Nghiên cứu đặc tính enzyme xylanase của nấm mốc aspergillus niger, tách dòng và biểu hiện gene mã hóa xylanase trên escherichia coli BL21

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ THƯƠNG THƯƠNG ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ENZYME XYLANASE CỦA NẤM MỐC ASPEGILLUS NINER, TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HÓA XYLANASE TRÊN ESCHERICHIA COLI BL21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN LIÊN HÀ HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà – phòng Vi sinh kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình bảo, truyền thụ cho kiến thức lòng say mê khoa học suốt trình nghiên cứu thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm truyền đạt cho kiến thức khoa học vô bổ ích suốt trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn thành viên phòng thí nghiệm Vi sinh kỹ thuật di truyền, phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ hướng dẫn gặp khó khăn làm thí nghiệm Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân, người động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội ngày 27/10/2010 Học viên: Nguyễn Thị Thương Thương Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ DNA Deoxyribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide TAE Tris-Acetate-EDTA TE Tris-EDTA EtBr Ethydium bromide EDTA Ethylen diamin tetra acetate CI Chloroform/isoamylalcohol SDS Sodium dodecyl sulphate 10 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 11 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 12 DNS Dinitrosalicylic acid 13 APS Ammonium persulfate 14 bp Base pair 15 kDa kilodalton 16 LB Luria Broth 17 TEMED Tetramethylethylenediamine 18 DTT Dithiothreitol 19 mRNA Messenger RNA 20 RT-PCR Reverse transcription PCR 21 E coli Escherichia coli 22 A niger Aspergillus niger 23 OD Optical density Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Các vi sinh vật sing tổng hợp xylanase 20 Bảng 1.2 Đặc tính số xylanase từ vi sinh vật 21 Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng cho phản ứng nhân gen 37 PCR Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Trang Tên hình Hình 1.1 Cấu trúc arabinoxylan cỏ Graminiae 10 Hình 1.2 Vị trí công enzyme vào xylan cỏ 12 Hình 1.3 Cấu trúc không gian chiều xylanase họ 10 từ 15 Bacillus haloduans Hình 1.4 Cấu trúc không gian chiều xylanase họ 11 16 Hình 1.5 Cơ chế phản ứng thủy phân xylan xylanase 17 Bacillus circulans Hình 2.1 Cấu trúc vector tách dòng, biểu pRSET A 31 Hình 2.2 Qui trình tinh xylanase tái tổ hợp 46 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ chất lên trình sinh 48 tổng hợp xylanase chủng Hình 3.2: Ảnh hưởng nhiệt độ lên trình sinh tổng hợp 49 xylanase chủng 10 Hình 3.3: Ảnh hưởng pH lên trình sinh tổng hợp 50 xylanase chủng 11 12 Hình 3.4: Điện di đồ DNA tổng số chủng B7 Hình 3.5: Điện di đồ sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại 51 54 gene mã hóa xylanase 13 Hình 3.6: So sánh trình tự gen mã hoá enzym xylanse 56 chủng B7 với đoạn gen mã hoá enzym xylanse công bố sở liệu NCBI với mã số EU423881.1 14 Hình 3.7: Trình tự nucleoti gen xynB nấm mốc 58 Aspergillus niger 15 Hình 3.8: Qui trình thực phản ứng PCR khuếch đại vùng 59 cds gen xylanase Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 16 Hình 3.9: Vị trí cắt enzym giới hạn gen xylanase 60 nấm mốc