Ở Việt Nam cũng có một số tác giả đã có các nghiên cứu về GA Võ Tấn Thiện (1995) nghiên cứu cố định GA trên giá thể polyhydroxy ethyl methacrylat (PHEMA) bằng phương pháp polymer hóa bức xạ ở nhiệt độ thấp [2] Nguyễn Thị Anh Thư (2005) nghiên cứu sự sinh tổng hợp GA của chủng

Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn [8] Nguyễn Thị Lê Nghĩa (2006) khảo sát quá trình sinh tổng hợp GA của Aspergillus oryzae trên môi trường

bán rắn đạt được kết quả GA có hoạt tính 1589,72 UI/g canh trường và 341,15 UI/ ml dịch lọc [6] Tác giả Hoàng Bá Thanh Hải (2007) đã tiến hành nghiên cứu cố định GA trên các chất mang khác nhau đạt hiệu suất cố định 47,15% trên alginate canxi, 44,69% trên kaokline và 36,49% trên chitosan

1.2.5 Ứng dụng của enzyme glucoamylase [14], [34]

Hiện nay GA là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm Do khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là a-glucose, nên GA được sử dụng trong quy trình sản xuất a-glucose Glucose

có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm Sử dụng GA trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt nguyên liệu như Việt Nam

1.2.6 Đặc điểm các chủng nấm mốc tổng hợp glucoamylase [6], [12], [13], [26]

Loài: Aspergillus awamori

Hình 1.3: Đặc điểm hình thái Aspergillus awamori

Loài: Aspergillus niger

Hình 1.4: Đặc điểm hình thái Aspergillus niger

[61]

Aspergillus là loài hiện nay được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất enzyme và acid hữu cơ Loài Aspergillus phân bố rất nhiều trong tự nhiên: đất,

trái cây, xác thực vật, và đặc biệt là chúng rất phát triển trong vùng khí hậu ấm

áp

Aspergillus có thể bình hai tầng, khuẩn lạc trên môi trường Czapek có

màu đen hoặc nâu đỏ Đính bào tử trưởng thành có hình cầu

Aspergillus là một trong những loài nấm mốc có khả năng sinh nhiều

enzyme trong quá trình phát triển của nó như: enzyme protease, pectinase, cellulase, amylase….tuỳ theo điều kiện nuôi cấy mà nó có thể tạo ra các loại enzyme nhiều ít khác nhau

1.2.6.2 Rhizopus [6], [26]

Rhizopus thuộc:

Giới: Fungi Lớp: Zygomycota Bộ: Mucorales Họ: Mucoraceae Giống: Rhizopus

Hình 1.5: Đặc điểm hình thái Rhizopus sp

[63]

Rhizopus thường xuất hiện ở bánh mì cũ nên thường được gọi là mốc bánh mì, nó còn có trong đất, trong trái cây hư, cũ nó còn ký sinh trong rễ khoai tây, táo, dâu, cà chua và nhiều khi chúng còn gây ra bệnh

trên động vật nuôi Hầu hết những loài Rhizopus là những loài thực vật

hoại sinh (saprophytes), chúng phát triển khuẩn ty bao phủ phần bên ngoài của cơ chất (ví dụ như bánh mì), khuẩn ty của nó có màu trắng, phân nhánh, đa nhân và không có vách ngăn ngang Hầu hết các sợi khuẩn ty có dạng như sợi bông vải khi còn non, sau đó phát triển sâu vào

cơ chất

Các chi Rhizopus gồm một số loài, những loài phổ biến nhất

là Rhizopus oryzae, Rhizopus delemar, Rhizopus arrhizus, Rhizopus azygosporus, Rhizopus microsporus, Rhizopus schipperae, và Rhizopus stolonifer

Rhizopus được sử dụng trong sản xuất pho mát, lên men các loại thực

phẩm khác nhau, để sản xuất rượu và các axit hữu cơ, và trong sản xuất giấy

1.3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ THU NHẬN ENZYME TỪ VI SINH VẬT

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng (vì vậy còn gọi là phương pháp nổi) Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm Thường dùng cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô…hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này

1.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn [12], [19]

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật mà trong đó vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay phát triển trên hạt, trên môi trường bán rắn

Nguyên liệu dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này thường là môi trường cám trấu, cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê Để làm tăng độ xốp của môi trường từ các nguyên liệu trên, người ta thường bổ sung vào các thành phần làm xốp như trấu, lõi ngô được làm nhỏ Tuy nhiên, các thành phần trên là các thành phần chứa rất ít chất dinh dưỡng vì vậy cần phải

bổ sung vào môi trường một lượng phụ liệu trong khoảng 15-20%

Mặc khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme thì cần phải

bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật những chất cảm ứng để cảm ứng tổng hợp enzyme

