VI SINH VẬT
2.1.3. Môi trường nuôi cấy nấm mốc
2.1.3.1. Môi trường giữ giống [30], [9]
Môi trường giữ giống PGA (Potato Glucose Agar) - Khoai tây 200g
- Glucose 20g
- Agar 20g
- Nước cất 1000ml
2.1.3.2. Môi trường bán rắn nuôi nấm mốc thu enzyme
Cơ chất 70g
Trấu tạo độ xốp 20g
Thành phần khoáng theo môi trường Czapeck: - NaNO3 3g/l
- KH2PO4 1g/l - MgSO4 0.5g/l - FeSO4 0.01g/l
2.1.4. Môi trường nuôi nấm men [32] 2.1.4.1. Môi trường giữ giống 2.1.4.1. Môi trường giữ giống
Môi trường Hansen
- Glucose 50g
- KH2PO4 3g - MgSO4.7H2O 2-5g
- Agar 20g
- Nước cất 1000ml
2.1.4.2. Môi trường nuôi nấm men thu sinh khối
- Đường khử 4% - DAP 0.15% - Urea 0.15% - pH 5.0 - Mật độ tế bào ~ 2*105 tb/ml
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Phương pháp xác định pH [11] 2.2.1. Phương pháp xác định pH [11]
Tiến hành: Cân chính xác 10g nguyên liệu hòa tan trong 100ml nước, dùng que thủy tinh khuấy đều. Để lắng sau 1 giờ, lấy dịch trong đem đo với máy đo pH.
2.2.2. Phương pháp xác định độ ẩm [5]
Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hơi nước trong nguyên liệu. Cân
trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô tuyệt đối. Trọng lượng mẫu giảm khi sấy khô tuyệt đối chính là lượng nước có trong mẫu.
Tiến hành:
Cân trọng lượng bì (sau khi sấy khô tuyệt đối).
Cân m(g) mẫu. Cho mẫu vào bì rồi đem sấy đến trọng lương không đổi, đưa vào bình hút ẩm để làm nguội đến nhiệt độ phòng. Cân lại cả mẫu + bì bằng cân phân tích chính xác đến 0.0002g.
Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau: * 100%
Trong đó:
- m1: khối lượng mẫu + bì trước sấy - m2: khối lượng mẫu + bì sau sấy - m: khối lượng mẫu ban đầu
2.2.3. Phương pháp xác định lượng đường khử theo Miller [17], [29] [29]
2.2.3.1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,5- dinitrosalisylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Màu vàng
Khử hóa
Màu đỏ cam
Hình 2.1: Cơ sở hóa học của phản ứng định lượng đường khử
2.2.3.2. Hoá chất:
Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS): cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml.
Dung dịch glucose mẫu (1mg/ml): cân chính xác 100mg D-glucose hòa tan trong 100ml nước cất.
2.2.3.3. Cách tiến hành
Từ dung dịch glucose chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ từ 0 – 1000 (mg/ml). Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Dung dịch glucose chuẩn (ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
Hút 1 ml glucose với các nồng độ khác nhau cho vào các ống nghiệm sạch
theo thứ tự từ 0-10
DNS 1% (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Lắc đều, đem đun cách thủy trong 10 phút. Làm nguội và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm
Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose.
Tiến hành thí nghiệm: phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với
thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn. Nồng độ đường khử trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng.
2.2.4. Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid[2], [7] [2], [7]
ØNguyên tắc:
Dưới tác dụng của HCl tinh bột bị thuỷ giải thành glucose theo phương trình:
(C6H12O5)n +n H2O à nC6H12O6
Xác định hàm lượng glucose tạo thành, nhân với hệ số chuyển đổi tinh bột thành đường là 0.9 ta suy ra hàm lượng tinh bột có trong nguyên liệu.
Cân 1g nguyên liệu có chứa tinh bột cho vào cốc, thêm 50 ml nước cất lắc đều, để yên trong vòng khoảng 30 - 45 phút lọc qua giấy lọc rửa cặn bằng nước cất khoảng 5- 6 lần, chọc thủng giấy lọc chuyển cặn vào bình cầu (bình hoàn lưu) bởi 25ml dung dịch HCl 5%. Lắp bình cầu vào hệ thống hoàn lưu trong vòng 3 giờ lấy hệ thống ra để nguội sau đó trung hoà bằng NaOH 5% đến pH = 5-6. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml thêm nước cho đến vạch, lắc đều và lọc qua giấy lọc. Lấy 1 ml dịch lọc đem đi xác định hàm lượng đường glucose tạo thành theo phương pháp DNS, từ đó suy ra hàm lượng tinh bột tương ứng.
