Tách dòng và biểu hiện gene mã hóa chitinase của bacillus licheniformis knuc213 trong nấm men pichia pastoris

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ************************** CHU THỊ HOA TÁCH DỊNG VÀ BIỂU HIỆN GENE MÃ HĨA CHITINASE CỦA BACILLUS LICHENIFORMIS KNUC213 TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến-ngƣời thầy dìu dắt tơi bƣớc đƣờng nghiên cứu khoa học, truyền đạt cho kiến thức, bảo tận tình có đóng góp mẻ, sâu sắc lĩnh vực nghiên cứu Đồng thời, thầy tạo điều kiện tốt thời gian điều kiện làm việc thực nghiên cứu luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Hiếu, KS Quách Ngọc Tùng tập thể cán Phịng Cơng nghệ lên men, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xun bảo kiến thức chun mơn, góp ý cho luận văn tạo điều kiện tốt giúp học tập rèn luyện suốt trình thực tập Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện mặt thời gian, ln động viên khích lệ tơi q trình học tập Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời thân yêu thƣơng, ủng hộ, động viên giúp đỡ suốt q trình học tập để tơi có đƣợc kết nhƣ ngày hôm Hà Nội, ngày 24 tháng 12 năm 2012 Học viên Chu Thị Hoa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Kí hiệu Amp Ampicillin Bp Base pair CHI Chitinase DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxyribonucleic triphotphate EDTA Ethylennediaminetetraacetic EtBr Ethidium Bromide GlcN N- glucosamine GlcNAc N- acetylglucosamine LB Môi trƣờng Luria Bertani OD Optical Density (mật độ quang) PCR Polymerase chain reaction rCHI Chitinase tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Đệm Tris – Acetate – EDTA TE Đệm Tris – EDTA YPD Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose YPDS Môi trƣờng Yeast – Peptone – Dextrose - Sorbitol Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Gen chi mã hóa chitinase từ chủng Bacillus licheniformis 1.2 3.1 Tình hình nghiên cứu chitinase giới 15 Đặc điểm nuôi cấy chủng vi khuẩn KNUC213 môi trƣờng thạch khác Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa chủng KNUC213 3.2 sử dụng kit API 50 CHB sau 48 nuôi cấy 37C Ảnh hƣởng nhiệt độ, nồng độ muối, pH đến khả 3.3 35 37 phát triển chủng B licheniformis KNUC213 Kết so sánh độ tƣơng đồng trình tự amino acid endochitinase từ B licheniformis KNUC213 (AEQ55312) 3.4 với trình tự amino acid chitinase tƣơng ứng từ 38 43 chủng B licheniformis khác đƣợc đăng ký GenBank 3.5 (NCBI) So sánh hoạt tính enzyme chitinase chủng nghiên cứu thời điểm khác 3.6 48 Ảnh hƣởng ion kim loại lên hoạt tính rCHI chủng nấm men P pastoris Y2 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHITIN 1.1.1 Cấu trúc hóa học chitin 1.1.2 Vai trò ứng dụng chitin 1.2 CHITINASE 1.2.1 Giới thiệu chitinase 1.2.2 Cơ chế thủy phân chitin 1.2.3.2 Dựa vào phản ứng phân cắt 1.2.3.3 Căn vào cấu trúc phân tử 1.2.4 Cấu trúc phân tử chitinase 1.2.5 Nguồn thu nhận chitinase 1.2.5.1 Chitinase từ thực vật 1.2.5.2 Chitinase từ động vật 10 1.2.5.3 Chitinase từ vi sinh vật 10 1.2.5.4 Chitinase từ vi sinh vật tái tổ hợp 11 1.2.6 Vai trò ứng dụng chitinase 12 1.2.7 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính chitinase 13 1.2.7.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 13 1.2.7.2 Ảnh hƣởng pH 14 1.2.7.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 14 1.2.8 Tình hình nghiên cứu chitinase giới Việt Nam 15 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2.8.