Nghiên cứu đặc tính enzyme cellulase và sự sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm trichoderma trên môi trường lỏng

Tr-ờng đại học vinh khoa hóa học === === đồ án tốt nghiệp Đề tài: NGHIấN CU C TNH ENZYME CELLULASE VÀ SỰ SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE TỪ NẤM TRICHODERMA TRÊN MƠI TRƢỜNG LỎNG GV h-íng dÉn : xuân ThS đào SV thực : Lấ TH DUNG thị Lớp : 49K - Công nghệ thực phẩm M· sè SV : 0852040455 VINH - 12/2012 Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Khóa MSV Ngành : : : : Lê Thị Dung 49K - Hóa Thực Phẩm 0852040455 Công nghệ thực phẩm Tên đề tài Nghiên cứu đặc tính enzyme cellulase sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: - Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm Trichoderma sinh hoạt tính cellulase cao - Bản chất trình sinh tổng hợp enzyme cellulase  Nghiên cứu thời gian thu nhận thích hợp  Nghiên cứu nhiệt độ thích hợp để thu nhận enzyme  Nghiên cứu nồng độ chất thích hợp  Nghiên cứu pH thích hợp cho trinh sinh tổng hợp - Nghiên cứu tinh enzyme cellulase - Nghiên cứu đặc tính enzyme c ellulase từ Trichoderma:  Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính c ellulase từ Trichoderma  Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến hoạt tính c ellulase từ Trichoderma Cán hướng dẫn : Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày hoàn thành đồ án : ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày tháng năm 2012 Ngày tháng năm 2012 Ngày Chủ nhiệm môn tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng năm 2012 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) SVTT: Lê Thị Dung i Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Khóa MSV Ngành Cán hướng dẫn Cán duyệt : : : : : : Lê Thị Dung 49K - Hóa Thực Phẩm 0852040455 Cơng nghệ thực phẩm ThS Đào Thị Thanh Xuân Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán hƣớng dẫn: Ngày tháng năm 2012 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) SVTT: Lê Thị Dung ii Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XẾT TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên Khóa MSV Ngành Cán hướng dẫn Cán duyệt : : : : : : Lê Thị Dung 49K - Hóa Thực Phẩm 0852040455 Cơng nghệ thực phẩm ThS Đào Thị Thanh Xuân Nội dung nghiên cứu, thiết kế: Nhận xét cán duyệt: Ngày tháng năm 2012 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) SVTT: Lê Thị Dung iii Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH VẼ viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ix LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu 3 Vật liệu, phạm vi nội dung nghiên cứu 4 Ý nghĩa khoa học đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm Trichoderma 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái Trichoderma 1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.3.1 Môi trường sống 1.1.3.2 Chất chuyển hóa thứ cấp kháng sinh 1.1.3.3 Khả kiểm soát sinh học Trichoderma 1.1.4 Dinh dưỡng đường trao đổi chất Trichoderma 1.1.5 Ảnh hưởng yếu tố bên lên phát triển nấm Trichoderma 11 1.2 Enzyme cellulase 12 1.2.1 Định nghĩa , phân loại 12 1.2.2 Cấu trúc cellulase 13 1.2.3 Tính chất hệ enzyme cellulase 15 1.2.4 Cơ chế tác động hệ enzyme cellulase 16 1.2.4.1 Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) 16 1.2.4.2 Cơ chế 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) 16 1.2.4.3 Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) 17 SVTT: Lê Thị Dung iv Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp 1.3 Cơ chất hệ enzyme cellulase 18 1.3.1 Cellulose 18 1.3.1.1 Khái niệm cấu trúc 18 