Ø Cách tính
Hàm lượng tinh bột của nguyên liệu
(%) * * *0.9*100 m n V a A = A: hàm lượng tinh bột. a : nồng độ glucose (mg/ml) n: sầ lần pha loãng (lần)
m: khối lượng mẫu (g)
0.9: hệ số chuyển đổi glucose thành tinh bột
2.2.5. Xác định Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl [2], [7], [26] [26]
2.2.5.1. Nguyên tắc
Dưới tác dụng của H2SO4 đặc, nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nitơ bị phân huỷ và bị oxy hoá đến CO2 và H2O. Còn nitơ chuyển thành amoniac (NH3) và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sunfat. Khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra NH3
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O + NH3
- Lượng NH3 phóng thích ra được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas-wargner và được dẫn đến bình hứng có chứa H3BO3
2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O
- Định lượng amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N. Từ đó tính được lượng N – tổng trong mẫu.
2.2.5.2. Tiến hành
Ø Vô cơ hoá nguyên liệu
Cân 1g mẫu tươi hoặc 0,1 đến 0,3g mẫu khô đã nghiền nhỏ. Cho mẫu vào bình Kjeldahl. Nếu mẫu lỏng thì dùng pipet, hút 2 đến 5ml cho vào bình Kjeldahl thêm 5 ml H2SO4 đậm đặc và 0,5 xúc tác (hỗn hợp 9K2SO4:1CuSO4). Để nghiêng bình trên bếp đặt trong tủ hoffer đun khoảng 2-3 giờ cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt, để nguội. Chuyển dịch sang bình định mức 50ml trong bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô đạm dẫn nước cất đến vạch định mức.
Ø Cất đạm
Đặt bình hứng (có chứa 20ml H3PO4 3% thêm vài giọt chỉ thị Tasiro) vào vòi ống sinh hàn. Hút 10ml dung dịch đã vô cơ hoá, cho vào phễu của máy cất đạm và mở khoá cho vào bình phản ứng, tráng phễu 3 lần bằng nước cất.
Cho 10ml dung dịch NaOH đậm đặc cho xuống bình từ từ, tráng một ít nước cất. Để máy lôi cuốn trong 5 phút rồi hạ bình tam giác xuống để thêm 2 phút nữa. Định lượng (NH4)2B4O7 tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N, dung dịch chuyển từ màu xanh lục sang màu tím đỏ.
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O (NH4)2SO4 + 4H3BO3
2.2.5.3. Tính kết quả
Hàm lượng Nitơ tổng số có trong mẫu được tính theo công thức sau: Nmg% = V*1,42*100 *(50/10)
m*(100-w) Trong đó:
- V: Dung dịch H2SO4 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) - 1,42: Số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N
- m: Trọng lượng mẫu phân tích ( mg). - w: Độ ẩm mẫu phân tích (%) (w/w) - 100: Hệ số chuyển thành (%)
2.2.6. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật
2.2.6.1. Định lượng mật độ tế bào trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu
[9], [10], [16], [30]
Ø Nguyên tắc
Buồng đếm Goriaep là một phiến kính dày hình chữ nhật, ở giữa là phần lõm phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 4, 5 hình vuông có diện tích tổng cộng là 1mm2 và được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25mm2. Bề dày của khoảng trống buồng đếm là 1/10mm. Mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400mm2. Do vậy, mỗi ô lớn có thể tích là 1/250mm3
hay 1/250 x 103cm3 = 4 x 10-6ml.
Ø Tiến hành
Lắc mạnh dịch huyền phù, nhỏ một giọt bằng pipet lên bề mặt buồng đếm kề với cạnh của lá kính. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi. Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 đến 5 phút. Đếm ít nhất 5 ô lớn, lấy trị số trung bình. Đảm bảo mật độ tế bào không quá lớn (lớn hơn 200 tế bào trong một ô lớn).
