Tách dòng biểu hiện gen mã hóa protein p24 của virus hiv 1 phân type crf01 ae lưu hành tại việt nam và ứng dụng protein tái tổ hợp trong chẩn đoán

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN MINH ĐỨC TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – CRFO1_AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN MINH ĐỨC TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – CRFO1_AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức -1- MỞ ĐẦU Đại dịch HIV/AIDS vấn đề nan giải mối hiểm họa nhân loại Kể từ ca nhiễm bệnh phát vào năm 1981 đại dịch HIV/AIDS gây chết cho hàng triệu người năm Theo báo cáo tổ chức phịng chống AIDS tồn cầu (UNAIDS) tính đến hết năm 2009 giới có khoảng 33,3 triệu người sống chung với HIV, riêng năm 2009 có khoảng 1,8 triệu người tử vong bệnh liên quan đến HIV/AIDS [36] HIV/AIDS nguyên nhân gây tỉ lệ tử vong cao người mà tác động tiêu cực tới phát triển kinh tế xã hội quốc gia, nước phát triển Với sở hạ tầng, trang thiết bị kỹ thuật y tế nhiều yếu việc chăm sóc điều trị bệnh nhân HIV/AIDS nước gặp nhiều khó khăn Vì vậy, cơng tác phát kiểm soát lây lan dịch bệnh coi giải pháp phù hợp với điều kiện nước phát triển, có Việt Nam Việt Nam nước có tỉ lệ nhiễm HIV cao giới Theo báo cáo Bộ Y tế tính đến ngày 30/9/2010, nước có 180.312 người sống chung với virus chết người này, có 42.339 bệnh nhân AIDS tổng số người chết AIDS báo cáo 48.368 người Số lượng người nhiễm HIV cao gánh nặng với xã hội kinh tế [10] Hiện nay, vấn đề sản xuất thuốc điều trị vaccine phòng ngừa HIV/AIDS tốn hóc búa y học giới Mặc dù nghiên cứu năm gần mang lại nhiều kết tích cực xong chưa có vaccine phịng chống HIV Trong bối cảnh diễn biến tình hình dịch bệnh nước ta ngày phức tạp, việc chẩn đốn sớm để có biện pháp phịng ngừa hữu hiệu cần thiết Trên thị trường Việt Nam xuất nhiều loại Kit chẩn đoán HIV đa phần nhập ngoại, loại Kit thường có giá thành cao khơng phù hợp với phân type HIV lưu hành Việt Nam Do đó, việc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức -2- nghiên cứu phát triến Kit chẩn đốn HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao sở kháng nguyên có nguồn gốc từ chủng virus lưu hành nước có ý nghĩa lớn mặt khoa học thực tiễn Xuất phát từ vấn đề nêu trên, tiến hành nghiên cứu: “Tách dịng, biểu gen mã hóa protein P24 virus HIV-1 phân type CRF01_AE lưu hành Việt nam ứng dụng protein tái tổ hợp chẩn đoán” Nghiên cứu thực phòng Vi sinh Vật học Phân tử – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức -3- CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human immunodeficiency virus – HIV) 1.1.1 HIV gì? HIV (Human Immunodeficiency Virus) - virus gây suy giảm miễn dịch người, loại virus xâm nhập vào thể gây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS), dẫn đến nguy nhiễm bệnh hội làm cho bệnh nhân dễ mắc phải ưng thư tác động HIV gây [1] HIV chủ yếu lây nhiễm tế bào quan trọng hệ thống miễn dịch người tế bào T trợ giúp (đặc biệt T CD4+), đại thực bào tế bào đuôi gai Lây nhiễm HIV dẫn đến giảm số lượng tế bào T CD4+ theo chế