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 1.2.8.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 17 1.3 BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS 18 1.3.1 Đặc điểm hệ biểu P pastoris 18 1.3.2 Vector biểu pPICZA 20 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU 22 2.1.1 Các chủng sinh vật plasmid 22 2.1.2 Hóa chất, enzyme, thiết bị nghiên cứu 22 2.1.3 Các dung dịch sử dụng môi trƣờng nghiên cứu 22 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn KNUC213 24 2.2.2 Tách DNA tổng số vi khuẩn Bacillus licheniformis KNUC213 25 2.2.3 Khuếch đại gen chi mã hóa chitinase B licheniformis KNUC21325 2.2.4 Điện di DNA gel agarose 27 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR 27 2.2.6 Cắt ghép nối gen 27 2.2.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli phƣơng pháp sốc nhiệt 28 2.2.8 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn 29 2.2.9 Giải trình tự gen chi 29 2.2.10 Thiết kế vector biểu gen chi P pastoris 30 2.2.11 Biến nạp vector tái tổ hợp vào P pastoris X33 phƣơng pháp xung điện 30 2.2.12 Biểu rCHI 31 2.2.13 Tách chiết enzyme ngoại bào 32 2.2.14 Điện di protein gel polyacrylamide-SDS 32 2.2.15 Xác định hoạt tính enzyme chitinase 32 2.2.16 Xác định đặc tính rCHI 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN KNUC213 36 3.1.1 Đặc điểm nuôi cấy 36 3.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào 37 3.1.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa 37 3.2 TÁCH DỊNG GEN chi MÃ HĨA CHITINASE CỦA CHỦNG B licheniformis KNUC213 40 3.2.1 Tách DNA tổng số 40 3.2.2 Khuếch đại gen chi kỹ thuật PCR 40 3.2.3 Tách dòng gen chi vector pJET1.2/blunt 41 3.2.4 Giải phân tích trình tự gen chi B licheniformis KNUC213 43 3.3 BIỂU HIỆN GEN chi MÃ HÓA CHITINASE TỪ CHỦNG B licheniformis KNUC213 TRONG P pastoris X33 45 3.3.1 Thiết kế vector biểu pPICZαA::chi 45 3.3.2 Tạo chủng P pastoris tái tổ hợp có khả biểu rCHI 46 3.3.3 Biểu rCHI chủng P pastoris Y2 48 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 51 3.4.2 Ảnh hƣởng pH 52 3.4.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 54 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 KẾT LUẬN 56 KIẾN NGHỊ 57 Phụ lục 1: Sơ đồ cấu trúc plasmid pJET1.2/blunt 62 Phụ lục 2: Sơ đồ cấu trúc plasmid pPICZA 63 Phụ lục 3: Khả sử dụng nguồn cacbon chủng Bacillus licheniformis KNUC213 65 Phụ lục 4: Trình tự gen chi chủng Bacillus licheniformis KNUC213 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Chitin polyme sinh học không phân nhánh, đƣợc cấu thành từ đơn vị N-acetyl D-glucosamin (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1,4)-glucozit Chitin phổ biến, phân bố rộng rãi tự nhiên sau cellulose đóng vai trị polysaccharide cấu trúc sinh vật nhƣ: thành tế bào nấm, khung vỏ động vật chân đốt, vỏ ngồi lồi giáp xác giun trịn Một phƣơng pháp chuyển hóa chitin tạo dẫn xuất mạch ngắn chitin-oligosaccharide có giá trị kinh tế ứng dụng cao, an toàn ngƣời môi trƣờng sử dụng enzyme chitinase Chitinase (EC 3.2.1.14) enzyme phân hủy chất chitin khơng hịa tan nƣớc thành sản phẩm chitooligosaccharide hịa tan thơng qua trình thủy phân liên kết β-(1,4)-glucozit Hiện nay, chitinase đƣợc ứng dụng chủ yếu sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl Dglucosamine Đây sản phẩm giá trị ứng dụng cao đƣợc sử dụng thực phẩm, nơng nghiệp, y dƣợc, kháng nấm trùng Ngồi ra, chitinase đƣợc sử dụng nhƣ thuốc trừ sâu sinh học nông nghiệp nhờ khả phân