1.3.1.2 Thành phần sinh khối thực vật 19 1.3.2 Carboxymethyl cellulose (CMC) 21 1.4 Ứng dụng enzyme cellulase 22 1.4.1 Trong công nghiệp 22 1.4.2 Trong nông nghiệp 22 1.4.3 Trong y dược 23 1.4.4 Trong công nghệ chế biến thực phẩm 23 1.4.5 Trong sản xuất cồn 24 1.4.6 Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 25 1.4.7 Trong công nghiệp tẩy rửa 25 1.4.8 Trong sản xuất nhiên liệu sinh học 25 1.5 Các phương pháp làm enzyme 25 1.5.1 Phương pháp kết tủa đẳng điện 25 1.5.2 Kết tủa phân đoạn muối trung tính (NH4)2SO4 để tách enzyme 26 1.5.3 Kết tủa enzyme dung môi hữu 26 1.5.4 Kết tủa polymer có khối lượng phân tử cao 26 1.5.5 Thay đổi thành phần hóa học mơi trường để làm enzyme 27 1.5.6 Phương pháp sắc ký 27 1.5.7 Phân tách lỏng - lỏng 28 1.6 Các nguồn thu nhận cellulase 28 1.6.1 Nấm mốc 28 1.6.2 Vi khuẩn xạ khuẩn 29 1.7 Tình hình nghiên cứu thu nhận cellulase từ Trichoderma 30 1.7.1 Tình hình nghiên cứu giới 30 1.7.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 31 Phần VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Vật liệu 33 2.2 Hóa chất thiết bị 33 SVTT: Lê Thị Dung v Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp 2.2.1 Hóa chất 33 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 35 2.3 Các môi trường nuôi cấy 35 2.3.1 Môi trường giữ giống PDA (Potato Glucose Agar): 35 2.3.2 Môi trường tuyển chọn 35 2.4 Phương pháp nghiên cứu 35 2.4.1 Phương pháp cấy chuyền giữ giống 35 2.4.2 Phương pháp nuôi Trichoderma thu cellulase môi trường lỏng 35 2.4.3 Xác định hoạt độ cellulase 36 2.4.4 Phương pháp xác định đường khử Dinitro salicylic acid (DNS) 36 2.4.5 Phương pháp nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp cellulase từ nấm Trichoderma môi trường lỏng 37 2.4.5.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp cellulase 37 2.4.5.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tổng hợp cellulase 38 2.4.5.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp cellulase 38 2.4.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất đến sinh tổng hợp cellulase 38 2.4.6 Nghiên cứu tinh enzyme cellulase 38 2.4.7 Đặc tính enzyme cellulase từ Trichoderma 40 2.4.7.1 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cellulase từ Trichoderma 40 2.4.7.2 Phương pháp xác định pH tối ưu cellulase từ Trichoderma 40 Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Nghiên cứu phân lập chủng Trichoderma có khả sinh tổng hợp cellulase 41 3.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC môi trường lỏng 42 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 42 SVTT: Lê Thị Dung vi Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC 43 3.2.3 Ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC 44 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ chất đến trính sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC 46 3.3 Nghiên cứu số đặc tính cellulase từ Trichoderma 020NC 47 3.3.1 Nghiên cứu tinh cellulase 47 3.3.2 Nghiên cứu nhiệt độ tối ưu enzyme cellulase 48 3.3.3 Nghiên cứu pH tối ưu enzyme cellulase 49 KẾT LUẬN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 SVTT: Lê Thị Dung vii Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Sự phát triển nấm Trichoderma đĩa thạch (a) hình dạng sợi nấm Trichoderma (b) Hình 1.2: Cấu trúc Cellulase (1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase) với xoắn K (màu đỏ); xoắn β (màu vàng) nối β (màu xanh) 14 Hình 1.3: Các nguyên tử calcium có cellulase (1,4-β-D-glucancellobiohydrolase) vị trí Glu 295 Glu 325 hai chuỗi A B 15 Hình 1.4: Cơ chế hoạt động exoglucanase 16 Hình 1.5: Cơ chế hoạt động endoglucanase 17 Hình 1.6: Cơ chế hoạt động β-glucosidase 17 Hình 1.7: Quá trình phân giải cellulose cellulase 17 Hình 1.8: Cấu trúc cellulose vách tế bào thực vật 20 Hình 1.9 Carboxymethyl cellulose 21 Hình 3.1: Đường chuẩn Glucose 41 Hình 3.2: Hoạt tính chủng Trichoderma .42 Hình 3.3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp cellulase chủng Trichoderma 020NC 43 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp cellulase 44 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH lên trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma Atroviried 020NC 45 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chất lên trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC .46 Hình 3.7 Ảnh hưởng dung mơi amoni sulfat tỷ vệ VE/Vdm lên hoạt tính cellulase chế phẩm thô chiết tách từ nấm Trichoderma Atroviried 020NC .47 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulasechiết tách từ nấm Trichoderma Atroviried 020NC 48 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase chiết tách từ nấm Trichoderma Atroviried 020NC 49 SVTT: Lê Thị Dung viii Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Đặc tính cấu trúc 1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase 13 Bảng 2.1 Giá trị pH dung dịch đệm citrat 34 Bảng 2.2 Giá trị pH dung dịch đêm phosphate 34 Bảng 2.3 Nồng độ Glucose xây dựng đường chuẩn 37 Bảng 3.1: Khả sinh tổng hợp cellulase chủng Trichoderma .41 Bảng 3.2 Khả sinh tổng hợp cellulase nấm Trichoderma 020NC .42 Bảng 3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp cellulase Trichoderme 020NC 44 Bảng 3.4 Ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma Atroviried 020NC 45 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chất đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC .46 Bảng 3.6 Sự biến thiên hoạt độ cellulase tác nhân amoni sulfat 47 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase 48 Bảng 3.8 Sự biến thiên hoạt độ cellulase theo pH .49 SVTT: Lê Thị Dung ix Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp 2.4.7 Đặc tính enzyme cellulase từ Trichoderma 2.4.7.1 Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu cellulase từ Trichoderma Sử dụng dịch chiết enzyme tủa với tác nhân thích hợp để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase Xác định hoạt tính cellulase nhiệt độ 20 - 50oC (hút dịch enzyme ổn nhiệt nhiệt độ cần khảo sát 24h sau xác định hoạt tính enzyme cellulase (mục 2.4.3) Từ vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên hoạt tính enzyme nhiệt độ, suy nhiệt độ tối ưu (top) cellulase chiết tách từ Trichoderma 2.4.7.2 Phương pháp xác định pH tối ưu cellulase từ Trichoderma Chuẩn bị dung dịch đệm citrat pH khác (từ - 6) dung dịch đệm phosphate pH =7 Sau tủa enzyme tác nhân thích hợp ta tiến hành hòa tan tủa dung dịch đệm citrat đệm phosphate pH khác (thể tích dung dịch đệm thể tích enzyme thơ) Tiến hành xác định hoạt tính enzyme cellulase (mục 2.4.3), nhiệt độ thực nghiệm nhiệt độ tối ưu Dựng đường biểu diễn biến thiên hoạt độ enzyme cellulase pH Suy pH tối ưu (pH op) enzyme cellulase chiết tách từ Trichoderma SVTT: Lê Thị Dung 40 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp Phần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng Trichoderma có khả sinh tổng hợp cellulase Các chủng Trichoderma nuôi cấy môi trường tuyển chọn (mục 2.3.2) nhiệt độ phòng, lắc máy lắc với tốc độ 180 v/p, lấy mẫu thời điểm 3,4,5 ngày Những chủng xác định có hoạt tính mơi trường ni cấy có sản phẩm glucose Dịch ni cấy xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp định lượng đường khử Dinitrosalicylic acid (DNS) Đường chuẩn glucose thể mối tương quan giá trị mật độ quang (OD) với nồng độ glucose (mg/ml) bước sóng 540 nm y = 2.3559x - 0.2393 R2 = 0.9964 OD 1.5 0.