Aspergillus niger B7 17 Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại 61 exon gen xylanase 18 Hình 3.11:Điện di đồ sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại cds 63 gen xylanase 19 Hình 3.12: Điện di đồ tinh sản phẩm phản ứng PCR 63 khuếch đại cds gene xylanase 20 Hình 3.13: Điện di đồ sản phẩm cắt vector pRSET A 65 enzyme giới hạn 21 Hình 3.14: Khuẩn lạc E coli Top10 sau biến nạp vector 66 pRSET A gắn cds xylanase 22 Hình 3.15: Điện di đồ plasmid tách chiết từ khuẩn lạc sau 67 biến nạp 23 Hình 3.16: Điện đồ cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp sau 68 tinh với hai enzym XhoI NcoI 24 Hình 3.17: Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp PCR với 69 cặp mồi XynF1, XynR2 25 Hình 3.18: E coli BL21 biến nạp vector pRSET A- 70 xylanase 26 Hình 3.19: Điện di đồ protein tổng số dịch tế bào E coli 71 tái tổ hợp 27 28 Hình 3.20: Hoạt tính xylanase dịch phá tế bào Hình 3.21: Hoạt tính xylansae dịch Nguyễn Thị Thương Thương 72 73 Lớp CHCNSH.K810 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .10 1.1 Xylan phức hệ enzyme phân cắt xylan 10 1.1.1 Xylan .10 1.1.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan 11 1.2 Khái niệm phân loại xylanase 13 1.2.1 Khái niện xylanase .13 1.2.2 Phân loại xylanase 14 1.2.3 Cấu trúc xylanase 15 1.2.4 Cơ chế xúc tác xylanase .16 1.3 Nguồn thu xylanase từ tự nhiên .18 1.3.1 Sinh tổng hợp xylanase từ vi khuẩn 18 1.3.2 Sinh tổng hợp xylanase từ nấm mốc .19 1.4 Ứng dụng số lĩnh vực 22 1.4.1 Sản xuất cồn nhiên liệu 22 1.4.2 Sản xuất thức ăn chăn nuôi .22 1.4.3 Sản xuất bánh 22 1.4.5 Tẩy trắng giấy bột giấy 23 1.4.6 Các chất hoạt động bề mặt 23 1.5 Xylanase tái tổ hợp 24 1.5.1 Hệ thống vật chủ sử dụng tách dòng biểu gene mã hóa xylanase từ nấm mốc 25 1.5.2 Một số nghiên cứu liên quan Việt Nam .29 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Chủng vi sinh vật, tế bào chủ, vector sử dụng 31 2.2 Hóa chất thành phần môi trường nuôi cấy 32 2.3 Thiết bị 33 2.4 Nghiên cứu khả sinh tổng hợp xylanase chủng .34 2.5 Phương pháp tách chiết DNA 34 Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 2.5.1 Tách chiết DNA tổng số 34 2.5.2 Tách chiết DNA plasmid 35 2.6 Phương pháp PCR 36 2.7 Phương pháp điện di gel agarose .39 2.8 Phương pháp tinh DNA kit MINELUTE (QUIAGEN) 40 Phương pháp cắt DNA enzyme cắt giới hạn 41 2.10 Phương pháp gắn DNA enzyme T4-ligase 41 11 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến .42 2.12 Phương pháp biến nạp vào E coli sốc nhiệt .43 2.13 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme xylanase 43 2.14 Thu hồi tinh enzyme tái tổ hợp .44 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Nghiên cứu số đặc tính chủng 47 3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính xylanase 47 3.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính xylanase .48 3.13 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính xylanase 49 3.2 Tách dòng gene mã hóa enzyme xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger B7 50 3.2.1 Tách chiết DNA chủng .50 3.2.2 Khuếch đại gene mã hóa xylanase từ chủng Aspergillus niger B7 51 3.2.3 Khuếch đại cds gene xylanase 57 3.2.6 Gắn cds gene xylanase vào vector pRSET A enzyme T4 -ligase 64 3.2.4 Biến nạp vetor tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli TOP10 66 3.3 Biểu gene xylanase E coli