VI SINH VẬT
3.7.2.1. Khảo sát sự tạo thành sinh khối nấm men
Điều chỉnh dịch đường sau thủy phân tinh bột bằng CPE thu nhận từ canh trường nuôi cấy nấm mốc Asp.niger về nồng độ đường khử 4%.
Tiến hành thí nghiệm nuôi nấm men theo mục 2.2.7.2.
Kết quả thu nhận sinh khối nấm men được trình bày trong bảng 3.27
Bảng 3.27: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo sinh khối Thời gian (ngày) Trọng lượng sinh khối dạng paste (g/100ml) Trọng lượng
sinh khối khô
(g/100ml) Lượng đường khử còn lại (g/100ml) 0 0 0 4 1 2,6502 ± 0,0177 0,6389 ± 0,0043 2,514 ± 0,006 2 3,1734 ± 0,0161 0,7651 ± 0,0039 1,263 ± 0,007 3 3,2883 ± 0,0082 0,7928 ± 0,0020 0,365 ± 0,006 4 3,1581 ± 0,0085 0,7614 ± 0,0021 0,351 ± 0,006 5 2,9775 ± 0,0191 0,7179 ± 0,0046 0,324 ± 0,006
Đồ thị 3.12: Biến thiên hàm lượng đường khử theo thời gian nuôi
Ø Nhận xét:
Sinh khối đạt giá trị cao nhất 0,7928 g/100ml sau 3 ngày nuôi cấy. Trong môi trường dịch thuỷ phân tinh bột có lượng đường đơn giản cao, chủ yếu là glucose vì chỉ sử dụng glucoamylase để thuỷ phân tinh bột. Nên nấm men sẽ sử dụng triệt để nguồn đường này để tạo sinh khối.
Lượng đường sẽ giảm dần theo thời gian nuôi và chỉ còn 0,365 g/100ml sau 3 ngày nuôi cấy. Sang ngày thứ 5 lượng sinh khối giảm xuống còn 0,7179 ± 0,0046g/100ml do nấm men bước sang giai đoạn suy tàn, tế bào nấm men tự phân,
3.6.2.2. Xác định hàm lượng N tổng số và hàm lượng protein thô từ
sinh khối nấm men thu được
Cân chính xác 1g sinh khối dạng paste tiến hành xác định Nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl theo mục 2.2.5.
Từ kết quả nhận được tính hàm lượng protein thô bằng cách nhân với hệ số 6,25.Từ đó xác định hàm lượng protein trong các sinh khối nấm men thu được từ các môi trường khác nhau.
Kết quả hàm lượng Nitơ tổng và hàm lượng protein thô được trình bày ở bảng 3.28.
Bảng 3.28: Hàm lượng Nitơ tổng và hàm lượng protein thô Thí nghiệm N tổng số (%) N tổng số TB (%) Hàm lượng protein thô (%) 1 8,018 7,98 0,05 49,88 0,3 2 7,928 3 8,002
Ø Nhận xét:Hàm lượng N tổng số trung bình của sinh khối nấm men là 7,98 0,05 (%), và có tương đương hàm lượng protein thô là 49,88
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Từ kết quả thí nghiệm thu được trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra được một số kết luận như sau:
1. Nguyên liệu dùng làm môi trường nuôi cấy nấm mốc để thu CPE glucoamylase là bã khoai mì và cám gạo cho CPE có hoạt tính cao, vừa là nguồn nguyên liệu dồi dào, dễ tìm, rẻ tiền, đồng thời còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ các nhà máy sản xuất tinh bột.
2. Tỉ lệ phối trộn cám gạo : bã khoai mì trong môi trường nuôi nấm mốc để thu enzyme glucoamylase có hoạt độ cao nhất là:
- Đối với Asp.awamori là 60:10 (g/g) thu nhận được enzyme có hoạt độ 36,269 0,147 UI/gCT.
- Đối với Asp.niger là 60:10 (g/g) thu nhận được enzyme có hoạt độ 43,801 0,355 UI/gCT.
- Đối với Rhizopus.sp là 65:5 (g/g) thu nhận được enzyme có hoạt độ 27,028 0,37 UI/gCT.
3. Thời gian tối ưu để thu nhận enzyme glucoamylase trên môi trường bán rắn có hoạt độ cao nhất là:
- Đối với Asp.awamori sau 54h nuôi cấy thu nhận được enzyme có hoạt độ là 42,095 0,079 UI/gCT.