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 nong glucose Hình 3.1: Đường chuẩn Glucose Từ thực nghiệm ta thu kết sau: Bảng 3.1: Khả sinh tổng hợp cellulase chủng trichoderma Chủng Hoạt tính cellulase (IU = μmol/ml/phút) Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ 020NC 0.102 0.121 0.11 1.109 069QX 0.096 0.096 0.087 0.084 007ND 0.096 0.104 0.102 0.098 011NL 0.09 0.091 0.079 0.073 Vn1491 0.054 0.055 0.054 0.051 Vn1072 0.112 0.117 0.012 0.094 SVTT: Lê Thị Dung 41 Lớp: 49 K - CNTP 0.121 0.096 0.104 0.117 0.091 n1 07 V n1 49 V L 01 1N D 00 7N 02 0N X 0.055 06 9Q 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 C Hoạt tính cellulase Đồ án tốt nghiệp chủng Trichoderma Hình 3.2: hoạt tính chủng trichoderma Nhận xét: Kết cho thấy tìm chủng Trichoderma có khả sinh tổng hợp cellulase 020NC, 007NĐ, 069QX Vn1072 Trong chủng chúng tơi chọn chủng 020NC để nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase môi trường lỏng 3.2 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC mơi trƣờng lỏng 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy Để nghiên cứu ảnh hướng thời gian đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020Nc tiến hành nuôi chủng Trichoderma 020NC môi trường tuyển chọn có bổ sung chất CMC, lắc máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút nhiệt độ phịng Xác định hoạt tính cellulase thời điểm khác q trình ni cấy theo phương pháp định lượng đường khử Dinitrosalicylic axit (DNS) (mục 2.4.3) Từ thực nghiệm thu kết bảng sau: Bảng 3.2 Khả sinh tổng hợp cellulase nấm Trichoderma 020NC Thời gian (ngày) Mật độ quang (OD) 1.0623 Hoạt độ enzyme cellulase (IU = 0.012 μmol/ml/phút) SVTT: Lê Thị Dung 42 1.2959 1.1649 1.1532 0.121 0.11 0.109 Lớp: 49 K - CNTP hoạt tính cellulase Đồ án tốt nghiệp 0.125 0.12 0.115 0.11 0.105 0.1 0.095 0.09 0.121 0.11 0.109 0.102 Thời gian Hình 3.3: Khảo sát ảnh hưởng thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp cellulase chủng trichoderma 020NC Nhận xét - Hoạt tính cellulase từ nấm Trichoderma Atroviried 020NC có hoạt tính cao ngày thứ q trình ni cấy Hoạt tính tăng mạnh ngày đầu nuôi cấy, giảm mạnh sau ngày nuôi cấy - Qua ta chọn thời gian thích hợp để thu enzyme cellulase cao nuôi cấy nấm Trichoderma Atroviried 020NC môi trường lỏng ngày thứ q trình ni cấy 3.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC Nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng phát triển hầu hết chủng Trichoderma khoảng 25-300C Ở nhiệt độ cao thấp trình sinh trưởng Ở nhiệt độ mà nấm phát triển tốt trình sinh tổng hợp tốt Để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC, tiến hành nuôi Trichoderma 020NC môi trường tuyển chọn nhiệt độ khác từ 20 - 450C , lắc máy lắc với tốc độ 180 v/p SVTT: Lê Thị Dung 43 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp Thu dịch enzyme ngày thứ xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp định lượng đường khử Dinitrosalicylic axit (DNS) (mục 2.4.3) Từ thực nghiệm thu kết sau: Bảng 3.3: ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp cellulase Trichoderme 020NC Nhiệt độ (0C) Mật độ quang (OD) Hoạt tính cellulase (IU = Hoạt tính cellulase μmol/ml/phút) 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 20 25 30 35 40 45 1.0419 1.1579 1.6079 1.4763 0.9876 0.101 0.11 0.145 0.135 0.096 0.145 0.101 0.135 0.11 0.096 20 25 30 35 