BL21 70 3.4 Mức độ biểu xylanase 70 3.5 Định tính hoạt tính xylanase 72 3.6 Định lượng hoạt tính xylanase phản ứng DNS .73 KẾT LUẬN .74 KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO .76 Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 MỞ ĐẦU Hiện trái đất, năm thực vật sản sinh lượng sinh khối khổng lồ ước tính đạt tới bốn mươi tỷ Tất hoạt động người loài động vật cần đến thực vật Chúng nguồn lương thực để nuôi sống người động vật đồng thời nguồn cung cấp nguyên, nhiên vật liệu cho ngành công nghiệp [3] Để thay đổi tính chất vật liệu đầu vào cho phù hợp với sản phẩm mong đợi người ta phải tìm cách thay đổi cấu trúc thành tế bào thực vật Tuy nhiên thành tế bào thực vật lại có cấu tạo vững cellulose, hemicellulose lignin, cellulose chiếm (35-50%), hemicellulose chiếm (20-30%), lignin chiếm (20-30%) theo trọng lượng khô [33] Chỉ tính riêng hemicellolose, hàng năm lượng hemicellulose tạo thành 3,9 tỷ Nhưng hầu hết lượng hemicellulose không sử dụng cách hiệu muốn sử dụng hiệu hemicellulose cần phải thủy phân triệt để xylan loại polysaccharide chiếm phần lớn thành phần hemicellulose Tuy nhiên để phá hủy chúng người ta thường sử dụng hóa chất mạnh axit mạnh, hay kiềm mạnh Do chi phí để sản xuất sản phẩm thường cao gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường sinh thái Chính yêu cầu đặt phải thay phương pháp an toàn môi trường [30] Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có esterase [29] để loại bỏ liên kết axit acetic axit phenolic với xylose xylanase hệ enzyme thủy phân xylan quan tâm [34] Xylanase có tiềm ứng dụng lớn đời sống hàng ngày người: (1) làm tác nhân tẩy trắng bột giấy sử dụng công nghiệp sản xuất giấy; (2) công nghiệp thực phẩm sử dụng chất bổ sung vào bánh mỳ, nước hoa quả, rượu trắng; (3) bổ sung vào thức ăn động vật để tăng giá trị dinh dưỡng; (4) nâng cao khả sử dụng sinh khối (biomass) côngnghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học [36] Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 Tuy ứng dụng nhiều lĩnh vực sống, việc sử dụng xylanase hạn chế hiệu suất sinh tổng hợp chủng vi sinh vật tự nhiên sinh enzyme chưa cao Xuất phát từ yêu cầu đặt thực đề tài “ Nghiên cứu đặc tính enzyme xylanase nấm mốc Aspergillus niger, tách dòng biểu gene mã hóa xylanase Escherichia coli BL21” Nguyễn Thị Thương Thương Lớp CHCNSH.K810 kb Do từ kích thước đoạn gene gắn vào vector pRSET A khẳng định tách dòng thành công cds gene mã hóa xylanase tế bào chủ E coli TOP10 - Kiểm tra plasmid tái tổ hợp PCR với cặp mồi XyF1, XyR2 Chúng tiến hành phản ứng PCR với plasmid vừa tách từ việc nuôi khuẩn lạc có khả mang đoạn DNA ngoại lai, sử dụng cặp mồi XyF1 XyR2 Sau điện di sản phẩm gel agarose % để kiểm tra, kết thể hình 3.16 1: Sản phẩm PCR với khuân DNA plasmid M: DNA marker 1kb 2: cds xylanase Hình 3.17: Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp PCR với cặp mồi XyF1-XyR2 Từ ảnh điện di, thấy sản phẩm PCR từ plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA ngoại lai có kích thước kích thước cds xylanase overlap với cặp mồi XynF1- XynR2 Như khẳng định vector tái tổ hợp mang đoạn DNA cần tách dòng Như từ kết phân tích khẳng định tách dòng thành công cds gene mã hóa xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger E coli TOP10 Nguyễn Thị Thương Thương 69 Lớp CHCNSH.K810 Dòng tái tổ hợp tiếp tục