1.3.1.2 Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường lỏng [14], [19]

Vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt lỏng của môi trường Do đó vi sinh vật tạo thành một lớp váng nổi trên bề mặt của môi trường tạo thành ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí) Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí để tiến hành quá trình sinh tổng hợp enzyme

1.3.2.Phương pháp nuôi cấy chìm [19], [26]

Trong phương pháp nuôi cấy vi sinh vật bề sâu: Vi sinh vật phát triển trong lòng môi trường lỏng Môi trường dùng để nuôi cấy trong phương pháp này là môi trường lỏng, nuôi cấy theo phương pháp này các chỉ số lý hoá của môi trường thay đổi rất mạnh Chính sự thay đổi mạnh này dẫn đến sự thay đổi rất mạnh trong sự phát triển của vi sinh vật So với phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường bán rắn thì phương pháp này có một số ưu điểm là ít tốn diện tích, dễ tự động hoá và cơ giới hoá, ít tốn nhân công lao động và cho năng suất cao

Nguyên liệu dùng để nuôi cấy trong phương pháp này chính là các dung dịch đường nước bã rượu vì thế ta có thể tiết kiệm được nguyên liệu nuôi cấy Môi trường sau khi nuôi cấy có chứa enzyme mà không cần phải ly trích enzyme như nuôi cấy trên môi trường bán rắn

Bên cạnh đó cũng có những khó khăn và những nhược điểm khi áp dụng phương pháp này là: dễ bị nhiễm hàng loạt, điều khó khăn quan trọng hơn cả là vấn đề sục khí nhằm cung cấp khí O2 cho sự phát triển của vi sinh vật Nếu không giải quyết tốt vấn đề sục khí trong quá trình nuôi cấy thì sẽ thu enzyme với hiệu suất thấp, chi phí sản xuất cao

1.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme [20]

Mọi hoạt động sống của sinh vật đều liên quan chặt chẽ với môi trường Các sinh vật không chỉ có những nhu cầu về thành phần và số lượng các chất dinh dưỡng mà còn chịu ảnh hưởng vào nhiều yếu tố khác như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, của môi trường xung quanh Các yếu tố này có thể làm kích thích

hoặc ức chế sinh tổng hợp thậm chí còn làm vi sinh vật bị tiêu diệt suốt thời gian bảo quản và sử dụng

1.3.3.1 Chủng giống vi sinh vật

Đây là yếu tố quan trọng hàng đầu trong công tác nuối cấy vi sinh vật

để thu nhận enzyme Muốn thu nhận chế phẩm enzyme có hoạt độ cao, trước tiên ta cần tuyển chọn giống vi sinh vật, nghiên cứu tuyển chọn những chủng vi sinh vật nào có khả năng tích tụ nhiềụ và tiết enzyme có hoạt tính

cao Muốn thu nhận enzyme amylase ta có thể sử dụng vi khuẩn Bacilius subtilis hoặc Aspergillus oryzae Nhưng muốn thu nhận glucoamylase thì sử dụng Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Rhizopus delamar …khi chọn

giống tốt thì bước đầu ta đã tạo điều kiện thu được chế phẩm enzyme có hoạt

độ cao Nhưng ngày nay người ta thường sử dụng các loại giống gây đột biến, các loại giống đã qua biến đổi gen để sản xuất enzyme

Các giống vi sinh vật có chất lượng tốt phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Cho được năng suất cao của sản phẩm chính, không tạo ra các sản phẩm phụ nhiều

- Sử dụng được các nguyên liệu rẻ tiền

- Sau khi lên men, dễ dàng tách sản phẩm và sinh khối

- Là chủng vi sinh vật thuần khiết, không lẫn các vi sinh vật khác

- Có khả năng thích ứng và sinh sản mạnh

- Thời gian lên men ngắn, hiệu quả cao

- Khả năng bảo quản dễ dàng và bảo tồn được đặc tính di truyền

1.3.3.2 Môi trường dinh dưỡng

Khi nuôi cấy ta có thể sử dụng nhiều chất khác nhau để làm nguồn dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật, nhưng ta chọn chất này hay chất khác là tùy thuộc vào điều kiện thực tế và mục đích sản xuất Cho tới nay nguyên liệu thực vật vẫn là nguồn nguyên liệu mang đầy đủ dinh dưỡng Nguồn dinh dưỡng chủ yếu có trong thực vật đó chính là nguồn glucide, tinh

bột, cellulose khi chọn nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật cần phải chú ý đến nguồn chất cảm ứng để tổng hợp enzyme mà ta cần thu nhận