sau: Một là, tế bào nhiễm bị giết chết trực tiếp virut; hai là, tăng tỉ lệ tế bào chết theo chương trình; ba là, giết chết tế bào T CD4+ bị nhiễm tế bào lympho gây độc CD8 Khi số lượng tế bào T CD4+ suy giảm xuống mức định trình miễn dịch qua trung gian tế bào bị mất, thể dễ mắc bệnh nhiễm trùng hội [54] 1.1.2 Đặc điểm virus HIV 1.1.2.1 Giới thiệu chung Về nguồn gốc virus HIV gây suy giảm miễn dịch người câu đố nhà khoa học kể từ trường hợp mắc bệnh phát đầu năm 80 kỷ trước Ngày người đồng ý HIV có quan hệ họ hàng với virus gây suy giảm miễn dịch khỉ - SIV (simian immunodeficiency virus) Đặc biệt công bố vào năm 1999 số nhà nghiên cứu Đại học Alabama, họ nhận thấy HIV-1(một type HIV) giống SIV tinh tinh (SIVcpz) Nguồn gốc động Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức -4- vật, thời gian địa điểm xác lây truyền chưa rõ đề tài cho khảo sát tranh luận [21] HIV thuộc nhóm Lentivirus thuộc họ Retroviridae Lentivirus (lenti có nghĩa chậm), lồi virus đặc trưng thời gian dài ủ bệnh Lentivirus truyền thơng tin di truyền vào DNA tế bào chủ lồi Retrovirus có khả tái mà không thông qua phân chia tế bào [61] HIV có đặc trưng retrovirus: • Là loại virus RNA, có enzyme phiên mã ngược, mà chất DNA polymerase phụ thuộc RNA Với enzyme phiên mã ngược cho phép tổng hợp DNA kép tế bào chủ mà retrovirus xâm nhập • DNA tạo có đoạn tự lặp lại, có kích thước khác gọi đoạn cuối dài tự lặp lại, nhờ mà gắn cách ổn định nhiễm sắc thể tế bào chủ trở thành tiền virus (provirus) Tiền virus gen tế bào truyền sang cho hệ khác có phân bào, phiên mã thành RNA thơng tin, tổng hợp protein virus để hình thành virus hồn chỉnh HIV có đặc trưng Lentivirus :  Phát triển chậm  Không biến đổi tế bào lại làm tiêu huỷ tế bào  Cấu trúc kháng nguyên dễ biến đổi [1], [6] 1.1.2.2 Phân loại HIV HIV loại virus có tính biến đổi cao dễ xảy đột biến Điều có nghĩa có nhiều chủng HIV khác nhau, chí chúng lây nhiễm vào cá thể [39] Dựa vào tương đồng mặt di truyền người ta phân loại chủng virus HIV thành type, nhóm phân type Có type HIV: HIV-1 HIV-2 Cả type lây truyền qua đường tình dục, qua máu, từ mẹ sang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ -5- Trần Minh Đức chúng nguyên nhân dẫn đến triệu chứng lâm sàng bệnh AIDS khó phân biệt type gây HIV-1 có mức độ lây lan rộng, cịn HIV-2 khó lây nhiễm hơn, thời kì ủ bệnh dài [40] HIV-1 Luc Montagnier cộng viện Pasteur Paris phát vào năm 1983 [48] HIV-1 chia làm nhóm: Nhóm M (major), nhóm O (outlier), nhóm N P (hình 1.1) [40] Hình 1.1: Sơ đồ phân type HIV-1 HIV-2[40]  Nhóm O xuất giới hạn khu vực Tây-Trung phi  Nhóm N - chủng phát năm 1998 Cameroon lại xuất  Nhóm P - chủng mới, có quan hệ gần với virus gây suy giảm miễn dịch khỉ phát người phụ nữ Cameroon vào năm 2009 [39]  Nhóm M chiếm 90% HIV-1 gây đại dịch tồn giới Trong nhóm M lại chia thành phân type: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J K Đơi có tượng virus thuộc phân type khác nhau, diện tế bào người nhiễm hòa trộn chất liệu di truyền để tạo thành virus lai Nhiều virus thuộc chủng có khả sống sót