biến nạp vào E coli BL21 để nuôi sinh khối enzyme tái tổ hợp 3.3 Biểu gene xylanase E coli BL21 Vector pRSET A vector có chức tách dòng, biểu E coli với đặc điểm nêu Do đó, tiến hành biểu gene xylanase, không cần phải chuyển cds gene xylanase sang hệ thống vector biểu mới, sử dụng vector tái tổ hợp pRSET A-xylanase làm hệ thống vector tái tổ hợp biểu Vector pRSET A-xylanase biến nạp phương pháp sốc nhiệt vào E coli BL21, nuôi môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml Hình 3.18: E coli BL21 biến nạp vector tái tổ hợp pRSET A-xylanase 3.4 Mức độ biểu xylanase Khuẩn lạc lựa chọn nhân giống tạo đĩa gốc, nguồn nuôi vi khuẩn để biểu gene xylanase Quá trình nuôi tiến hành mục , Đầu tiên, E Coli nuôi hoạt hóa môi trường LB có chứa ampicillin 37oC tiếng Toàn dịch bổ sung để nuôi lượng lớn 250 ml mật độ tế bào đạt yêu cầu (OD600 = 0,6) bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ cuối 0,5mM Quá trình nuôi tế bào nhiệt độ 22oC qua đêm Nguyễn Thị Thương Thương 70 Lớp CHCNSH.K810 Xylanase tái tổ hợp tổng hợp E coli BL21 dạng enzyme nội bào Thu enzyme thô phương pháp siêu âm phá tế bào Protein tống số điện di kiểm tra gel polyacrylamide 10 % Điện đồ cho thấy (hình 3.18) xylanase biểu hàm lượng protein tăng lên theo thời gian cảm ứng M: Marker protein (kDa) 1: Dịch enzyme thô sau h cảm ứng IPTG 2: Dịch enzyme xylanase thô sau h cảm ứng IPTG 3: Dịch enzyme xylanase thô sau h cảm ứng IPTG Hình 3.19: Điện di đồ protein tổng số dịch tế bào E coli tái tổ hợp Enzyme xylanase tái tổ hợp có 225 amino acid, gắn thêm peptide tín hiệu gồm 37 amino acid vector pRSET A có trọng lượng khoảng 29 kDa Đặc điểm 37 amino acid tín hiệu vector pRSET A chứa chuỗi peptide gồm amino acid histidine Sau kết thúc dịch mã, enzyme xylanase tái tổ hợp bao gồm đoạn lặp histidine có lực mạnh với hạt Niken Ứng dụng tính chất protein xylanase tái tổ hợp để tiến hành tinh protein tổng số, thu xylanase tái tổ hợp phương pháp sắc ký lực Kết điện di đồ dịch enzyme thô cho thấy band có kích thước khoảng 29 kDa xuất đậm, đậm hẳn so với band khác Như vậy, protein tái tổ Nguyễn Thị Thương Thương 71 Lớp CHCNSH.K810 hợp có trọng lượng phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết trọng lượng phân tử xylanase tái tổ hợp 3.5 Định tính hoạt tính xylanase Các chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp, E coli BL21 E coli BL21/ pRSET A nuôi cấy môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin Sau phá vỡ tế bào siêu âm, dịch thu cho vào lỗ đĩa thạch với chất xylan 4g/l Sau xử lý theo phương pháp khuếch tán enzyme, kết định tính thể (hình 3.19) Các mẫu phá tế bào chủng tái tổ hợp có vòng thủy phân chất sáng màu đĩa thạch Các chủng E coli BL21 E coli BL21/pRSET A đối chứng âm tính, hoạt tính xylanase Điều kết luận gene xylanase tái tổ hợp plasmid pRSET A biểu hệ thống E coli BL21 - Giếng 2: Dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp - Giếng 3: Dịch phá tế bào chủng E coli BL21 - Giếng 4: Dịch phá tế bào chủng E coli BL21/pRSET A Hình 3.20: Hoạt tính xylanase dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp (1- 2), đối chứng âm tính BL21(3) BL21/pRSET A (4) Mặt khác dịch môi trường nuôi cấy cho vào lỗ đĩa thạch với chất xylan 0,4 % Sau xử lý theo phương pháp khuếch tán enzyme, kết định tính thể hình 3.19 Hoạt tính xylanase dịch chủng tái tổ hợp (2) tương đối thấp so với hoạt tính xylanase dịch phá tế bào (4) Điều hoàn toàn phù hợp với lý thuyết chủng E coli BL21, protein tái tổ hợp thường nằm tế bào, tiết môi trường nuôi cấy Một điều mong Nguyễn Thị Thương Thương 72 Lớp CHCNSH.K810 đợi hoạt tính dịch chủng E coli BL21 E coli BL21/pRSET A không xuất - Giếng 2: Dịch chủng tái tổ hợp - Giếng 4: Dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp Hình 3.21: Hoạt tính xylansae dịch Chủng tái tổ hợp –dịch (2), chủng tái tổ hợp-dịch phá tế bào (4) 3.6 Định lượng hoạt tính xylanase phản ứng DNS Tế bào phá phương pháp siêu âm, tiến hành lần (siêu âm 45 giây, nghỉ 45 giây) đệm Dịch phá tế bào dịch xác định hoạt tính theo phương pháp DNS Xylanase biểu E coli phần lớn dạng nội bào, hoạt độ enzyme tái tổ hợp chưa tinh 97, U/ml, có enzyme tiết môi trường 3,17 U/ml Hoạt độ enzyme xylanase tái tổ hợp từ Aspergillus niger B7 đạt cao hoạt độ enzyme xylanase từ T reesei (Ogasawara cộng sự, 2006) biểu E coli 13,2 U/ml Điều chứng tỏ vật chủ biểu hiện, gene xylanase từ chủng khác nhau, điều kiện nuôi thu khác cho enzyme có hoạt tính khác Nguyễn Thị Thương Thương 73 Lớp CHCNSH.K810 KẾT LUẬN Đã tìm điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus niger B7 để thu enzyme xylanase - Nồng độ xylan g/l - Nhiệt độ 30oC - pH 5,0 - Thời gian nuôi 72 h Ở điều kiện tối ưu chủng cho hoạt tính xylanase cực đại 487,02 U/ml Thiết kế cặp mồi khuếch đại gene xylanase chủng Aspergillus niger B7 AspF : 5’-ATGCTCACGACGAACCTTCTC-3’ AspR : 5'-TTACTGAACAGTGATGGACGAAG-3' Khuếch đại giải trình tự gene mã hóa xylanase chủng Aspergillus niger B7 có kích thước 746 bp, có intron từ vị trí nucleotide số 279 đến 346, có độ tương đồng 98% so với đoạn gene mã hóa enzyme xylanase chủng nấm mốc Aspergillus niger EU423881.1 công bố giới Thiết kế cặp mồi tách dòng cds gene mã hóa xylanase E coli TOP10 XynF1: 5’-GCCTCGAGATGCTCACGACGAACCTTCTC-3’ XhoI XynR2: 5’-CGCCATGGTACTGAACAGTGATGGACG-3’ NcoI Biểu thành công cds gene xylanase E coli BL 21 sử dụng vector biểu pRSET A Hoạt độ enzyme tái tổ hợp 97, U/ml Nguyễn Thị Thương Thương 74 Lớp CHCNSH.K810 KIẾN NGHỊ - Tinh enzyme tái tổ hợp, xác định hoạt lực enzyme - Tối ưu trình nuôi cấy chủng tái tổ hợp - Nghiên cứu đặc tính enzyme tái tổ hợp (Nhiệt độ, pH tối ưu cho phản ứng enzyme, tính bền nhiệt, bền pH nó, ảnh hưởng ion kim loại, chất tẩy rửa, dung môi hữu …) Nguyễn Thị Thương Thương 75 Lớp CHCNSH.K810 TÀI LIỆU THAM KHẢO Asano Krisana, Sriprang Ruchadaporn, Gobsuk Jarupan, Eurwilaichitr.(2003), Endo-1,4-β-xylanase B from Aspergillus cf niger BCC14405 Isolated in Thailand: Purification, Characterization and Gene Isolation Bajpai P (1999), Application of enzyme in the pulp and paper industry, Biotechnol Prog 15: 147-157 Beg KQ, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal G.S (2001), Microbial xylanase their industrial application: a review, App Microbiol Biotechnology 56: 326-338 Biely, P., Markovik, O., and Mislovicova, D (1985), Sensitive detection of endo-1,4-β-glucanases and endo-1,4-β-xylanases in gels, Anal Biochem 144, 147-151 Biely, P., Vrsanska, M., Tenkanen, M and Kluepfel, D (1997), Endo-βxylanases families: differences in catalytic properties, J Biotechnol 57, 151-166 Bissoon S, Christov L and Singh, S (2002), Bleach boosting effects of purified xylanase from Thermomyces lanuginosus SSBP on bagasse pulp, Process Biochem 37, 567-572 Bray, M R and Clarke, A J.