hủy chitin cấu trúc thành tế bào nấm, côn trùng gây bệnh xử lý chất thải giàu chitin Theo công bố giới, chitinase thu nhận từ nhiều nhóm vi sinh vật nhƣ: vi khuẩn (Serratia sp., Bacillus sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Pseudomonas sp., Alteromonas sp…), nấm sợi (Trichoderma sp., Gliocladium virens, Fusarium chlamydosporum, Trichothecium roseum, Stachybotry elegans, Talaromyces flavus,…), xạ khuẩn (Streptomyces griseus, Str plicatus, Str lydicus…) Tuy nhiên, chitinase thu nhận từ chủng tự nhiên thƣờng không ổn định, hoạt tính khơng cao, chứa nhiều loại chitinase khác (nhóm exochitinase endochitinase) ảnh hƣởng đến phổ sản phẩm thủy phân chitin nhƣ quy mô thu nhận ứng dụng chitinase nhằm tạo sản phẩm chuyển hóa chitin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hiện nay, nhiều nhóm nghiên cứu giới nâng cao hiệu suất trình sản xuất chitinase cách tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp Cho đến gen chi mã hóa chitinase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác đƣợc biểu thành cơng nấm men, vi khuẩn; hệ thống biểu nấm men Pichia pastoris đƣợc sử dụng rộng rãi có đặc tính: ni cấy đơn giản, đạt sinh khối cao mơi trƣờng khống rẻ tiền, dễ dàng nâng cấp quy mô sản xuất, dễ điều khiển hệ thống biểu enzyme nhờ trình cảm ứng Xuất phát từ tiềm ứng dụng chitinase ƣu điểm hệ thống biểu P pastoris, thực đề tài: ―Tách dịng biểu gene mã hóa chitinase B licheniformis KNUC213 Pichia pastoris‖ nhằm nâng cao q trình sinh tổng hợp endochitinase có hoạt tính cao, tạo tiền đề cho sản xuất enzyme quy mơ lớn Đề tài đƣợc thực phịng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam với nội dung sau: - Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen - Tách dịng phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis KNUC213 - Biểu gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis KNUC213 P pastoris X33 - Bƣớc đầu nghiên cứu số tính chất chitinase tái tổ hợp (rCHI) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHITIN 1.1.1 Cấu trúc hóa học chitin Chitin polyme sinh học không phân nhánh, cấu thành từ đơn vị N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc) thông qua liên kết β-(1-4)-glycosyl (Hình 1.1) Chitin polymer sinh học phổ biến tự nhiên đứng sau cellulose (cấu trúc hóa học chitin gần giống với cellulose) đóng vai trị polysaccharide cấu trúc sinh vật nhƣ: thành tế bào nấm, khung vỏ động vật chân đốt, vỏ ngồi lồi giáp xác giun trịn Trong cấu trúc chitin, nhóm (-OH) nguyên tử C2 đƣợc thay nhóm axetyl amino (-NHCOCH3) Liên kết β-(1-4)-glycosyl đơn phân cấu trúc chitin lệch góc 180o tạo nên mạch xoắn loại liên kết bền, dễ bị cắt đứt tác nhân có tính axit hay enzyme [7] Cấu tạo hóa học chitin đƣợc thể hình 1.1 Công thức phân tử chitin: (C8H13O5N)n, Khối lƣợng phân tử: (203,09)n với thành phần nguyên tố: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91% Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo hóa học chitin Các nghiên cứu nhiễu xạ sử dụng tia X cho thấy, chitin tồn dƣới ba dạng α-, β- γ-chitin khác xếp nhánh phân tử bên tinh thể chitin Trong α-chitin, nhánh đƣợc xếp theo hƣớng đối song (antiparallel), β-chitin gồm nhánh song song γ-chitin đƣợc hình thành từ hỗn hợp hai loại α-chitin β-chitin Trong ba loại α-chitin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn enzyme với chất chitin đƣợc thực khoảng pH từ 4-8, nhiệt độ Hoạt tính tƣơng đối (%) 60oC, kết đƣợc