Ø Cách tính kết quả
Số tế bào trên một ml mẫu phân tích (N) được tính như sau N (tế bào/ml) = (a x K) / v
Trong đó
§ a: Số tế bào trung bình có trong một ô lớn.
§ v: Thể tích một ô lớn = 4 x 10 -6ml
§ K: Hệ số pha loãng mẫu.
2.2.6.2. Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang [9], [15] [15]
Ø Nguyên tắc
Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610nm.
Ø Tiến hành
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào. Pha loãng một huyền phù nấm men cần kiểm nghiệm có mật độ tế bào bất kỳ thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD 610 nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Đo OD 610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận các số đo thực tế. Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng buồng đếm hồng cầu) xác định mật độ tế bào (N/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log (N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) theo OD 610nm.
Xác định mật độ tế bào theo độ đục:
- Đo độ đục của một huyền phù tế bào cần xác định mật độ.
- Từ giá trị OD 610nm đo được, suy ra số lg (N/ml) và trị số mật độ N/ml từ đường chuẩn. Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa giữa giá trị OD và lgx.
2.2.7. Phương pháp nuôi vi sinh vật
2.2.7.1. Phương pháp nuôi cấy nấm mốc thu enzyme [9]
Chuẩn bị môi trường bán rắn có thành phần theo mục 2.1.3.2. Cho 20g môi trường vào erlen 250, đem hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 30 phút.
Thêm vào ống giống các chủng nấm mốc 10ml nước cất vô trùng 0,05% agar, lắc đều. Xác định lượng tế bào nấm mốc theo mục 2.2.6.
Thời gian nuôi: tùy thuộc vào chủng nấm sẽ có các thời gian tối ưu khác nhau. Nhiệt độ nuôi nấm mốc là nhiệt độ phòng.
Tiến hành nuôi đồng thời nấm mốc với cơ chất có tỉ lệ khác nhau và khảo sát thời gian tối ưu cho glucoamylase có hoạt độ cao nhất.
2.2.7.2. Phương pháp nuôi cấy nấm men thu sinh khối [5]
Chuẩn bị môi trường lỏng nuôi cấy nấm men theo mục 2.1.4.2. Cho 100ml môi trường vào erlen 250, đem hấp khử trùng ở 1210
C, 1atm trong 30 phút.
Thêm vào ống giống Saccharomyces cerevisea 10ml nước cất vô trùng 0,05% agar, lắc đều. Xác định lượng tế bào nấm men theo mục 2.2.6.
Hút 1ml giống cấy vào mỗi erlen (với lượng tế bào khoảng 2*105). Sau 72h nuôi cấy lắc, lấy dịch nuôi ly tâm thu sinh khối nấm men dạng paste.
2.2.8. Phương pháp xác định thời gian thích hợp để thu nhận enzyme glucoamylase [9] enzyme glucoamylase [9]
Ø Nguyên tắc:
Mỗi loài sinh vật có một đường cong tăng trưởng khác nhau. Tại mỗi thời điểm khác nhau của quá trình sinh trưởng, chúng sử dụng các nguồn cơ chất khác nhau trong môi trường nuôi cấy bằng cách tiết ra hệ enzyme thủy phân đặc hiệu.
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi cấy của nấm mốc nhằm xác định thời gian tối ưu thu nhận được enzyme có hoạt độ cao nhất.
Ø Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường bán rắn có thành phần theo mục 2.1.3.2. Cho 20g môi trường vào erlen 250, đem hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 30 phút. Thêm vào ống giống các chủng nấm mốc 10ml nước cất vô trùng 0,05% agar, lắc đều, cấy vào mỗi erlen 1ml dịch huyền phù. Nuôi mốc ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm, trung bình 300
C.
Tại các thời điểm 24h, 30h, 36h, 42h, 48h, 54h, 60h, 66h và 72h tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme glucoamylase.
Biểu diễn sự biến đổi hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian sinh trưởng khác nhau của nấm mốc để chọn ra thời điểm nấm mốc cho hoạt độ glucoamylase cao nhất
Chọn thời điểm mà nấm mốc cho hoạt độ glucoamylase cao nhất để thực hiện nuôi cấy thu chế phẩm enzyme.