khơng cao, chủng lây nhiễm gọi CRF (Circulating Recombinat Forms) CRF A/E coi lai tạo phân type A phân type gốc E Tuy nhiên, chưa tìm thấy phân type E dạng riêng rẽ nên hầu hết người ta coi CRF A/E phân type E (trên thực tế tên gọi CRF01_AE) [40] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức -6- HIV-2 phát bệnh nhân Cameroon vào năm 1985 thường thấy xuất tây phi, gặp nơi khác [49] HIV-2 chia thành phân type A, B, C, D, E, F, G, H (hình 1.1) [34,42] Trong giới hạn luận văn này, tơi tìm hiểu loại HIV-1 loại virus gây đại dịch HIV/AIDS giới 1.1.2.3 Đặc điểm hình thái cấu trúc HIV HIV có dạng hình cầu, kích thước 100 – 120nm Về cấu tạo HIV gồm phần lớp vỏ, lớp protein lõi capsid (hình 1.2) [1]  Lớp vỏ (Envelope): Vỏ ngồi có cấu tạo từ lớp lipid kép với gai glycoprotein Mỗi gai có hai tiểu đơn vị glycoprotein có khối lượng 41kDa gp41 cắm xuyên màng glycoprotein có khối lượng 120kDa (gp120) gắn với gp41 nhờ cầu nối disulfua tạo thành gp160  Lớp Protein (Matrix protein): Nằm sau lớp vỏ lớp protein có khối lượng phân tử 17kDa (p17)  Lõi capsid: Có dạng hình trụ lệch tâm, cấu thành protein có khối lượng 24kDa (p24) Bên hai sợi RNA đơn, protein lõi (p7 p9) enzyme phiên mã ngược [1] Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc virus HIV[50] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ 1.1.2.4 -7- Trần Minh Đức Cấu trúc hệ gen HIV Genome HIV bao gồm hai chuỗi RNA đơn, giống Mỗi chuỗi có kích thước khoảng 9200bp, gồm có gen với nhóm chính: nhóm gen cấu trúc (gag, pol, env) nhóm gen điều hịa (tat, rev, nef, vif, vpr, vpu) (hình 1.3) [50]  Nhóm gen cấu trúc  Gag (group-specific-antigen): mã hố kháng ngun đặc hiệu nhóm bao gồm gen mã hóa tổng hợp protein nền, lõi capsid cấu trúc protein lõi (nuclecapsid protein)  Pol (polymerase): mã hóa tổng hợp protease, enzyme phiên mã ngược intergrase  Env (envelope): mã hóa tổng hợp kháng nguyên bề mặt gp160 với hai tiểu phần gp41 gp120  Nhóm gen điều hịa  Tat (Trans Activator of Transcription – yếu tố hoạt hóa phiên mã) Gen tat kích hoạt gen mã hố protein cấu trúc, protein điều hòa (kể gen tat) Gen tat mã hóa tổng hợp protein Tat, có 102 amino acid, protein chịu trách nhiệm hoạt hóa phiên mã virus thơng qua việc tạo vị trí gắn cho RNA pol protein khác tế bào  Rev (Regulator of Expression of Virion proteins – yếu tố điều hòa biểu protein hạt virus) : Gen rev có chức phận điều chỉnh trình nhân lên virus thơng qua gen tat nef, mã hóa tổng hợp cho protein Rev Rev bao gồm 117 amino acid, protein có chức chuyển mRNA tế bào chất  nef (Negative Regulator Factor - yếu tố điều hịa âm): mã hóa cho protein Nef, ức chế tăng cường tái virus, phụ thuộc vào chủng loại tế bào Trong tế bào nhiễm, Nef thay đổi đường vận chuyển endosome, qua giảm biểu protein CD4, MHC I MHC II bề mặt tế bào nhiễm Những thay đổi bảo vệ tế bào nhiễm HIV khỏi giám sát miễn dịch Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ  -8- Trần Minh Đức Vif (Virion Infectivity Factor - yếu tố lây nhiễm virus): mã hóa protein Vif, làm tăng tính thâm nhập virus vào tế bào