1.3.3.3 Nhiệt độ

Nấm mốc có nhiệt độ phát triển tốt ưu là 28-320C, trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi sinh vật đồng hóa chất dinh dưỡng và thải ra một lượng nhiệt khá lớn Do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải có những trang thiết bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường

1.3.3.4 Độ ẩm

Độ ẩm tối ưu trong quá trình nuôi cấy nấm mốc là 65-70% Tuỳ theo điều kiện khí hậu và điều kiện vô trùng của mỗi phòng thí nghiệm của mỗi quốc gia mà lựa chọn độ ẩm cho thích hợp, độ ẩm thường khống chế ở 50-60% Ở các quốc gia tiên tiến độ ẩm của môi trường thường sử dụng 58-

60%

1.3.3.5 pH

Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn theo phương pháp bề mặt thì pH

ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc, thường người ta sử dụng pH

tự nhiên vào khoảng 5.5-6

1.3.3.6 Cung cấp oxy

Trong quá trình phát triển và tích tụ enzyme nấm mốc rất cần oxy, khi nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với không khí qua hệ thống sợi tơ và micell vì thế đòi hỏi môi trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo nhiều hệ sợi và tích luỹ nhiều enzyme Nếu môi trường dính bết, không đủ độ xốp, không khí sẽ ít tiếp xúc vi sinh vật xảy ra

hô hấp yếm khí ảnh hưởng đến việc tích luỹ enzyme

Độ hoà tan của oxy vào môi trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp sục khí, nhiệt độ cao thì khả năng hoà tan oxy kém, nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hoà tan của oxy, ngược lại cũng có một số yếu tố làm tăng khả năng hoà tan của oxy: ete, rượu, acid hữu cơ…

1.3.4 Thu nhận enzyme từ canh trường nuôi cấy [19], [28]

Trong quá trình phát triển của nấm mốc, các vật chất khô trong môi trường sẽ hoà tan và được thuỷ phân đến 30-35% Tinh bột bị thuỷ phân hoàn toàn và phần đường không được vi sinh vật sử dụng vẫn còn tồn tại trong môi trường Các protein, hemicellulose và pectin cũng được thuỷ phân hầu hết Vì vậy, trong dịch chiết của môi trường sau khi nuôi cấy nấm mốc thường chứa các chất có phân tử thấp Phần lớn các enzyme thuỷ phân dễ hoà tan trong nước

vì vậy rất dễ dàng tách chúng ra khỏi tế bào nấm mốc trưởng thành Những tế bào này hầu như đã ngừng quá trình trao đổi chất, độ thẩm thấu của hệ sợi tăng, enzyme dễ tiết vào môi trường và dễ hoà tan vào trong nước

Để tách chiết enzyme ra khỏi môi trường nuôi cấy người ta thường dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, aceton) Trong phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzym 90-95% và trong nước chiết không chứa các tạp không tan

Đối với enzyme ngoại bào, để thu nhận enzyme người ta chỉ việc loại bỏ xác tế bào bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm, phần dịch enzyme thu hồi để tinh sạch enzyme

Đối với enzyme nội bào, để tách enzyme cần phải phá vỡ màng tế bào bằng một số phương pháp sau:

- Phương pháp cơ học: nghiền, xay nhỏ nguyên liệu

- Phương pháp vật lý: sử dụng nhiệt, áp suất thẩm thấu, làm lạnh nhanh, áp suất thẩm thấu, sóng siêu âm, ion hoá

- Phương pháp hoá học: sử dụng các loại acid, kiềm, muối, dung môi hữu cơ, chất hoạt động bề mặt

- Phương pháp enzyme và sinh học: sử dụng enzyme phân huỷ lysozyme, các chất kháng sinh

1.3.5 Phương pháp tinh sạch enzyme [14], [19], [29]

1.3.5.1 Kết tủa enzyme dựa trên tính hoà tan

Các protein trong dung dịch đều liên kết với nước khá lớn vì điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH 7, nên ở điều kiện sinh lý những protein này có thừa điện tích âm Sự phân bố điện tích âm, dẫn đến sự liên kết các cực dương của phân tử nước và các ion tích điện dương, những ion nước liên kết này tạo nên lớp nước thuỷ hoá bao quanh phân tử protein tích điện âm cản trở sự kết tủa của protein