(1995), Identification of an essential tyrosyl residue in the binding site of Schizophyllum commune xylanase-A, Biochemistry, 34, 2006-2014 Chenyan Zhou , Jianyu Bai , Shanshan Deng , Jin Wang , Jie Zhub, Minchen, Dervilly, G., Thibault, J -F and Saulnier, L (2001), Experimental evidence for a semi-flexibile conformation for arabinoxylans, Carbohydrate Res 330, 365-372 Cleemput, G., Hessing, M., van Oort, M., Deconynck, M and Delcour, J A.(1997), Purification and characterization of β-D-xylosidase and an endoxylanase from wheat flour, Plant-Physiol 113, 377-386 Nguyễn Thị Thương Thương 76 Lớp CHCNSH.K810 10 Dawn Elizabeth Stephens (2007), Protein engineering or a fungal xylanase, Department of Biotechnology, Faculty of Applied Sciences, Durban University of Technology, Durban, South Africa 11 Dervilly, G., Thibault, J -F and Saulnier, L (2001), Experimental evidence for a semi-flexibile conformation for arabinoxylans, Carbohydrate Res 330, 365-372 12 Đỗ Thị Tuyên, Đàm Thị Hồng, Quyền Đình Thi (2009), Đánh giá số tính chất hóa lý xylanse chủng nấm Aspergillus niger DSM1957 dịch tinh sơ bộ, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn (6): 16-21 13 Gomes, J., Gomes, I., Terler, K., Gubala, N., Ditzelmuller, G and Steiner, W (2000), Optimisation of culture medium and conditions for α – L - arabinofuranosidase production by the extreme thermophilic eubacterium Rhodothermus marinus, Enzym Microb Technol 27, 414-422 14 Hazlewood GP, Gilbert HJ (1993), Molecular biology of hemicellulases, in Hemicelluloses and Hemicellulases, Coughlan, M P and Hazlewood, G P Eds., Portland Press, London, 103-126 15 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục 16 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/mmdb/mmdbsrv.cgi?uid=64642 17 J Ragauskas, Kathleen M Poll (1993), Effect of Xylanase Pretreatment Procedures for Nonchlorine Bleaching, Institute of Paper Science and Technology, Atlanta, GA 30318 18 Jeffries T W (1996), Biochemistry and genetics of microbial xylanases Curr Opin Biotechnol 7, 337-342 19 Kavya V, Padmavathi T (2009), Optimization of growth conditions for xylanase production by Aspergillus niger in solid state fermentation, Pol J Microbiol 58(2):125-130 20 Kuno, A., Kaneko, S., Ohtsuki, H., Ito, S., Fujimoto Z., Mizuno, H., Hasegawa T., Taira K., Kusakabe, I And Hayashi, K (2000) Novel sugarbinding specificity of the type XIII xylan-binding domain of a family F/10 xylanase from Streptomyces olivaceoviridis E-86, FEBS Letts 482, 231-236 Nguyễn Thị Thương Thương 77 Lớp CHCNSH.K810 21 La-Grange, D C., Claeyssens, M., Pretorius, I S., van-Zyl, W H.(2000), Coexpression of the Bacillus pumilus beta-xylosidase (xynB) gene with the Trichoderma reesei beta-xylanase-2 (xyn2) gene in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Appl Microbiol Biotechnol 54, 195-200 22 Leggio, L L Jenkins, J., HarrisG.W and Pickersgill, R W (2000), X-ray cystallographic study of xylopentose binding to Pseudomonas fluorescens xylanase A, Proteins: Struct Function and Genetics, 41, 362-374 23 Maciel GM (2008), Xylanase Production by Aspergillus niger in LPB 326 in solid-state fermentation using statistical experimental designs, Food Technol Biotechnol 46(2): 183-189 24 Miller GL (1959), Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Analytical chemistry 31,426-428 25 Meagher, MM, Tao, B.Y., Chow, J M., and Reilly, P.J (1988), Kinetcs and subsite mapping of β-D-xylobiose and D-xylose producing Aspergillus endoxylanase, Carbohydr Res 173, 273-283 26 Moure A, Gullón P, Domínguez H, Parajo JC (2006), Advances in the manufacture, purification and applications of xylo-oligosaccharides as food additives and utraceuticals Process Biochem 41:1913– 1923 27 Nguyễn Văn Diệp, Đoàn Duy Lộc, Phạm Thành Hổ, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Bước đầu nghiên cứu hoạt tính enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger var xylanase ứng dụng vào trình tẩy trắng bột giấy, Đại học Khoa học Tự Nhiên 28 Nguyễn Thị Uyên Thảo, Đinh Minh Hiệp, Phạm Thị Ánh Hồng (2004), Nghiên cứu tận dụng bã khoai mì nhằm thu nhận enzyme cellulose, xylanase, pectinase bổ sung thức ăn gia súc từ vi nấm Trichoderma, Báo cáo Khoa học Hội nghị khoa học lần thứ IV – ĐHKHTN-ĐHQGTPHCM 29 Puls J (1997), Chemistry Relationship between and biochemistry of hemicelluloses: hemicellulose structure and enzyms required for hydrolysis, Macromol Symp 120, 183-196 Nguyễn Thị Thương Thương 78 Lớp CHCNSH.K810 30 Poutanen, K (1998), Characterisation of xylanolytic enzyms for potential applications Ph.D Thesis, Technical Research Centre of Finland, Publications, 47, Espoo 31 Polizeli ML, Rizzatti AC, Monti R, Terenzi HF, Jorge JA, Amorim DS (2005), Xylanase from fungi: properties and industrial application Appl Microbiol Biotechnol 67: 577-591 32 Sapag, A., Wouters, J., Lambert, C., Ioannes, P., Eyzaguirre, J and Depiereux, E (2002), The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic relationships, J Biotechnol 109-131 33 Sibtain Ahmed, Saba Riaz, Amer Jamil (2009), Molecular cloning of fungal xylanase, Appl Microbiol Biotechnol 84: 19-35 34 Subramaniyan S, Prema P (2003), Biotechnology of Microbial Xylanases: Enzymology, Molecular Biology and Application, Critical Reviews in Biotechnology, Kerala, India, 1030-1045 35 Suprabha GN, Sindhu R, Shankar S (2008), Fungal xylanase production under solid state and submerged fermentation conditions, Afr J Microbial Res 2: 082-086 36 Tamba-Berehoiu Radiana, Jurcoane Stefana, Popa N.C, Bagiu Liliana, Rosu Ana (2008), Testing of the efficiency of some enzymatic mixture, concerning the conversion of several lignocellulosic biomass’ sourses, to reducing sugars, Lucrări ştiinŃifice Zootehnie şi Biotehnologii, vol 41(1), Timişoara, 155-161 37 Teleman A, Tenkanen M, Jacobs A and Dahlman, O (2002), Characterization of O-acetyl-(4-O-methylglucurono) xylan isolated from birch and beech, Carbohydrate Research 337, 373-377 38 Trần Liên Hà, NguyễnThương Thương, Nguyễn Thành Chung, Nguyễn Văn Cách (2010), Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh enzyme xylanase cao số đặc tính chủng, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A): 879-884 Nguyễn Thị Thương Thương 79 Lớp CHCNSH.K810 39 Robert M Horton (1993), In vitro recombination and mutagenesis of DNA Methods in Molecular Biology, Vol 15: 251-257 40 Ramón Gerardo Guevara-González and lrineo Torres-Pacheco (2006), Xylanase Advances in Agricultural and Food Biotechnology: 305-322 ISBN: 81-7736-269-0 41 Ricarda M Engberg, Mette S Hedemann, and Bent B Jensen, The influence of