trình bày hình 3.14 120 100 80 60 40 20 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 pH Hình 3.14 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính rCHI chủng nấm men P pastoris Y2 Ảnh hƣởng pH phản ứng tới hoạt động rCHI thể hình 3.14 cho thấy, rCHI hoạt động tốt khoảng pH 5,0-6.5 hoạt tính đạt cực đại pH 6,0 tƣơng đƣơng với pH tối ƣu cho hoạt động chitinase chủng B licheniformis KNUC213 Giá trị pH tối ƣu cho hoạt động rCHI tƣơng đƣơng với chitinase chủng Bacillus sp Hu1, cao chitinase chủng Serratia plymuthica HRO-C48 (pH 5,4) thấp giá trị pH tối ƣu cho chitinase thu nhận từ chủng B firmus SBPL-05 (pH 10,0) [18], chitinase thu từ số chủng vi khuẩn biển (pH 8,0) [29] pH ảnh hƣởng tới độ bền hoạt tính enzyme nên lựa chọn đƣợc khoảng pH thích hợp quan trọng Mỗi loại protein enzyme có độ bền mơi trƣờng pH định Kết nghiên cứu ảnh hƣởng pH đến độ bền hoạt tính rCHI đƣợc khảo sát với pH 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 7,0 khoảng thời gian khác đƣợc thể hình 15 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hoạt tính tƣơng đối (%) pH pH pH pH pH 100 80 60 40 20 0 30 60 90 120 150 180 210 Thời gian (phút) Hình 3.15 Độ bền hoạt tính rCHI chủng nấm men P pastoris Y2 pH khác Kết thể hình 3.15 cho thấy, hoạt tính rCHI giữ ổn định pH 6,0 thời gian giờ, hoạt tính hầu nhƣ khơng thay đổi Nếu giữ enzyme rCHI pH 3,0 4,0 thời gian 30 phút, hoạt tính rCHI cịn 38,5% 51,4% sau 90 phút giữ enzyme rCHI pH 3,0 4,0 hoạt tính rCHI bị bất hoạt hồn tồn Khi giữ enzyme rCHI pH 5,0 7,0 60 phút, hoạt tính rCHI cịn lại 75,3% 64,6%, sau hoạt tính enzyme ổn định khoảng thời gian nghiên cứu Kết đánh giá độ bền hoạt tính rCHI pH 6,0-7,0 tƣơng tự nhƣ nhƣ nghiên cứu độ bền hoạt tính chitinase chủng B licheniformis A1 6,0-8,0 [6, 10] 3.4.3 Ảnh hƣởng ion kim loại Các ion kim loại đóng vai trị quan trọng việc tham gia cấu trúc khơng gian phân tử chitinase bao gồm tham gia vào cấu trúc trung tâm hoạt động xúc tác phản ứng enzyme chất Kết nghiên cứu ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt tính rCHI đƣợc trình bày bảng 3.6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.6 Ảnh hƣởng ion kim loại lên hoạt tính rCHI chủng nấm men P pastoris Y2 Ion kim loại Enzyme ban đầu Hoạt tính cịn lại (%) Nồng độ mM Nồng độ 10 mM 100 100 Cu2+ 107 43 Co2+ 132 83 NH4+ 56 63 Sn2+ 96 25 Fe3+ 91 70 Ba2+ 46 89 Ca2+ 95 114 Mn2+ 91 151 Kết thể bảng 3.6 cho thấy, ion Cu2+ Co2+ nồng độ 1mM có tác dụng làm tăng hoạt tính rCHI lên 107% 132% so đối chứng Tuy nhiên, ion Cu2+ Co2+ nồng độ 10 mM làm giảm hoạt tính rCHI cịn 43% 83% so với đối chứng Các ion Ca2+ Mn2+ nồng độ mM kìm hãm hoạt động rCHI, nhƣng nồng độ 10 mM có mặt ion Ca2+, Mn2+ làm tăng họat tính rCHI lên 114% 151% so với đối chứng Kết phù hợp với nghiên cứu De cộng (2011) nghiên cứu ảnh hƣởng ion kim loại Ca2+ Mn2+ đến hoạt tính chitinase chủng Bacillus sp Hu1 [10] Trong số ion nghiên cứu, ion Ba2+, NH4+ ức chế mạnh hoạt động rCHI hai nồng độ mM (còn lần lƣợt 56% 46%) 10 mM (còn lần lƣợt 63% 89%) so với đối chứng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã nghiên cứu đặc điểm ni cấy, hình thái tế bào đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase cao Kết phân loại cho thấy chủng KNUC213 thuộc loài Bacillus licheniformis Chủng B licheniformis KNUC213 đƣợc sử dụng làm nguồn cung cấp gen chi mã hóa chitinase Đã khuếch đại thành cơng gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis KNUC213 Trình tự gen chi có kích thƣớc 1731 bp (JN662350) mã hóa cho protein gồm 576 amino acid, có độ tƣơng đồng cao (đạt 96-99%) so với trình tự tƣơng ứng GenBank (NCBI) Đã thiết kế vector biểu pPICZαA::chi tạo thành cơng chủng P pastoris Y2 có khả biểu rCHI Bƣớc đầu nghiên cứu biểu cho thấy chủng nấm men tái tổ hợp P pastoris Y2 biểu rCHI cao (đạt 652,3 U/ml) môi trƣờng BMGY, cảm ứng methanol 1,0% (v/v) sau 72 nuôi cấy Trọng lƣợng phân tử rCHI kiểm tra điện di SDS-PAGE khoảng 63 kDa Đã nghiên cứu số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ rCHI Enzyme rCHI có nhiệt độ pH phản ứng tối ƣu lần lƣợt 60oC pH 6,0; rCHI thể hoạt tính ổn định giữ dải nhiệt độ 30-70°C dải pH 5,0-7,0 Các ion kim loại Ca2+, Co2+, Cu2+ Mn2+có tác dụng làm tăng hoạt tính rCHI ion Ba2+, NH4+ làm giảm hoạt tính rCHI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn KIẾN NGHỊ Nghiên cứu điều kiện lên men nâng cao sinh tổng hợp chitinase từ chủng P pastoris X33/pPICZαA::chi Nghiên cứu tinh sạch, thu hồi chế phẩm rCHI kỹ thuật thử nghiệm khả ứng dụng chitinase chuyển hóa chitin thành chitooligosaccharide Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Đức Ý (2006) Dinh dƣỡng với viêm khớp Tạp chí sức khỏe đời sống 344: 9-10 Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền (1997) Vật liệu sinh học từ chitin Nxb Trung tâm khoa học tự nhiên Cơng nghệ quốc gia Trần Đình Toại (2008) Nghiên cứu chiết tách chitin từ đầu vỏ tôm phƣơng pháp sinh học Nxb Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo số cộng (2000) Hồn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ, Nha Trang Vũ Thị Ngọc Thanh, Đoàn Trọng Phụ, Nguyễn Thị Ty (2000) Nghiên cứu tác dụng tăng sinh collagen chitosan điều trị bỏng nhiệt thực nghiệm Tạp chí Dược học 9(9): 10-14 Tài liệu tiếng Anh Cemal S, Murat K, Sabrie C, Ali OB (2008) Cloning, expression, purification and characterisation of a thermostable chitinase from Bacillus licheniformis A1 Annual Review Microbiology 58(2): 245251 Chien-JH, Tang KW, Shu CC, Chao YC (2005) Identification of an Antifungal Chitinase from a Potential Biocontrol Agent Bacillus cereus 28-9 J Biochemistry Molecular Biology 38(1): 82-88 Dahiya N, Tewari R, Hoondal GS (2006) Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review Applied Microbiology Biotechnology 71: 773–782 David WR (2007) Biochemical characterisation of two forms of haloSố hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn and thermo-toleran chitinase C of Salinivibrio costicola expressed in Escherichia coli Annual Review Microbiology 57 (2): 249-257 10 De HD, Hu WL, Huang GR, Li W (2011) Purification and characterization of a novel extracellular chitinase from thermophilic Bacillus sp Hu1 African J Biotechnology 10(13): 2476-2485 11 Fernandez JM, Hoeffler JP (1999) Gene expression system Academia expression: 158-191 12 Hirono I, Yamashita M, Aoki T (1998) Molecular cloning of chitinase genes from Vibrio anguillarum and V parahaemolyticus J Applied Microbiology 84: 1175–1178 13 Hou WC (1998) Chitinase activity of sweet potato Botanical Bulletin Academia Sinica 39: 93-97 14 Howard MB, Ekborg NA, Taylor LE, Weiner RM, Hutcheson SW (2003) Genomic analysis and initial characterization of the chitinolytic system of Microbulbifer degradans strain 2–40 J Bacteriology 185: 3352–3360 15 Invitrogen (2005) A manual of methods for expression of recombinant proteins in