chủ tự giúp ngăn chặn xâm nhập enzyme tế bào chủ ngăn cản tái virus vào virion hình thành  Vpu (Viral Protein U - protein U virus): mã hóa protein Vpu, có tác dụng tăng cường giải phóng virus khỏi tế bào, làm giảm biểu CD4, MHC I bề mặt tế bào  Vpr (Viral Protein R - protein R virus): mã hóa protein Vpr, có tác dụng tăng cường tái virus tế bào ban đầu, protein liên kết với virion, ngăn cản pha G2/M, tín hiệu định vị nhân [43], [44], [46] Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome HIV[44] 1.1.3 Chu trình virus HIV HIV có khả xâm nhập nhiều loại tế bào: tế bào lympho T hỗ trợ (TH) có thụ thể CD4, tế bào đơn nhân, đại thực bào tế bào tương tự như: tế bào tua (ở da niêm mạc (Langerhans), hạch lympho), tế bào thần kinh đệm (microglia) hệ thần kinh trung ương Nhưng xét sinh bệnh học, tế bào lympho T có CD4 hệ thống đại thực bào đơn nhân tế bào đích HIV CD4 protein tiếp nhận, giúp cho HIV gắn với tế bào [1], [17] Sự xâm nhập nhân lên virus HIV chia làm bốn giai đoạn chính: Gắn kết xâm nhiễm vào tế bào; phiên mã ngược cài xen; chép dịch mã; lắp ráp trưởng thành (hình 1.4) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 43 - kết thúc, khơng có mã kết thúc gen, đảm bảo cho trình biểu thành công vi khuẩn (các kết khơng trình bày đây) 3.2.3 Biểu gen p24 vi khuẩn E coli Để biểu gen mã hóa protein p24, chúng tơi sử dụng chủng biểu E coli BL21 (DE3) Star™ Chủng có ưu điểm hạn chế phân cắt protease protein ngoại lai, giúp cho protein ngoại lai ổn định tế bào sau tổng hợp Ngoài DNA hệ gen E coli BL21 (DE3) Star™ có chứa gen mã hóa cho T7 RNA polymerase, có nguồn gốc từ bacteriophage λ DE3 Gen đưa vào hệ gen E coli BL21 (DE3) Star™ đặt điều khiển promoter lacUV5 nên cần IPTG để cảm ứng biểu T7 RNA polymerase [65] Vector biểu tái tổ hợp mang gen p24 với khung đọc chuẩn biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) Star™ phương pháp sốc nhiệt Dịch tế bào sau biến nạp cấy trải mơi trường LB đặc có bổ sung Amp nuôi 370C qua đêm Kết biến nạp thu khuẩn lạc tròn riêng rẽ Chọn khuẩn lạc riêng rẽ bất kỳ, nuôi qua đêm mơi trường LB lỏng có bổ sung Amp lắc với tốc độ 200 v/p 37oC Sau dịch nuôi cấy qua đêm cấy chuyển sang môi trường LB lỏng (tỷ lệ 1:100) có bổ sung Amp nuôi lắc tiếp OD600 đạt 0,6-0,8 (khoảng 2-3 giờ) bổ sung chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối 1mM nuôi tiếp 370C Protein tổng số dịch chiết tế bào phân tích gel polyacrylamide 12,5% (hình 3.8) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 44 - 36kDa Hình 3.8: Kết biểu protein tái tổ hợp p24 kiểm tra gel polyacrylamide 12,5% Giếng 1: Marker protein Giếng 2, 4: Mẫu không cảm ứng với IPTG Giếng 3,5: Mẫu cảm ứng với IPTG Protein tái tổ hợp p24 tổng hợp bao gồm 109 amino acid Thioredoxin, histidine dung hợp với 195 amino acid p24 Tổng cộng 310 amino acid, tính theo lý thuyết trọng lượng phân tử protein tái tổ hợp khoảng 36kda Kết điện di cho thấy xuất băng protein đậm mẫu cảm ứng có kích thước khoảng 36kda, kích thước phù hợp với tính tốn lý thuyết chúng tơi (hình 3.8) 3.3 Tối ƣu hóa điều kiện