- Đối với Asp.niger sau 54h nuôi cấy thu nhận được enzyme có hoạt độ là 51,743 0,473 UI/gCT.
- Đối với Rhizopus.sp sau 60h nuôi cấy thu nhận được enzyme có hoạt độ là 41,198 0,574 UI/gCT.
4. Hiệu suất thu nhận CPE từ canh trường nuôi cấy là: o Asp.awamori: 2,465 0,097 %.
o Asp.niger: 2,481 0,1 %.
o Rhizopus.sp: 2,077 0,025 %.
5. Hoạt độ chung và hoạt độ riêng của các CPE thu nhận từ các canh trường nuôi cấy các chủng nấm mốc có giá trị như sau:
- Hoạt độ chung:
o Asp.awamori: 39.963 0.942 UI/g CPE.
o Asp.niger: 134.29 1.659 UI/g CPE.
o Rhizopus.sp: 21.744 1.039 UI/g CPE. - Hoạt độ riêng:
o Asp.awamori: 0,24 0,007 UI/mg protein.
o Asp.niger: 0,538 ± 0,007 UI/ mg protein.
o Rhizopus.sp: 0,120 ± 0,006 UI/ mg protein.
6. Các CPE hoạt động tối ưu trong điều kiện nhiệt độ, pH là:
o CPE từ canh trường Asp.awamori hoạt động tối ưu ở pH 4,5 và nhiệt độ là 400
C.
o CPE từ canh trường Asp.niger hoạt động tối ưu ở pH 5,5 và nhiệt độ là 400C.
o CPE từ canh trường Rhizopus.sp hoạt động tối ưu ở pH 4,0 và nhiệt độ là 550C.
7. Khảo sát sự thủy phân của CPE trên các loại cơ chất khác nhau như: tinh bột tan, bột mì, bột gạo, bột sắn dây. Khả năng thủy phân của CPE đối với các cơ chất chứa tinh bột là không giống nhau. Khả năng thủy phân của enzyme glucoamylase trên cơ chất giảm dần theo thứ tự: Tinh bột tan > Bột sắn dây > Bột gạo > bột mì.
8. Nấm men Sacchromyces cerevisiae có thể phát triển trên dịch đường khử sau khi thủy phân tin bột bằng CPE glucoamylase đạt lượng sinh khối khô
là 0,7928 0,002 g/100ml CT. Hàm lượng N-tổng đạt 7,98 0,05 %, và hàm lượng protein thô là 49,88 0,3%.
4.2. ĐỀ NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu đạt được ở trên, nhằm tăng hiệu quả ứng dụng cho đề tài này, chúng tôi đề nghị hướng nghiên cứu tiếp theo như sau:
- Tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi sinh vật để tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase.
- Ứng dụng các phương pháp nghiên cứu di truyền để tạo ra được những chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase có các đặc tính chịu nhiệt, chịu acid,..., cho năng suất cao và ổn định dùng trong quy mô sản xuất công nghiệp. - Tiếp tục tinh sạch enzyme glucoamylase để tạo CPE tinh khiết đáp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
[1]. Nguyễn Hữu Chấn, 1993, Enzyme và xúc tác sinh học, NXB Y học. [2]. Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chín, 1997, Thực
tập lớn sinh hóa, NXB Đại học quốc gia Tp HCM.
[3]. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 1997, Hóa sinh học, NXB Giáo dục
[4]. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa, 2006, Công nghệ sinh học - tập 3 - Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục.
[5]. Nguyễn Chí Dũng, 2009, Khảo sát sinh tổng hợp cellulase bởi nấm mốc trên môi trường giàu cellulose và một số ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ
sinh học - Trường Đại học KHTN Tp HCM.
[6]. Nguyễn Lân Dũng, 2000, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục.
[7]. Phạm Thị Ánh Hồng,, 2003, Kỹ thuật sinh hóa,NXB Đại học Quốc gia Tp HCM.
[8]. Phạm Thị Ánh Hồng, 2008, Tài liệu thực tập kỹ thuật sinh hóa, Bộ môn Sinh hóa-Khoa sinh học-Trường KHTN TpHCM.