P passtoris, Pichia Expression Kit, Catalog N0 K1740-s01: 1-56 16 Kim KJ, Yang YJ, Kim JG (2003) Purification and Characterization of Chitinase from Streptomyces sp M-20 J Biochemistry Molecular Biology 36( 2): 185-189 17 Lamarque G, Cretenet M, Viton C, Domard A (2005) New route of deacetylation of a- and b-chitins by means of freeze-pump out-thaw cycles Biomacromolecules 6: 1380–1388 18 Loni PP, Bajekal (2011) Alkaline chitinase from Bacillus firmus SBPL-05 isolated from Alkaline-Saline environment of Lonar Lake India J Dundamental Applied Life Sciences 1(3): 161-165 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 Ouakfaoui SE, Asselin A (1992) Multiple forms of chitinase activities Phytochemistry 31: 1513–1518 20 Patcharaporn S, Mongkon A, Kunio O, Chanpen W (2006) Purification and characterization of a Bacillus circulans No 4.1 chitinase expressed in Escherichia coli World J Microbiology Biotechnology 22: 331–335 21 Peberdy JF (1985) Mycolytic enzymes Fungal protoplasts— applications in biochemistry and genetics Marcel Dekker Inc New York: 31–44 22 Ratchaneewan A, David WR, Svetalana S, Watanalai P (2007) Biochemical characterisation of two forms of halo and thermo-tolerant chitinase C of Salinivibrio costicola expressed in Escherichia coli Annals Microbiology 57 (2): 249-257 23 Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular clonning A laboratory manual, 3rd ed Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor, NewYork: 133-135 24 Sanya K, Rath P (2009) Purification and characterization of thermostable chitinase from Bacillus licheniformis SK-1 Applied Biochemistry Biotechnology 157(1): 23-35 25 Shah MA Isla, Kye MC (2010) Chitinase of Bacillus licheniformis from oyster shell as a probe to detect chitin in marine shells Applied Microbiology Biotechnology 86:119– 129 26 Songsiriritthigu C, Pesatcha P, Eijsink VGH and Yamabhai M (2009) Directed evolution of a Bacillus chitinase J Biotechnology 4: 501– 509 27 Sydney London (1965) Encyclopedia polymer Ministry Science Technology 3: 605-704 28 Tharanathan RN, Kittur FS (2003) Chitin—the undisputed biomoleSố hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn cule of great potential Critical Reviews Food Science Nutrition 43(1): 61–87 29 Tsujibo H, Orikoshi H, Tanno H, Fujimoto K, Miyamoto K, Imada C, Okami Y, Inamori Y (1993) Cloning, sequence, and expression of a chitinaza gene from a marine bacterium, Alteromonas sp strain O-7 J Bacteriology 175: 176–181 30 Watanabe T, Suzuki K, Oyahagi W, Ohnishi K, Tanaka H (1990) Gene cloning of chitinaza A1 from Bacillus circulans WL-12 revealed its evolutionary relationship to Serratia chitinase and to the type III homology units of fibronectin J Biological Chemistry 265: 15659– 15665 31 Woo CJ, Park HD (2003) An extracellular Bacillus sp chitinase for the production of chitotriose as a major chitinolytic production Biotechnology Letters 25: 409–412 32 Yan JW, Qian Y (2009) Cloning and Expression of a Novel Chitinase chi58 from Chaetomium cupreum in Pichia pastoris Biochemmical Genetics 47: 547–558 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sơ đồ cấu trúc plasmid pJET1.2/blunt Thành phần vị trí vector tách dòng pJET1.2\blunt Thành phần Chức Vị trí (bp) rep(pMB1) 1762-1148 Trình tự vùng chép có nguồn gốc từ plasmid pMB1 Replication 1162±1 Điểm khởi đầu chép 2782-1922 Trình tự gen mã hóa  lactamase phân giải kháng sinh