biểu Trước biểu lượng lớn để thu nhận lượng protein tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo, tiến hành khảo sát điều kiện ni cấy nhằm tìm điều kiện biểu tối ưu 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển tế bào vật chủ chứa plasmid tái tổ hợp, qua ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng protein tái tổ hợp Một số protein ngoại lai tổng hợp tốt 370C tốc độ sinh trưởng chủng đạt tối đa Tuy nhiên, tế bào phát triển mạnh protein tái tổ hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ - 45 - Trần Minh Đức tổng hợp liên tục phần protein tồn dạng khơng hịa tan Các protein trạng thái không tan thường không đảm bảo hoạt tính sinh học Vì cần phải khảo sát nhiệt độ ni cấy để tìm nhiệt độ ni cấy thích hợp, mà protein ngoại lai tổng hợp nhiều có chất lượng tốt Để tiến hành khảo sát, nuôi cấy chủng E coli BL21 (DE3) Star™ mang vector pET32a+ tái tổ hợp 370C đến OD600 đạt 0,6-0,8 Sau đó, tế bào cảm ứng 1mM IPTG tiếp tục nuôi lắc 28, 30 370C Sau mẫu xử lý với điều kiện tiến hành kiểm tra điện di gel polyacrylamide 12,5% kDa 116 62,5 45 35 36kDa 25 18 14,4 Hình 3.9: Ảnh hƣởng nhiệt độ khả sinh tổng hợp protein p24 tái tổ hợp Giếng 1: Marker protein Giếng 2, 4, 6: Mẫu không cảm ứng nuôi cấy 28, 30, 370C Giếng 3, 5, 7: Mẫu cảm ứng 1mM IPTG nuôi cấy 28, 30, 370C Kết phân tích điện di gel polyacrylamide (hình 3.9) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng khác tới trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp Tại 370C, kết tổng hợp protein tái tổ hợp tốt Tuy nhiên kiểm tra trạng thái biểu protein p24 tái tổ hợp nhiệt độ khảo sát trên, p24 biểu dạng hịa tan Vì chúng tơi chọn 370C nhiệt độ nuôi cấy cho nghiên cứu (kết khơng trình bày đây) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ 3.3.2 Trần Minh Đức - 46 - Ảnh hưởng nồng độ IPTG Để kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IPTG lên trình tổng hợp protein ngoại lai, nuôi cấy chủng E coli BL21 Star™ (DE3) mang vector pQH09-p24 370C đến OD600 đạt 0,6-0,8 Sau đó, bổ sung với nồng độ IPTG khác nhau: 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1mM tiếp tục nuôi lắc 370C Kết phân tích điện di gel polyacrylamide cho thấy nồng độ IPTG khác có ảnh hưởng khác tới q trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp (hình 3.10) kDa 116 66,2 45 36kDa 45,0 35 35,0hƣởng nồng độ IPTG (mM) lên khả sinh tổng hợp Hình 3.11: Ảnh 45,0 protein p24 tái tổ hợp Giếng 1: Marker protein 35,0 2: Mẫu đối chứng, không cảm ứng IPTG Giếng Giếng 3, 4, 5, 6: Mẫu cảm ứng nồng độ IPTG tương ứng 0,2; 0,5; 0,75;1mM Từ kết điện di cho thấy lượng protein tái tổ hợp thu nồng độ: 0,5mM; 0,75mM ; 1mM gần tương đương (hình 3.11) Vì chúng tơi chọn nồng độ tối ưu cho chất cảm ứng (IPTG) 0,5mM 3.3.