[9]. Bùi Đoàn Phượng Linh, 2008, Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp protease và amylase bởi nấm mốc trên môi trường là phế phụ liệu công nghiệp và một số ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ sinh học - Trường Đại học
KHTN Tp HCM,
[10]. Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, và cộng sự, 2001, Thực tập vi sinh cơ sở, NXB Đại học quốc gia Tp HCM.
[11]. Nguyễn Thị Hồng Loan, 2003, Nghiên cứu tận dụng bã khoai mì sản xuất chế phẩm amylase và protease, Luận văn Thạc sĩ khoa học - Trường Đại học KHTN Tp HCM.
[12]. Nguyễn Đức Lượng, 1998, Công nghệ sinh học,Trường Đại học Kỹ thuật Tp HCM.
[13]. Nguyễn Đức Lượng, 2002, Công nghệ vi sinh - tập 2, Nxb Đại học Quốc gia Tp HCM.
[14]. Nguyễn Đức Lượng, 2004, Công nghệ enzyme, Nxb Đại học Quốc gia Tp HCM
[15]. Nguyễn Đức Lượng, và các tác giả, 2003, Thí nghiệm công nghệ sinh học - tập 2 - Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp HCM,
[16]. Lê Thanh Mai, 2005, Các phương pháp phân tích ngành công nghê lên men, NXB Khoa học và kỹ thuật.
[17]. Nguyễn Văn Mùi, 2001, Thực hành hóa sinh học, NXB Hà Nội.
[18]. Lao Thị Nga, 1987, Kỹ thuật sản xuất nấm men bánh mì và một số loại nấm ăn, NXB Tp HCM.
[19]. Lương Đức Phẩm, 1998, Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
[20]. Lương Đức Phẩm, 2000, Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
[21]. Lương Đức Phẩm, 2006, Nấm men công nghiệp,NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
[22]. Võ Viết Phi, 2005, Nghiên cứu thu nhận enzyme glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus kawasaki trên môi trường bán rắn, Luận văn Thạc sĩ
Khoa học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Tp HCM.
[23]. Trần Kim Quy, và cộng sự, 2002, Hóa sinh học đại cương,NXB Đại học Quốc gia TpHCM.
[24]. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên, Giáo trình sinh hóa hiện đại, NXB Giáo dục.
[25]. Nguyễn Xuân Thắng, Đào Kim Chi, Phạm Quang Tùng, và cộng sự, 2004, Hóa sinh học, Hà Nội, NXB Y học.
[26]. Nguyễn Xuân Thành, 2006, Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục.
[27]. Đồng Thị Thanh Thu, 2007, Giáo trình sinh hóa cơ bản, Ban xuất bản Đại học KHTN Tp HCM.
[28]. Đồng Thị Thanh Thu, 2006 Hóa sinh ứng dụng: NXB Đại học Quốc gia Tp HCM.
[29]. Trần Linh Thước, 2001, Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp HCM.
[30]. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, và cộng sự, 1982,
Enzyme vi sinh vật - tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.
[31]. Trần Quốc Tuấn, 2007, Tận dụng phế phụ liệu giàu glucid tạo các sản phẩm có giá trị, Luận văn thạc sĩ Khoa học - Trường Đại học KHTN Tp
HCM.
Tài liệu tiếng nước ngoài
[32]. Adoki.A, 2002, Culture characteristics of candida sp in waste conversion: Implications for single-cell-protein-Enriched feed supplement production, Applied science & Environmental Management,
Vol 6(No 2): p, 49-58.
[33]. Anupama, Pogaku Ravindra, 2001, Studies on production of single cell
protein by Aspergillus niger in solid state fermentation of rice bran,
Brazilia archives of Biology & Technology, Vol 44(No 1): p, 79-88. [34]. C.R.D. Pamboukian, M.C.R. Facciotti and W. Schmidell, 1998,
Relationship between morphology, rheology and glucoamylase production by Aspergillus awamori in submerged cultures.
[35]. Chellapandi Paulchamy Ph.D, 2008, Solid-state cultivation of Aspergillus niger NCIM 548 for glucoamylase production on groundnut shell The Internet Journal of Microbiology vol 5(1).
[36]. Dariush Norouzian, Azim Akbarzadeh, Jeno M, Scharer, et al., 2005,
[37]. Emma Weir, Colette McSpadden, Production of industrial enzyme in fermentation.