2.2.9. Phương pháp tách chiết và thu nhận dung dịch enzyme
2.2.9.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận dịch enzyme thô [9]
Ø Nguyên tắc: enzyme glucoamylase là enzyme ngoại bào nên việc tách chiết khá đơn giản. Nấm mốc tiết enzyme glucoamylase ra ngoài và ngấm vào môi trường bán rắn nuôi nấm mốc, nên để chiết enzyme chỉ cần nghiền nhỏ
và hòa tan canh trường vào trong nước cất hoặc dung dịch đệm có pH thích hợp, chiết lấy dịch lỏng. Dịch enzyme thu được là dung dịch enzyme dạng thô.
Ø Tiến hành
Cân 20g canh trường nuôi nấm mốc đã nghiền nhuyễn cho vào erlen, thêm 100ml nước cất hay dung dịch đệm. Lắc 30 phút, lọc qua vải, ly tâm dịch lọc 4000 vòng/phút trong 10 phút. Thu lấy dịch ly tâm, nếu thấy dịch chưa trong thì lọc qua giấy lọc rồi định mức cho đủ 100ml. Dịch enzyme thu được là dung dich enzyme glucoamylase thô.
2.2.9.2. Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase từ
dịch enzyme bởi tác nhân tủa cồn [8], [14]
Ø Nguyên tắc
Nguyên tắc kết tủa protein là dựa vào độ hoà tan của chúng. Độ hoà tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố và một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol. . .) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do việc làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hoà tan trong nước (aceton, ethanol) vào dung dịch chứa protein.
Ø Tiến hành
Cho từ từ cồn 96% lạnh (từng giọt bằng buret và khuấy đều) vào dung dịch protein (enzym thô) trong điều kiện lạnh ở nhiệt độ từ 4-80C, với tỷ lệ Vcồn/V dd enzyme = 3/1. Để yên trong tủ lạnh 15 phút. Ly tâm thu kết tủa với tốc độ 5000 vòng/phút, thời gian 10 phút. Kết tủa được sấy khô ở nhiệt độ nhỏ hơn 400C. Nghiền nhỏ thành dạng bột.
2.2.9.3. Phương pháp tính hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme
Thu chế phẩm enzyme như mục 2.2.9.2 và tính hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme theo công thức:
Trong đó:
- %H : hiệu suất thu nhận CPE
- m(CPE): khối lượng chế phẩm enzyme (g) - m(CT): khối lượng canh trường (g)
2.2.10. Phương pháp xác định hoạt độ glucoamylase [17], [22]
Ø Định nghĩa đơn vị hoạt độ [17]
Đơn vị hoạt độ của enzyme được tính theo đơn vị quốc tế UI (International Unit). Mỗi UI là hoạt động của enzyme xúc tác chỉ thị sự chuyển hóa 1 mmol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện thích hợp nhất.
Ø Hoạt độ của enzyme glucoamylase
Một đơn vị hoạt độ (UI) của glucoamylase là lượng enzyme xúc tác thủy phân tinh bột để giải phóng ra 1mg glucose trong 1 phút ở điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp.
Xác định hoạt độ enzyme glucoamylase theo phương pháp so màu với DNS.
Cách tiến hành:
Mẫu thử không: Hút 0,5ml chế phẩm enzyme glucoamylase pha loãng ở nồng độ thích hợp cho vào một ống nghiệm sạch và khô. Thêm 0,5ml hồ tinh bột 2%. Thêm 1ml thuốc thử DNS, đun sôi 15 phút, làm nguội rồi đem xác định mật độ quang.
Mẫu thử thật: Hút 0,5ml chế phẩm enzyme glucoamylase pha loãng ở nồng độ thích hợp cho vào một ống nghiệm sạch và khô. Thêm 0,5ml hồ tinh bột 2%, thực hiện phản ứng ở 450C, pH 5.0 trong 10 phút. Thêm 1ml thuốc thử DNS, đun sôi 15 phút, làm nguội rồi đem xác định mật độ quang.
Các dung dịch sau phản ứng này được xác định mật độ quang ở bước sóng 540nm. Dựa vào đường chuẩn glucose xác định được lượng đường khử tạo thành sau khi thủy phân bởi enzyme glucoamylase.
Trong đó:
- X: lượng glucose giải phóng được xác định dựa vào đường