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới biểu protein tái hợp Trong thí nghiệm khảo sát thời gian ni cấy thích hợp, chủng biểu cảm ứng với 0,5 mM IPTG nuôi cấy 370C Dịch tế bào thu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 47 - thời điểm khác nhau: 0, 1, 2, 3, 4, kiểm tra protein tổng số gel polyacrylamide để xác định thời gian thích hợp cho việc thu nhận protein tái tổ hợp kDa 116 66,2 45 36kDa 35 Hình 3.12: Kết thu nhận protein tái tổ hợp thời điểm khác Giếng 1: Marker protein Giếng 2:Mẫu đối chứng sau cảm ứng Giếng 3, 4, 5, 6: Mẫu thu thời điểm giờ, giờ, giờ, sau cảm ứng tương Kết điện di cho thấy hàm lượng protein tái tổ hợp tăng dần sau nuôi cấy cảm ứng đạt tối đa sau Sau nuôi cấy sau cảm ứng hàm lượng protein bắt đầu giảm (hình 3.12) Lý tượng hàm lượng protein tái tổ hợp giảm sau nuôi cấy chưa hiểu rõ, protein p24 bị phân hủy protease vi khuẩn chủ.Vì xác định thời gian thu hồi protein tái tổ hợp tối ưu sau cảm ứng IPTG Qua khảo sat chúng tơi tìm điều kiện tối ưu cho biểu p24 tái tổ hợp 370C, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM thu nhận protein tái tổ hợp sau nuôi cấy cảm ứng Đây điều kiện nuôi cấy áp dụng cho bước nghiên cứu 3.4 Tinh protein tái tổ hợp Để sử dụng protein tái tổ hợp phục vụ cho mục đích nghiên cứu tiếp theo, tiến hành tinh protein tái tổ hợp Do protein tái tổ hợp có histidine nên có lực cao với ion Ni2+ cột Probond Nickel-Chelating resin (Invitrogen) Trong trình tinh chế, imidazole sử dụng chất cạnh tranh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 48 - Ni2+ phức hợp Ni2+-histidine protein tái tổ hợp Nhiều protein chủng chủ có mang histidine nên có lực với Ni2+ cột Tuy nhiên, lực liên kết protein với Ni2+ yếu nhiều so với protein tái tổ hợp histidine liền kề đầu C protein tái tổ hợp làm tăng lực với Ni2+ lên nhiều lần Các protein có lực yếu bị rửa trơi khỏi cột cách tăng dần nồng độ imidazole dung dịch rửa cột Để loại bỏ hiệu protein tạp chủng vi khuẩn chủ không loại protein đích p24, chúng tơi khảo sát nồng độ imidazole từ 20 mM đến 50 mM để bổ sung vào đệm rửa 10 10 10 kDa 116 66,2 45 35 25 18 A B C Hình 3.13: Khảo sát nồng độ Imidazole bổ sung vào đệm rửa trình tinh chế protein p24 tái tổ hợp A: Tinh chế với nồng độ Imidazole 20mM B: Tinh chế với nồng độ Imidazole 40mM, C: Tinh chế với nồng độ Imidazole 50mM Giếng 1(A, B, C): Marker protein Giếng 2-10 (A, B, C): Các phân đoạn protein thu sau đẩy khỏi cột Kết điện di đồ cho thấy bổ sung nồng độ Imidazole 50 mM đệm rửa loại bỏ hầu hết protein tạp, thu protein tái tổ hợp tương đối (hình 3.13C) Vì chúng tơi chọn phương án bổ sung 50 mM Imidazole vào đệm rửa trình tinh protein tái tổ hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 49 - 3.5 Kiểm tra khả phát kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân p24 tái tổ hợp Mục đích cuối việc biểu p24 tái tổ hợp sử dụng kháng nguyên để phát kháng thể kháng lại huyết bệnh nhân HIV Protein p24 tái tổ hợp sau tinh chế ứng dụng để phát kháng thể huyết bệnh nhân Tiến hành thử nghiệm 30 mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HIV thuộc hai phân type B CRF01_AE kỹ thuật Western blot Mặt khác để kiểm tra khả phản ứng chéo hai phân type, cho kháng nguyên p24 tái tổ hợp phân type CRF01_AE phản ứng với ba loại kháng thể: kháng thể bệnh nhân nhiễm HIV thuộc phân type AE, kháng thể bệnh