40 45 Nhiệt độ Hình 3.4 ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp cellulase Nhận xét: Từ kết nhận thấy rằng: Hoạt tính cellulase cao nhiệt độ ni cấy 300C giảm mạnh 400C đến 450C q trình sinh tổng hợp cellulase khơng diễn Như nhiệt độ tối ưu cho trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma Atroviried 020NC 300C 3.2.3 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC Chủng Trichoderma 020NC nuôi cấy mơi trường tuyển chọn (mục 2.3.2) có giá trị pH khác từ - (điều chỉnh pH môi trường cách sử SVTT: Lê Thị Dung 44 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp dụng đêm citrat đệm phosphat có pH tương ứng), lắc máy lắc với tốc độ 180 v/p nuôi nhiệt độ tối ưu khảo sát (mục 3.2.2) Tiến hành lấy mẫu thời điểm sinh tổng hợp cellulase cao (mục 3.2.1) Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp định lượng đường khử Dinitro salicylic axit (DNS) (mục 2.4.3) Từ thực nghiệm thu kết sau: Bảng 3.4 ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma Atroviried 020NC pH Mật độ quang (OD) Hoạt tính 0.9873 1.0085 1.1423 1.1357 1.3024 1.1435 0.096 0.098 0.109 0.108 0.121 0.109 cellulase hoạt tính cellulase (IU = μmol/ml/phút) 0.14 0.12 0.1 0.096 0.098 0.121 0.109 0.108 0.109 0.08 0.06 0.04 0.02 pH Hình 3.5 ảnh hưởng pH lên trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma Atroviried 020NC Nhận xét: Từ kết cho thấy: Trong mơi trường pH = sinh tổng hợp cellulase cao Như pH tối ưu cho trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma SVTT: Lê Thị Dung 45 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp 3.2.4 Ảnh hƣởng nồng độ chất đến trính sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC Chủng Trichoderma 020NC nuôi cấy mơi trường tuyển chọn (mục 2.3.2) có nồng độ chất CMC khác từ 0.1 - 2.5, lắc máy lắc với tốc độ 180 v/p nuôi nhiệt độ tối ưu khảo sát (mục3.2.2) 300C Tiến hành lấy mẫu thời điểm sinh tổng hợp cellulase cao (mục3.2.1) Xác định hoạt tính enzyme cellulase theo phương pháp định lượng đường khử Dinitro salicylic axit (DNS) (mục 2.4.3) Từ thực nghiệm thu kết sau: Bảng 3.5 ảnh hưởng nồng độ chất đến trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC Nồng độ chất (%) 0.1 Mật độ quang (OD) = μmol/ml/phút) hoạt tính cellulase 0.5 1.5 2.5 0.89445 1.2656 1.4251 1.6253 1.2979 1.1622 0.9502 Hoạt tính cellulase (IU 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0.2 0.089 0.118 0.131 0.147 0.121 0.11 0.093 0.147 0.118 0.131 0.121 0.11 0.093 0.089 0.1 0.2 0.5 1.5 2.5 nồng độ chất Hình 3.6 ảnh hưởng nồng độ chất lên trình sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC Nhận xét: Ở mơi trường có nồng độ chất CMC % sinh tổng hợp cellulase Trichoderma Atroviried 020NC cao SVTT: Lê Thị Dung 46 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp 3.3 Nghiên cứu số đặc tính cellulase từ Trichoderma 020NC 3.3.1 Nghiên cứu tinh cellulase Mục đích tinh enzyme loại bỏ tạp chất, cặn mịn, protein không hoạt động khỏi dịch enzyme thơ nhằm thu dịch enzyme có độ tinh khiết cao Thuận lợi cho nghiên cứu sau Nấm Trichoderma 020NC nuôi cấy môi trường tuyển chọn (mục 2.3.2.) nhiệt độ 300C, lắc máy lắc với tốc độ 180 v/p Sau ngày nuôi cấy lọc lấy dịch kết tủa tác nhân dung dịch muối amoni sunfat bảo hòa 65%, tỷ lệ VE/Vdm từ 1:2 đến 1:5 (VE thể tích enzyme thơ Vdm thể tích dung mơi tủa) sau ly tâm tách dịch 40C với vận tốc 4000 v/phút thời gian 15 phút Hịa tan kết tủa nước cất với thể tích thể tích enzyme thơ ban đầu Xác định hoạt tính cellulase sau tinh (mục 2.4.3) Từ thực nghiệm thu kết sau: Bảng 3.6 Sự biến thiên hoạt độ cellulase