Các loại enzyme đều có độ hoà tan kém nhất khi pH của dung dịch ở điểm đẳng điện của chúng (pH = pI), do đó thay đổi pH dung dịch có thể tiến hành kết tủa đẳng điện các loại enzym khác nhau

1.3.5.2 Tủa bằng muối

Là phương pháp phổ biến nhất để tủa protein ở nồng độ muối cao Để

kết tủa enzyme người ta dùng các loại muối amonisulphat là loại muối hoà tan tốt trong nước và không làm ảnh hưởng đến hoạt độ của enzym, ở các nồng độ muối thấp độ hoà tan của enzyme khá lớn, nhưng khi nồng độ muối tăng lên thì độ hoà tan của enzym giảm dần và có xu hướng lắng kết do sự thay đổi khả năng kết hợp với phân tử nước của phân tử protein

1.3.5.3 Tủa bằng dung môi hữu cơ

Các dung môi hữu cơ như aceton, etanol, có hằng số điện môi nhỏ, khi cho vào dung dịch enzyme sẽ làm ngăn cản sự phân tán các phân tử protein trong dung dịch, dẫn đến sự kết tủa protein hay enzyme

1.3.5.4 Tủa bằng điểm đẳng điện

Tủa phân đoạn xảy ra ở các giá trị pH khác nhau của môi trường Ở khoảng pH acid, protein có mạng lưới điện tích dương bởi vì nhóm amin thu proton Ở khoảng pH kiềm, protein có mạng lưới điện tích âm vì nhóm carboxyl của phân tử protein cho proton Tại giá trị pI, protein gần như không tích điện, điều này dẫn đến làm giảm tính hoà tan của protein, gây kết

tủa protein hay enzyme

1.3.5.5 Tủa bằng vật liệu polymer không ion

Dạng tủa này có liên quan đến sự thêm vào của một polymer không ion vào dung dịch protein Khi thêm vào dung dịch enzyme polymer, nó sẽ khử số lượng phân tử nước bao xung quanh phân tử protein gây sự tủa protein hay enzyme Polymer được chú ý nhất hiện nay là các dextran và polyethylenglycol (PEG)

1.3.5.6 Tủa bằng ion kim loại

Phương pháp tủa này dựa trên sự liên kết ion kim loại với một phần của phân tử protein Điều thuận lợi của phương pháp tủa này là chúng có thể tủa với lượng lớn trong dung dịch pha loãng Những ion được phân loại theo

Nhóm ion: Ag+, Hg2+, Pb2+ liên kết mạnh với nhóm sulphydryl

1.4 NẤM MEN VÀ NUÔI CẤY NẤM MEN THU SINH KHỐI GIÀU PROTEIN

1.4.1 Nấm men [13], [18], [28]

Nấm men Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, ngành

Ascomycota va thuộc giới nấm

Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích

thước nhỏ, từ 5-14 mircomet, sinh sản bằng cách tạo chồi hay bào tử, và thường được dùng trong lên men rượu, bia, nước giải khát, làm nở bánh mì, đặc biệt còn được ứng dụng trong sản xuất sinh khối làm nguồn dinh dưỡng bổ sung cho người và động vật Theo thống kê tổng số loài nấm men lên đến 482

loài bao gồm nhiều chủng khác nhau, đặc biệt chủng Saccharomyces cerevisiae

trở nên hấp dẫn với công nghệ sinh học nói chung vào công nghệ lên men nói riêng bởi tính ưu việt và ứng dụng rộng rãi, đa dạng của nó

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc vào chủng giống, thành phần các chất dinh dưỡng trong môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy Protein trong nấm men chiếm trung bình khoảng 50% (vật chất khô) và có khoảng 45% protein hoàn chỉnh có các acid amin không thể thay thế được như lizin, arginin, histidin, alanin, tyrozin, … Protein nấm men được xem là tương đương với protein động vật về mặt dinh dưỡng Ngoài ra tế bào nấm men còn có glucid (20% - 40%), lipid (5% - 20%),vitamin,

… Tế bào nấm men rất giàu vitamin nhóm B và tiền vitamin nhóm D2 là ergosterol, được xem là nguồn nguyên liệu quý để sản xuất một số vitamin Do các đặc điểm này đã khiến cho việc sản xuất sinh khối nấm men dùng làm thức