nhân nhiễm phân type B kháng thể âm tính với HIV Kết cho thấy mức độ phản ứng protein tái tổ hợp với mẫu huyết có khác biệt rõ ràng (hình3.14) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 kDa 72 55 43 34 26 17 - Hình 3.14: Kết kiểm tra phản ứng protein p24 tái tổ hợp với kháng thể huyết bệnh nhân kỹ thuật western blot Đường chạy 1, 23: Marker protein Đường chạy 2, 3, 6, 8, 14, 16, 18, 21, 22: Phản ứng kháng nguyên p24 với huyết bệnh nhân nhiễm HIV thuộc phân type CRF01_AE Đường chạy: 9, 15, 17: Phản ứng kháng nguyên p24 với huyết bệnh nhân nhiễm HIV thuộc phân type B;Đường chạy 5: Phản ứng kháng nguyên Thioredoxin với với huyết bệnh nhân nhiễm HIV thuộc phân type CRF01_ AE; Đương chạy 4, 7,10, 11, 12, 13, 19, 20: huyết âm tính với HIV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ - 50 - Trần Minh Đức Phản ứng màng PVDF cho thấy tất mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HIV thuộc phân type CRF01_AE phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên p24 tái tổ hợp, thể băng đậm Những mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HIV thuộc phân type B phản ứng với kháng nguyên tái tổ hợp p24 mức độ phản ứng hơn, cụ thể xuất băng mờ nhiều so với phản ứng kháng nguyên kháng thể thuộc phân type CRF01_AE Những mẫu huyết âm tính với HIV, hồn tồn khơng xảy phản ứng kháng ngun kháng thể Trong 23 mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HIV, cách sử dụng kháng nguyên p24 tái tổ hợp để phát kháng thể kháng p24 chúng tơi nhận thấy qua phản ứng Western blot, có 12 mẫu cho kết dương tính mẫu cho kết âm tính trước xác định dương tính với HIV mẫu cho kết âm tính có nhiều ngun nhân, việc khơng có kháng thể kháng p24 khả xảy Kháng thể kháng p24 xuất đầu tiên, tiếp tục tồn huyết sau kháng thể kháng protein vỏ khác gp120 gp41mới bắt đầu xuất Sau vài tháng vài năm, kháng thể p24 báo hiệu giai đoạn triệu chứng bệnh Vì mẫu cho kết âm tính bệnh nhân nhiễm HIV nhiễm bệnh giai đoạn triệu chứng, kháng thể kháng p24 khơng cịn tồn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 51 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Tách dịng thành cơng đoạn gen mã hoá cho protein p24 virus HIV phân type CRF01_AE So sánh với trình tự gen p24 cơng bố ngân hàng gen quốc tế cho thấy gen p24 chủng virus HIV phân type CRF01_AE phân lập Việt Nam có độ tương đồng cao (98-99%) so với trình gen p24 phân type virus lưu hành Trung Quốc Thái Lan Thiết kế vectơ biểu pET32a(+) mang gen p24 biểu thành công protein tái tổ hợp p24 virus HIV phân type CRF01_AE vi khuẩn E coli chủng BL21 (DE3) Star™ Tối ưu hóa điều kiện biểu để nâng cao hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp Tinh protein tái tổ hợp p24 cột sắc ký lực Probond Nickel-Chelating Resin Kiểm tra khả phản ứng protein p24 tái tổ hợp với mẫu huyết bệnh nhân kỹ thuật Western Blot Protein tái tổ hợp p24 phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng HIV mẫu huyết dương tính khơng phản ứng với mẫu âm tính Kiến nghị: Tiếp tục nghiên cứu sử dụng protein tái tổ hợp để chế tạo kit chẩn