tác nhân amoni sulfat Tỷ lệ (VE/Vdm) Mật độ quang (OD) Hoạt tính enzyme (IU = μmol/ml/phút) 1:2 1:3 1:4 1:5 1.2301 1.7250 1.4138 1.047 0.116 0.154 0.130 0.101 hoạt tính cellulase 0.2 0.154 0.15 0.13 0.116 0.101 0.1 0.05 TL 1:2 TL 1:3 TL 1:4 TL 1:5 tỷ lệ dịch enzyme/dung mơi Hình 3.7 Ảnh hưởng dung môi amoni sulfat tỷ vệ VE/Vdm lên hoạt tính cellulase chế phẩm thơ chiết tách từ nấm Trichoderma Atroviried 020NC SVTT: Lê Thị Dung 47 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp Nhận xét: Enzyme cellulase chiết tách từ Trichoderma Atroviried 020NC tủa muối amoni sulfat bảo hòa 65% có hoạt tính cao tỷ lệ 1:3 (1 thể tích dịch chiết enzyme, thể tích dung mơi), thấp dần tỷ lệ 1:4, 1:5 3.3.2 Nghiên cứu nhiệt độ tối ƣu enzyme cellulase Mỗi enzyme thu từ lồi, chủng khác có dải nhiệt độ hoạt động khác Và enzyme có khoảng nhiệt độ tối ưu, mà hoạt tính đạt cao nhât Khi nhiệt độ cao thấp hoạt tính đề giảm Để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên cellulase tách chiết từ nấm Trichodermad 020NC tiến hành ủ enzyme tinh nhiệt độ 200C - 450C 24 giờ, sau đưa xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp định lượng đường khử Dinitro salicylic axit (DNS) (mục 2.4.3) Từ thực nghiệm thu kết quả: Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase Nhiệt độ Mật độ quang (OD) Hoạt tính cellulase (IU = μmol/ml/phút) 20 25 30 35 40 45 1.2695 1.4357 1.7029 1.3542 0.9875 0.119 0.132 0.153 0.125 0.096 hoạt tính cellulase 0.2 0.153 0.15 0.119 0.132 0.125 0.096 0.1 0.05 0 20 25 30 35 40 45 nhiệt độ Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulasechiết tách từ nấm Trichoderma Atroviried 020NC SVTT: Lê Thị Dung 48 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp Nhận xét: Dựa vào kết nhận thấy rằng: hoạt tính enzyme cellulase cao nhiệt độ 30oC, giảm dần nhiệt độ tăng lên hoạt tính 450C Như vậy, nhiệt độ tối ưu enzyme cellulase 30oC 3.3.3 Nghiên cứu pH tối ƣu enzyme cellulase Mỗi enzyme thu từ loài, chủng khác có dải pH hoạt động khác Và enzyme có pH tối ưu, mà hoạt tính đạt cao Khi pH cao thấp hoạt tính giảm Để nghiên cứu ảnh hưởng pH đến hoạt độ cellulase, tiến hành hòa tan kết tủa (kết tủa sau ly tâm tinh sạch) dung dịch đệm có pH từ 3-8 với thể tích thể tích enzyme thơ ban đầu, ủ nhiệt độ 300C 20 phút, sau đưa xác định hoạt độ cellulase theo phương pháp định lượng đường khử Dinitro salicylic axit (DNS) Kết thu bảng 3.8 Bảng 3.8 Sự biến thiên hoạt độ cellulase theo pH pH Mật độ quang (OD) Hoạt tính cellulase hoạt tính cellulase (IU = μmol/ml/phút) 0.14 0.12 0.1 0.9962 1.1086 1.1639 1.1569 1.2754 1.1703 0.097 0.106 0.11 0.109 0.12 0.102 0.097 0.106 0.11 0.109 0.12 0.102 0.08 0.06 0.04 0.02 pH Hình 3.9 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase chiết tách từ nấm Trichoderma Atroviried 020NC Nhận xét: Từ kết thu thấy pH tối ưu enzyme cellulase thu nhận từ nấm Trichoderma SVTT: Lê Thị Dung 49 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp KẾT LUẬN Kết xác định hoạt độ tập hợp gồm chủng Trichoderma cho thấy hầu hết chủng có hoạt tính cellulase Tuy nhiên, khả sinh tổng hợp cellulase chủng không giống - Đã tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase cao 020NC, 069QX, 007NĐ Vn1072 - Nghiên cứu sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma 020NC thu kết sau:  Thời gian thu nhận thích hợp ngày  Nhiệt độ tối ưu: 30oC  pH tối ưu:  Nồng độ chất tối ưu: CMC 1% - Nghiên cứu tinh enzyme muối trung tính amoni sulfat bảo hịa 65 %  Tỷ lệ thích hợp VE/Vdm = 1:3  Nhiệt độ tối ưu: 300C  pH tối ưu: SVTT: Lê Thị Dung 50 