ăn bổ sung cho người và động vật từ lâu đã được quan tâm đến và ngày nay đã trở thành ngành sản xuất quan trọng ở hầu hết các nước có kinh tế phát triển Tùy theo nguồn nguyên liệu mà sử dụng các chủng nấm men cho phù hợp

để thu nhận sinh khối

Bảng 1.2: Một số chủng nấm men tương ứng với nguyên liệu sử dụng

Tinh bột và nước thải tinh bột Endomycopsis fibuoigera

E fibuligera + C Utilis

E fibuligera + C tropicalis

Endomyces vernalis

Dịch thuỷ phân cellulose C utilis

C tropicalis

S lactis

C pseudotropicalis

1.4.2 Các chất dinh dưỡng cho nấm men [5], [18], [21]

Dinh dưỡng nấm men có thể chia làm 2 nguồn đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng nội bào Dinh dưỡng ngoại bào bao gồm các chất dinh dưỡng bên ngoài môi trường nuôi cấy được thấm qua màng hay được biến đổi trước khi vào trong tế bào Còn khi môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn kiệt dinh dưỡng cần thiết thì tế bào sẽ sử dụng nguồn dự trữ nội bào như glycogen, trehalose, lipid và các hợp chất chứa Nitơ – dinh dưỡng nội bào

1.4.2.1 Dinh dưỡng Carbon

Vì nấm men thuộc nhóm dị dưỡng hóa năng nên nguồn C là các hợp chất hữu cơ như các glucid, rượu, acid hữu cơ, acid amin … có giá trị dinh dưỡng khác nhau Khả năng hấp thụ các nguồn C khác nhau của nấm men phụ thuộc vào 2 yếu tố : Thành phần hóa học thuộc về bản chất của nguồn C được sử dụng và đặc điểm sinh lý của tế bào nấm men

Nguồn C dinh dưỡng được nấm men sử dụng một cách dễ dàng nhất phải kể đến là nhóm glucid, cụ thể là các monosaccharide được tất cả các loài nấm men sử dụng Nó được coi là nguồn C vạn năng đối với vi sinh vật

vì tất cả các quá trình biến dưỡng và tổng hợp vật chất đều bắt nguồn từ cơ chất đầu tiên là glucose Các loại đường pentose tuy thuộc monosaccharide

nhưng nhiều loài nấm men, trong đó có giống Saccharomyces lên men rượu,

lại không thể sử dụng được Một số loài nấm men dùng trong sản xuất nấm

men gia súc thuộc giống Candida, Torulopsis có thể đồng hòa được pentose

vì thế nó thường được ứng dụng để thu sinh khối khi nuôi trên dịch thủy phân từ gỗ, các nguồn giàu hemicellulose, dịch kiềm sulfit Những loại

disaccharide (sucrose, maltose, lactose) hay trisaccharide (cellobiose, rafinose) không phải bất cứ chủng loài nấm men nào cũng có thể đồng hóa được mà còn tùy thuộc vào các enzyme thủy phân tương ứng có trong nấm men để có thể chuyển các loại đường trên thành đường đơn (glucose, fructose, các pentose)

Phần lớn các loài thuộc sống Saccharomyces khác nhau giữa chúng

trước hết là quan hệ với các loại đường trong quá trình trao đổi chất hydratcacbon Đối với các nguồn carbon khác như các loại rượu và acid hữu

cơ thì mối quan hệ này là giống nhau ở tất cả các loài trong cùng một giống

Trong số các loài thuộc giống Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae khi cho lên men đường từ tinh bột sẽ phát triển hơn các loài khác

vì nó có thể lên men được những dextrin đơn giản

Hầu hết các loài nấm men đều không có các enzyme thuộc nhóm hydrolase như amylase, cellulase … nên không sử dụng trực tiếp được tinh bột, cellulose và hemicellulos Nếu muốn sử dụng các nguồn polysaccharide này cần phải tiến hành thủy phân ( bằng acid hay enzyme ) trước khi nuôi nấm men

Nấm men cũng có thể sử dụng các acid hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất Các sản phẩm trung gian trong chu trình Krebs (acid sucxinic, fumaric, malic…) đều là nguồn C dinh dưỡng cho nấm men

Ở một số chủng nấm men còn có thể sử dụng các acid béo làm nguồn dinh dưỡng C, khả năng sử dụng phụ thuộc vào chủng, chiều dài của mạch C

và mức độ điện ly của acid béo

Trong vài thập kỷ gần đây, việc phân lập và tạo ra các chủng nấm men có khả năng sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn C đang được quan tâm Các quá trình này không những giải quyết được vấn đề

về ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra nguồn protein đơn bào và vitamin từ sinh khối nấm men để bổ sung thức ăn trong chăn nuôi