ampicillin start bla(ApR) đƣợc sử dụng làm yếu tố chọn lựa tế bào E.coli tái tổ hợp eco47IR 753-16 Trình tự gen độc eco47IR cho phép chọn lựa yếu tố ngoại lai PlacUV5 892-769 Trình tự promoter bắt nguồn từ Plac promoter sử dụng cho biểu gen độc eco47IR mức độ cao cho phép lựa chọn yếu tố dƣơng tính đoạn gen ngoại lai T7 promoter 305-324 T7 RNA polymerase promoter điều khiển trình phiên mã gen ngoại lai MCS 422-328 Vùng nhân dòng đa điểm cắt nối (vùng đa nối), giúp cho trình đƣa gen ngoại lai vào vector pJET 1.2 F 310-332 Trình tự cặp mồi cho phép kiểm tra có mặt đoạn gen ngoại pJET 1.2 R 428-405 lai có vector phản ứng PCR colony Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 2: Sơ đồ cấu trúc plasmid pPICZA Đặc điểm vector biểu pPICZαA Chức Thành phần 5’AOX1 Promoter chứa 942 bp Cho phép mức độ biểu cao đƣợc cảm ứng methanol P pastoris Plasmid đƣợc tích hợp vào genome P pastoris vị trí AOX1 Tín hiệu tiết α-factor, có nguồn gốc từ Cho phép tiết hiệu hầu hết protein từ S cerevisiae Pichia Vùng đa nối với trình tự nhận biết Cho phép chèn đoạn gen mong muốn vào vector 10 loại enzyme giới hạn biểu hiện Đầu C với đuôi myc epitope (Glu-Gln- Cho phép phát protein tái tổ hợp kháng Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu- thể Anti-myc kháng thể Anti-myc-HRP Asn) Đầu C với đuôi polyhistidine Cho phép tinh protein tái tổ hợp sử dụng cột kim loại Là epitope cho kháng thể AntiHis(C-term) kháng thể Anti-His(C-term) – HRP Điểm kết thúc phiên mã AOX1 (TT) Điểm kết thúc phiên mã tín hiệu polyA từ gen AOX1 (260 bp), cho phép phiên mã hiệu bao gồm việc gắn polyA Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TEF1 promoter Promoter gen phiên mã nhân tố kéo dài I từ S cerevisiae, giúp biểu gen Sh ble Pichia, có chức kháng zeocin EM7 (promoter cho vi khuẩn) Promoter giúp biểu gen Sh ble E coli, có chức kháng zeocin Gen Sh ble (gen ble Gen kháng zeocin Streptoalloteichus hindustanus) Vùng kết thúc phiên mã CYC1 Đầu 3’ gen CYCI từ S cerevisiae, cho phép phiên mã đoạn gen Sh ble pUC origin Cho phép plasmid chép trì bền vững E coli Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 3: Khả sử dụng nguồn cacbon chủng B licheniformis KNUC213 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phụ lục 4: Trình tự gen chi chủng Bacillus licheniformis KNUC213 GenBank: JN662350.1 LOCUS JN662350 1731 bp DNA linear BCT 19-OCT-2011 DEFINITION Bacillus licheniformis strain KNUC 213 chitinase (chi) gene, partial cds ACCESSION JN662350 VERSION JN662350.1 GI:351630323 KEYWORDS SOURCE Bacillus licheniformis ORGANISM Bacillus licheniformis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus REFERENCE (bases to 1731) AUTHORS Quach,N.T., Chu,T.H., Vu,V.L., Nguyen,V.H and Phi,Q.T TITLE Cloning and expression of chi gene encoding chitinase from Bacillus licheniformis KNUC 213 J Unpublished REFERENCE (bases to 1731) AUTHORS Quach,N.T., Chu,T.H., Vu,V.L., Nguyen,V.H and Phi,Q.T TITLE Direct Submission J Submitted (09-SEP-2011) Department of Fermentation, Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, VAST, 18 Hoang Quoc Viet Road, Cau Giay Dist., Hanoi 1000, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1731 /organism="Bacillus licheniformis" /mol_type="genomic DNA" /strain="KNUC 213" /db_xref="taxon:1402" /collection_date="2010" gene 1731 /gene="chi" CDS 1731 /gene="chi" /codon_start=3 /transl_table=11 /product="chitinase" /protein_id="AEQ55312.1" /db_xref="GI:351630324" /translation="SLSLSFVNGEVAKADSGKNYKIIGYYPSWGAYGRDFQVWDMDVS KVSHINYAFADICWEGRHGNPDPTGPNPQTWSCQDENGVIDAPNGTIVMGDPWIDAQK SNPGDVWDEPIRGNFKQLLKLKKSHPHLKTFISVGGWTWSNRFSDVAADPAARENFAA SAVEFLRKYGFDGVDLDWEYPVSGGLPGNSTRPEDKRNYTLLLQEVRKKLDAAEAKDG KEYLLTIASGASPDYVSNTELDKIAQTVDWINIMTYDFNGGWQSISAHNAPLFYDPKA KEAGVPNAETYNIENTVKRYKEAGVKGDKLVLGTPFYGRGWSGCEPGGHGEYQKCGPA KEGTWEKGVFDFSDLERNYVNQNGYKRYWNDQAKVPFLYNAENGNFITYDDEQSFGHK TDFIKANGLSGAMFWDYSGDSNRTLLNKLAADLDFAPDGGNPEPPSSAPVNVRVTGKT ATSVSLAWDAPSSGANIAEYVVSFENRSISVKETSAEIGGLKPGTAYSFTVSAKDADG KLHAGPTVEVTTNSDQACSYDEWKETSAYTGGERVAFNGKVYEAKWWTKGDRPDQSGE WLWRLIGGCE" Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ORIGIN gatccctgag cctctcattt gtgaatgggg aagttgcaaa agccgattcc ggaaaaaact 61 ataaaatcat cggctactat ccatcatggg gtgcttatgg aagggatttt caagtttggg 121 atatggacgt ttcgaaagtc agccacatta attatgcctt tgctgatatt tgctgggagg 181 gaaggcatgg aaaccctgat ccgacaggcc ccaatcctca aacgtggtca tgccaggatg 241 aaaacggagt gatcgacgcg ccaaatggaa caatcgtgat gggcgatccc tggattgacg 301 cacaaaagtc aaatcccggg gatgtctggg atgaaccgat ccgcggcaac tttaaacaat 361 tgttgaagct gaaaaagagc caccctcatt tgaaaacgtt catatcggtc ggggggtgga 421 cttggtctaa ccgcttttca gatgtcgcgg cagatcctgc ggcaagggag aatttcgccg 481 cttcggccgt tgagttttta aggaaatacg ggtttgacgg ggtcgatctt gactgggaat 541 atccggtcag cggaggattg ccggggaaca gcacacgtcc ggaagataaa agaaactaca 601 cgctgctcct gcaagaggtg cgcaaaaaac ttgacgctgc agaagcaaaa gacggcaagg 661 aatacttgct gacgatcgca tccggcgcaa gtcccgatta tgtaagcaac actgagctcg 721 ataaaatcgc tcaaaccgtg gattggatta acattatgac ctatgacttt aatggcggat 781 ggcaaagcat aagcgcccat aatgcaccgc tgttctatga tccaaaagcg aaagaagcag 841 gcgttccaaa cgctgagacc tacaatattg aaaacactgt gaaacgctac aaggaagccg 901 gtgtcaaggg tgacaaatta gtgcttggaa caccgttcta cggaaggggc tggagcggtt 961 gtgaaccagg ggggcacgga gaatatcaga aatgcggacc ggctaaagaa gggacatggg 1021 aaaagggcgt attcgatttt tcagatcttg aaaggaacta tgtgaatcaa aacggctata 1081 aaaggtattg gaacgatcaa gcaaaagtgc cgtttttgta taatgcggaa aatggcaatt 1141 tcatcactta tgatgatgaa caatcattcg gccacaaaac ggattttatt aaagcaaacg 1201 gattaagcgg agcaatgttc tgggattaca gcggcgattc caatcggacg cttctcaata 1261 aattggcagc cgatttagat tttgcaccgg acggaggcaa tccggagccg ccttcatcgg 1321 cacctgtgaa tgtgcgtgta accggaaaaa ctgctacaag tgtcagcctg gcgtgggatg 1381 cgccgagcag cggagcaaac attgcggaat atgtcgtgtc atttgaaaac cggtcgatat 1441 ctgtaaaaga aacatcagcg gaaataggcg gcttgaagcc gggtacggcc tactcattta 1501 ctgtttcagc aaaggatgcg gatggaaagc tccatgccgg accaacggta gaggtcacga 1561 cgaattctga ccaagcctgt tcatatgacg aatggaaaga gacgagcgca tacacaggcg 1621 gagagcgggt tgcatttaac ggaaaagtgt atgaagcgaa atggtggacg aaaggcgacc 1681 ggcctgatca atccggtgaa tggctatggc ggctgatcgg aggctgcgaa t Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... thống biểu enzyme nhờ trình cảm ứng Xuất phát từ tiềm ứng dụng chitinase ƣu điểm hệ thống biểu P pastoris, chúng tơi thực đề tài: ? ?Tách dịng biểu gene mã hóa chitinase B licheniformis KNUC213 Pichia. .. khuẩn KNUC213 có hoạt tính chitinase nhằm khai thác nguồn gen - Tách dịng phân tích trình tự gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis KNUC213 - Biểu gen chi mã hóa chitinase chủng B licheniformis. .. cứu tách dịng biểu chitinase có nguồn gốc từ nấm mốc nhằm ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây hại nông nghiệp 1.3 BIỂU HIỆN CHITINASE TRONG PICHIA PASTORIS 1.3.1 Đặc điểm hệ biểu P pastoris Hiện