[38]. Fabiana Carina Pavezzi, Eleni Gomes, Roberto da Silva, 2008,
Production and characterization of glucoamylase from fungus Aspergillus awamori expressed in yeast Saccharomyces cerevisiae using different carbon sources, Brazilian Journal of Microbiology, vol 39(1).
[39]. H.Pedersen, M.Beyer, J.Nielsen, 2000, Glucoamylase production in batch, chemostat and fed-batch cultivation by an industrial strain of Aspergillus niger, Appl Microbiol Biotechnol, 53: p, 272-277.
[40]. Haq Nawaz Bhatti, Mohammad Hamid Rashid, Abdul Jabbar, 2007,
Optimization of media for enhanced glucoamylase production in solid state fermentation by Fusarium solani, Food Technol, - Biotechnol, Vol
45(1): p. 51-56.
[41]. Hema Anto, U,B, Trivedi, K,C, Patel, Glucoamylase production by solid-state fermentation using riceflake manufacturing waste products as substrate.
[42]. Ikram-ul-Haq, H,Ashraf, S,Omar, et al,, 2002, Biosynthesis of amyloglucosidase by Aspergillus niger using wheat bran as substrate,
Pakistan Journal of Biological Sciences, vol 5(9): p. 962-964.
[43]. Lagzouli Mohamed, Mennane Zakaria, Jadal Mohamed, et al,, 2007,
Optimization of growth and extracellular glucoamylase production by Candida famata isolate, African Journal Biotechnology, vol 6(22): p.
2590-2595.
[44]. M.M.Haider, N.N.El-Tajori, S,H,Baiu, Single cell protein production from carob pod extract by the yeast Saccharomyces cerevisiae.
[44]. M.Yakoub, Khan, M.Umar Dahot, 2010, Effect of various agriculture wastes and pure sugar on the production of single-cell-protein by Penicillium expansum, World Applied Science Journal, vol 8 (Special
[46]. M.Yakoub, Khan, M.Umar Dahot, M.Yousuf Khan, 2010, Single-cell- protein production by Penicillium javanicum from pretreated rice husk.
[47]. Maria Liakopoulou-Kiriakides, Athanasios Karakatsanis, Michael Stamatoudis, et al., 2001, Synergistic Hydrolysis of crude corn starch by
alpha amylase and glucoamylase of various origins, Cereal Chemistry,
vol 78(5): p. 603-607.
[48]. Maurine Raimbault, 1998, General and microbiological aspects of solid
substrate fermentation, EJB Electronic Journal of Biotechnology, vol
1(3).
[49]. Miller G.L, 1959, Use of DNS reagent for measurement of reducing sugar, Anal, Chem, 31.
[50], Neji Gharsallaha, 1993, Production of single cell protein from olive mill
waste water by yeasts.
[51]. Oznur Koc, Kubilay Metin, 2007, Purification and characterization of the thermostable glucoamylase produced by Aspergillus flavus HBF34,
African Journal Biotechnology, vol 9(23): p. 3414-3424.
[52]. PandeyAshok, Selvakumar P., Soccol Calos R, et al., Solid state fermentation for the production of industrial enzymes,
[53]. Qunhui Wang, Xiaoqiang Wang, Xuming Wang, et al., 2008,
Glucoamylase production from food waste by Aspergillus niger under submerged fermentation, Process biochemistry vol 43: p. 280-286.
[54]. S.Nahar, F,Hossain, B.Feroza, et al., 2008, Production glucoamylase by
Rhizopus sp in liquid culture, Pak.J.Bot, vol 40(4): p.1693-1698.
[55]. Telma Elita Bertolin, Willibaldo Schmidell, and et al, 2003, Influence of
carbon, nitrogen and Phosphorous sources on glucoamylase production by Aspergillus awamori in solid state fermentation.
[56]. Tiradoacevedo, Oscar, 2004, Characterization of microorganisms with carbohydrase activities from tropical ecosystems, Master Thesis -
[57]. Tsuei-Yun Fang, Clark Ford, 1998, Protein engineering of Aspergillus awamori glucoamylase to increase its pH optimum, Protein engineering,
vol 11(5): p. 383-388.
[58]. W.Suntornsuk, Y.D.Hang, 1997, Purification and characterization of glucoamylase from a Rhizopus oryzae mutant, J.Sci.Soc.Thailand, vol
23: p.199-208.