1.4.2.2 Dinh dưỡng nitơ

Cùng với nguồn C, nguồn nitơ rất cần thiết cho quá trình tổng hợp vật chất tế bào, nó có thể được cung cấp ở dạng vô cơ và hữu cơ

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ (amoni sunfat, phosphat, các muối acetat, lactat, malat và sucxinat)

Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat ngoại trừ các giống

Hansenula và Pichia thuộc họ Saccharomycetaceae và một số loài thuộc giống Brettanomyses, do không có nitrat-reductase

Nấm men được sử dụng nitơ từ môi trường lỏng amoniac (NH3) Urê cũng là nguồn nitơ thường được cung cấp khi nuôi nấm men Khi đó nấm men sẽ phân giải urê để tạo NH4+ và CO2 nhờ urease và sử dụng NH4+ mà không làm chua môi trường Do đó, urê còn được gọi là nguồn nitơ trung tính về mặt sinh lý

Các nguồn nitơ hữu cơ như các acid amin, các peptit, nucleatit … cũng được sử dụng làm nguồn nitơ cho nấm men, thường được cung cấp dưới dạng cơ chất như cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein, pepton … Nấm men tiêu hóa rất tốt cho các acid amin, ít pepton còn protein thì không Trong trường hợp này, acid amin vừa là nguồn cung cấp nitơ vừa

là nguồn carbon dinh dưỡng Chúng tham gia tạo acid amin thông qua phản ứng cetoacid

1.4.2.3 Dinh dưỡng khoáng

Các nguyên tố khoáng đóng vai trò quan trọng, tham gia trong các quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung và của nấm men nói riêng Nhu cầu khoáng của nấm men cũng không giống nhau, tùy theo loài và tùy theo giai đoạn phát triển

Ø Phospho: Trong các nguyên tố khoáng bổ sung, phospho chiếm

tỷ lệ cao nhất Điều này cũng dễ hiểu vì phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào ( acid nucleic, phospholipid, phosphoprotein

các coenzym quan trọng như: ADP, ATP, UDP, NAD,…).Thường sử dụng các loại phospho vô cơ như KH2PO4 và K2HPO4 supephosphat, DAP … làm nguồn cung cấp phospho cho nấm men 10 tỷ tế bào nấm men thì cấn khoảng 10 - 13 mg P

Ø Lưu huỳnh: S cũng là 1 nguyên tố khoáng quan trọng trong tế

bào VI SINH VậT, tham gia trong thành một số acid amin và vitamin, nhóm phụ của một số enzym Trong môi trường nuôi cấy nấm men thường sử dụng (NH4)2SO4 làm nguồn lưu huỳnh đồng thời cũng làm nguồm nitơ

Ø Kali: K đóng vai trò là chất dinh dưỡng và cũng là chất kích thích

sinh trưởng của nấm men Điều này được thể hiện trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa và quá trình đường phân (glycolisis) Nó hoạt hóa hàng loạt các enzyme như aldolase, pyruvat decarboxylase … kích thích quá trình vận chuyển phospho vào trong tế bào, ảnh hưởng đến trao đổi nitơ, lưu huỳnh trong tế bào nấm men K thường được bổ sung ở dạng muối phosphat, sulfat hoặc clorua

Ø Magie: Mg đóng vai trò như 1 cofacto, tham gia vào nhiều phản

ứng enzyme liên quan đến các quá trình phosphosyl hóa Mg có tác dụng hoạt hóa nhiều phosphatase và endolase Ngoài ra Mg còn tham gia trong quá trình tổng hợp protein (có vai trò trong việc liên kết các tiểu phần riboxom với nhau) Khi có sự hiện diện của Mg sẽ làm tăng nhu cầu về glucose của nấm men Nhu cầu Mg thường vào khoảng 0,02-0,05 % ở dạng sulfat

Ø Các nguyên tố vi lượng như (Mn, Fe, Cu, Zn, Mo, Bo, Li, Nitơ, Co,…) cũng rất cần cho các quá trình sinh lý trong tế bào nấm men nhưng chỉ cần một lượng rất nhỏ vào khoảng 10-6 - 10-8M Thường những nguyên tố này có sẵn trong nước máy, trong các hóa chất dùng làm môi trường Tuy nhiên, trong một số trường hợp cụ thể ta cũng cần phải bổ sung nguyên tố cần thiết