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Đức Lượng số tác giả, "Công nghệ enzyme", NXB Đại học quốc gia TP.HCM, 2004 [2] GS.TS Mai Xuân Lương, "Giáo Trình Enzyme", NXB Đại học Đà Lạt, 2005 [3] Nguyễn Thị Thu Sang, "Bài giảng Hóa Sinh học thực phẩm", Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM ,2011 [4] Nguyễn Văn Tuấn, Luận văn Thạc sỹ khoa học sinh học, "Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus Awamori sinh tổng hợp Endo-β-1,4-Glucanase đánh giá tính chất lý hóa Endo-β-1,4-Glucanase", NXB Đại học Thái Nguyên, 2009 [5] Ngô Văn Thu (2011), "Bài giảng dược liệu" Trường đại học Dược Hà Nội [6] Đỗ Tất Lợi (2004) "Những thuốc vị thuốc Việt Nam" Nhà xuất y học [7] Bùi Xuân Đồng, 1982 "Nhóm nấm Hyphomycetes Việt Nam" Tập I Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà nội [8] Bùi Xuân Đồng - Hà Huy Kế (1999), "Nấm mốc & phương pháp phòng chống" NXB KH & KT Hà Nội [9] Cao Cường (2000), "Khả kháng nấm bệnh phân giải lân khó tan số chủng Trichoderma" Khóa luận cử nhân Sinh Học, ĐH KHTN TP.HCM, pp.12 - 15 [10] Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), "Bảo vệ trồng chế phẩm từ vi nấm" NXB Nông Nghiệp [11] Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên (1998), "Giáo trình sinh hóa đại" NXB Giáo Dục [12] Đặng Thị Thu, "Công nghệ enzyme", NXB Khoa học kỹ thuật [13] Nguyên Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương, 1982: "Vi Nấm" - NXB KH & KT, Hà Nội [14] Lê Duy Thắng (2000) Phần „„cấu trúc màng tế bào vi sinh” - Vi Sinh - Sinh học phân tử, Khoa Sinh học, ĐH KHTN TP.HCM [15] Elad & Y, I.Chet, P.Boyle and Y.Hennis (1983), Parasitism of Trichoderma spp On Rhizoctonia solani & Sclerotium rolfsii scaning electron microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 - 88 SVTT: Lê Thị Dung 51 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp [16] Harman E.G, Kubicek P Christian (1998), Trichoderma & Gliocladium Vol pp 73 - 123 [17] Harran.S, Oppenheim.A, Chet.I.(1998), Induction of the Trichoderma herzianum chitinolytic system is triggered by the chitin monomer, N acetylglucosamine Mycological Research 102, pp 1224 - 1226 [18] Hutchinson, S.A, and M.E Cowan (1972) Identification and biological effects of volatile metabolites from cultures of Trichoderma harzinum Trans.Br Mycol Soc 59; 71-77 [19] Chet, I, G.E Harman, and R.Baker (1981), Trichoderma hamatum; Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani & Pythium spp Microb Ecol 7, pp 28 - 29 [20] Carsolio Carolina, Chet Ilan (1998), Role of the Trichoderma harzianum Endochitinase Gene, ech 42, in Mycoparasitism Applied and Environmental Microbiology, Mar 199, pp 929 - 935 [21] Bertrand, K.G and Jack, J P 1998 Molecular biotechnology principles and application of recombinant DNA 2nd edition, ASM Press Washington, D.C [22] Denis, C; Webster (1971), J Antagonistic properties of species - groups of Trichoderma production of volatile antibiotics, Trans Br Mycol Soc (84), pp 25 - 39 [23] Elad, Y I Chet and Y.Hennis (1983), Ultrastructural studies of the interaction between Trichoderma spp, and plant fungi [24] Elad, Chet I, Henusls Y (1982) Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum, J Can J Microbiol, 1982, 28: 719 - 725 [25] Esposito, E and Silva, M D 1998 Systematics and enviromental application of the genus Trichoderma, crical reviews in Microbiology 24 (2): 89 - 98 [26] Fridlender, M.; Inbar, J.; Chet, I (1993) Biological control of soiborne plant pathogens by a b-1,3 glucanase producing Pseudomonas cepacia Soil Biol Biochem, 25, 1211-1221 [27] Pak J Bot., 