Tài liệu internet
[59] http://www,brc,dcs,gla,ac,uk/~drg/courses/bioinformatics_mscIT/slides/slides9/sld007,htm [60] http://www,bpe,wur,nl/UK/Research/Dissertations/Enzymatic+starch+hydrolysis/ Enzymatic+starch+hydrolysis+background/ [61] http://www,fotosearch,com/IDX032/312790/ [62] http://www,bio,nite,go,jp/ngac/aa1,html [63] http://www,mycology,adelaide,edu,au/gallery/zygomycetes/rhizopus2,gif
PHỤ LỤC
1. Đường chuẩn glucose
Bảng 5.1: Tương quan nồng độ glucose và DOD540nm
Đồ thị 5.1: Đường chuẩn glucose Nồng độ glucose
(mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
2. Đường chuẩn Bradford
Bảng 5.2: Tương quan giữa nồng độ Albumin và giá trị OD 595nm Nồng độ Albumin (mg/ml) 0 10 20 30 40 50
DOD595nm 0 0,03555 0,061 0,0925 0,1265 0,155
3. Đường chuẩn mật độ tế bào nấm men
Bảng 5.3: Tương quan giữa mật độ tế bào và giá trị OD 610nm
OD 610nm 0,135 0,212 0,330 0,412 0,505
Số lượng tế bào TB 7 11 17,2 35 51,8 Số lượng tế bào/ml (*106) 1,75 2,75 4,30 8,75 12,95 lgx 6,243 6,439 6,633 6,942 7,112
4.Đường chuẩn mật độ bào tử nấm mốc
Bảng 5.4: Tương quan giữa mật độ bào tử nấm mốc vá giá trị OD 610nm
OD 610nm 0,09 0,23 0,310 0,42 0,52
Số lượng tế bào TB 2,4 4,2 6,0 8,4 10,8 Số lượng tế bào/ml (*106) 0,6 1,05 1,5 2,1 2,7 lgx 5,778 6,021 6,176 6,322 6,431
5. Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi
Asp,awamori
Bảng 5.5: Biến thiên hoạt độ enzyme glucoamylase theo thời gian nuôi
Asp.awamori Thời gian nuôi cấy (h) Pha loãng (lần) V (ml) ODk ODt DOD Hoạt tính GA (UI/ml dd E) Hoạt tính GA (UI/g CT) Hoạt tính GA TB (UI/g CT) SD 24 1 100 1,208 1,304 0,096 0,036 0,182 0,147 0,031 1 100 1,226 1,29 0,066 0,025 0,125 1 100 1,214 1,284 0,070 0,027 0,133 30 1 100 1,197 1,417 0,220 0,083 0,417 0,381 0,031 1 100 1,215 1,405 0,190 0,072 0,360 1 100 1,203 1,397 0,194 0,073 0,367 36 10 100 0,498 1,328 0,830 3,146 15,729 16,120 0,614 10 100 0,498 1,332 0,834 3,161 15,804 10 100 0,522 1,41 0,888 3,366 16,828 42 20 100 0,636 1,456 0,820 6,216 31,078 30,952 0,219 20 100 0,616 1,426 0,810 6,140 30,699 20 100 0,614 1,434 0,820 6,216 31,078 48 20 100 0,539 1,524 0,985 7,466 37,332 37,471 0,209 20 100 0,552 1,538 0,986 7,474 37,370 20 100 0,555 1,55 0,995 7,542 37,711 54 20 100 0,539 1,652 1,113 8,437 42,183 42,095 0,079 20 100 0,547 1,656 1,109 8,406 42,031 20 100 0,548 1,658 1,110 8,414 42,069 60 20 100 0,549 1,451 0,902 6,840 34,202 34,469 0,304 20 100 0,557 1,465 0,908 6,881 34,404 20 100 0,558 1,476 0,918 6,960 34,800 66 20 100 0,549 1,27 0,721 5,465 27,326 27,381 0,141 20 100 0,562 1,282 0,720 5,455 27,276 20 100 0,565 1,292 0,727 5,508 27,541 72 5 100 0,572 1,454 0,882 1,671 8,357 8,392 0,060 5 100 0,599 1,481 0,882 1,671 8,357 5 100 0,588 1,481 0,893 1,692 8,461