anaerobically stored high moisture wheat and xylanase on broiler performance and microbial composition and activity in the digestive tract of broiler chickens, Danish Institute of Agricultural Sciences, Research Centre Foulum, Denmark (http://www- afac.slu.se/Workshop%20Norge/Foredrag%20Ricarda%20 Engberg %20hel%20hvete.pdf) 42 Yeshitila Degefu (2003), Cloning and characterisation of xylanase genes from phytopathogenic fungi with a special reference to Helminthosporium turcicum, the cause of northern leaf blight of maize Departement of Applied Biology Plant Pathology University of Helsinki Finland 43 Yinan Yang, Kuixian Shan, Lifeng Ping, Jingmei Lu (2008), Cloning, sequencing and expression of a novel xylanase cDNA from a newly isolated Aspergillus awamori in Pichia pastoris, African Journal of Biotechnology Vol.7(23), 4251-4259 44 Wakiyama M, Tanaka H, Yoshihara K, Ohta K (2008), Purification and properties of family-10 endo-1,4-β-xylanase from Penicillium citrinum and structural organization of encoding gene J Biosci Bioeng 105:367–374 45 Wakarchuk, W W Campbell, R.L Sung, W.L., Davoodi, J and Yaguchi, M (1994), Mutational and crystallographic analyses of the active site residues of the Bacillus circulans xylanase, Prot Sci 3, 467-475 46 Wong, K.K.Y., Multiplicity Tan, of L U L β-1,4-xylanase and Saddler, J N (1988) in microorganisms: Functions and applications, Microbiol Rev 52, 305-317 47 Wu, Wu Wang (2008), Cloning of a xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli, Bioresource Technology 99, 831–838 Nguyễn Thị Thương Thương 80 Lớp CHCNSH.K810 PHỤ LỤC Bảng 4.1 Đường chuẩn xylose Xylose mg/ml OD 540nm 0,1 0,613 0,2 1,26 0,3 1,912 0,4 2,363 0,5 2,915 Bảng 4.2 : Ảnh hưởng nồng độ xylan đến hoạt tính xylanase Thời gian (h) 2g/l 4g/l 6g/l 8g/l 10g/l 24 235.67 272.86 208.61 132.48 53.44 48 372.73 446.13 342.36 253.55 165.01 72 469.5 487.02 414.4 320.36 265.65 Nguyễn Thị Thương Thương 81 Lớp CHCNSH.K810 96 465.6 482.15 381.88 278.89 209.58 120 395.32 428.61 320.36 272.66 143.78 Nguyễn Thị Thương Thương 82 Lớp CHCNSH.K810 Bảng 4.3: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính xylanase Thời gian (h) 25độ C 30độ C 35độ C 40độ C 24 181.94 159.16 199.65 162.86 48 287.11 437.18 315.41 258.64 72 375.27 486.24 433.09 341.33 96 358.91 477.48 416.15 285.9 120 340.61 453.34 390.45 277.14 Bảng 4.4: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính xylanase Thời gian (h) pH= pH= pH= pH= pH= 24 215.62 253.39 235.67 172.01 85.37 48 342.95 427.83 369.23 211.14 157.21 72 463.85 483.9 421.6 300.89 233.92 96 421.8 465.6 387.14 278.31 215.42 120 381.88 421.8 334.18 253.58 177.26 Nguyễn Thị Thương Thương 83 Lớp CHCNSH.K810 ... hoạt tính xylanase 47 3.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính xylanase .48 3.13 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính xylanase 49 3.2 Tách dòng gene mã hóa enzyme xylanase từ chủng nấm mốc Aspergillus. .. nạp gene chủ yếu dùng để sản xuất sản phẩm chuyển gen Ngoài E coli nấm men sử dụng nhiều để biểu gene 1.5.1 Hệ thống vật chủ sử dụng tách dòng biểu gene mã hóa xylanase từ nấm mốc 1.5.1.1 Tách dòng. .. đến 5,3 Đây công bố việc tách dòng gen xylanase từ A usamii [47] 1.5.1.2 Tách dòng nấm men - Tách dòng Saccharomyces cerevisiae Một số gene xylanase từ nấm mốc tách dòng biểu Saccharomyces cerevisiae