41(2): 907-916, 2009 CELLULASE BIOSYNTHES IS BY SELECTED TRICHODERMA SPECIES SVTT: Lê Thị Dung 52 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp [28] Jae Ho Do and Sang Dal Kim Enzymatic properties of a cellulase from Ganoderma lucidum Korea Ginseng and Tobaco Reasearch Institute, Daejeon 300-31, Korea [29] Minoru Kumakura, Masao Tamada, Noboru Kasai, and lsao Kaestu Enhancement of Cellulase Production by Immobilization of Trichoderma reesei Cells Department of Nutrition, Faculty of Domestic Science, Tokyo Kasei University, Kaga, Itabashi-ku, Tokyo, Japan Accepted for publication July 18, 1988 [30] Shazia Shafique, Rukhsana Bajwa and Sobiya Shafique Cellulase biosynthesis by selected trichoderma species Institute of Mycology and Plant Pathology, University of the Punjab, Quaid-e-Azam Campus Lahore, Pakistan [31] A.M Jackson, J M Whipps and J M Lynch (1991), Effects of temperature, pH and water potential on growth of four fungi with disease biocontrol potential, World Journal of Microbiology and Biotechnology volume (4), pp 494 - 501 [32] A A Shubakov and P S Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi Applied Biochemistry and Microbiology Vol 40 No 5, p.445-447 [33] Minoru Kumakura, Masao Tamada, Noboru Kasai, and lsao Kaestu Enhancement of Cellulase Production by Immobilization of Trichoderma reesei Cells Department of Nutrition, Faculty of Domestic Science, Tokyo Kasei University, Kaga, Itabashiku, Tokyo, Japan Accepted for publication July 18, 1988 [34] Shazia Shafique, Rukhsana Bajwa and Sobiya Shafique Cellulase biosynthesis by selected trichoderma species Institute of Mycology and Plant Pathology, University of the Punjab, Quaid-e-Azam Campus Lahore, Pakistan [35] ALI, Nagham1, YAZAJI, SABAH , HAJALI, A.2 and AZMEH, M.F Optimization of cellulase production by submerged fermentation of agriculture wastes by Trichoderma spp Department of Food Science, faculty of Agriculture, Damascus University [36] M M V Baig Cellulolytic enzymes of trichoderma lignorum produced on banana ogro-waste: optimisation of culture medium and conditions Journal of Scientific and Industrial Research, January 2005, pp 57-66 SVTT: Lê Thị Dung 53 Lớp: 49 K - CNTP Đồ án tốt nghiệp [37] J Environ Biol Optimization of solid state fermentation conditions for the production of cellulase by Trichoderma reesei Journal of Environmental Biology January 2012 [38] M.K Bakare1, I.O.Adewale, A Ajayi3, O.O.Shonukan3 Purification and characterization of cellulase from the wild-type and two improved mutants of Pseudomonas fluorescens Department of Biochemistry and Microbiology, Obafemi Awolowo University, Ile-Ife, Nigeria, 10 August, 2005 [39] Shazia Shafique, Rukhsana Bajwa and Sobiya Shafique Cellulase biosynthesis by selected trichoderma species Institute of Mycology and Plant Pathology, University of the Punjab, Quaid-e-Azam Campus Lahore, Pakistan SVTT: Lê Thị Dung 54 Lớp: 49 K - CNTP ... đề tài Nghiên cứu đặc tính enzyme cellulase sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: - Nghiên cứu lựa chọn chủng nấm Trichoderma sinh hoạt tính cellulase. .. trinh sinh tổng hợp - Nghiên cứu tinh enzyme cellulase - Nghiên cứu đặc tính enzyme c ellulase từ Trichoderma:  Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính c ellulase từ Trichoderma  Nghiên cứu. .. nhiều nghiên cứu khả sản xuất cellulase từ Trichoderma Reesei Vì vậy, tơi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu đặc tính enzyme cellulase sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm Trichoderma môi trƣờng lỏng"