đốn HIV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 52 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt Phạm Văn Ty (2004), Virut học, NXB Giáo dục, Hà Nội Bùi Ngọc Đại, Nguyễn Văn Mùi, Nguyễn Hoàng Tuấn (2005), Bệnh học truyền nhiễm, NXB Y học, Hà Nội Phạm Nhật An Cs (1995), Nhiễm HIV/AIDS y học sở lâm sàng phòng chống, NXB Y học, Hà Nội Đỗ Trung Phấn (1999), HIV/AIDS an toàn truyền máu, NXB Y học, Hà Nội (24-47) Bộ Y Tế (2005), “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị HIV/AIDS” Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Bộ Y tế (2009), “Hướng dẫn quốc gia xét nghiệm HIV” Bộ Y tế (2005), “Ước tính dự báo HIV/AIDS Việt nam giai đoạn 20052010” Bộ Y Tế (2010) “Tình hình dịch nhiễm HIV/AIDS tồn quốc Q I/2010” Cục phịng chống HIV/AIDS” 10 Bộ Y tế (2010), “Cơng tác phịng, chống HIV/AIDS tháng năm 2010 Phương hướng nhiệm vụ chủ yếu năm 2011” 11 Trường Đại học Y khoa Hà Nội (1995), Nhiễm HIV/AIDS, Y học sở lâm sàng phòng chống, NXB Y học, Hà Nội 12 http://www.bvbnd.vn/index.php?option=com_content&view=article&id= 453:tinh-hinh-nhim-hivaids-thang-11-nm-2010&catid=21:tin-tc%29 13 http://ehospital.vn/Home/nckh/2009/04/358.aspx 14 http://hemoviet.org.vn/Tin-tuc/Chi-tiet/d%E1%BA%A0ic%C6%AF%C6%A0ng-v%E1%BB%80-hivaids_tin61dm4.html 15 http://www.vaac.gov.vn 16 http://www.Dostquangtri.gov.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 53 - Tài liệu tham khảo tiếng anh 17 Berger, E A (1997) “HIV entry and tropism: the chemokine receptor connection” AIDS11 (suppl A), S3-S16 18 Weissenhorn W., Dessen A., Calder L.J., Harrison S.C., Skehel J.J., Wiley D.C (1999), “Structural basis for membrane fusion by enveloped viruses” Molecular Membrane Biology, 16 (1), pp 3-9 19 http://www.aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/HIVLifeCycle_FS_en.pdf 20 http://en.wikipedia.org/wiki/HIV 21 http://www.avert.org/origin-aids-hiv.htm 22 Haseltine, William A., Flossie Wong-Staal (1988), "The Molecular Biology of the AIDS Virus", Scientific American, 23 (2), pp 52-60 23 C Berthet-Colominas, S Monaco, A Novelli, G Sibaï, F Mallet, and S Cusack, (1999), “Head-to-tail dimers and interdomain flexibility revealed by the crystal structure of HIV-1 capsid protein (p24) complexed with a monoclonal antibody Fab”, EMBO J; 18(5): 1124–1136 24 Gelderblom HR, Hausmann EH, Ozel M, Pauli G, Koch MA (1987), “ Fine structure of human immunodeficiency virus (HIV) and immunolocalization of structure protein” Virology 156: 171-176 25 David K Worthylake, Hui Wang, Sanghee Yoo, Wesley I Sundquist, Christopher P Hill (1999), “Structures of the HIV-1 capsid protein dimerization domain at 2.6 Å resolution”, Volume 55, Issue 1, pages 85– 92 26 Mateu MG (2009), “The capsid protein of human immunodeficiency virus: intersubunit interactions during virus assembly”, FEBS J., 276(21):6098109 27 http://aptamerstream.blogspot.com/2010/08/aptamer-selection-for-integralhiv.html 28 Theresa R Gamble, Sanghee Yoo, Felix F Vajdos, Uta K von Schwedler, David K Worthylake, Hui Wang, John P McCutcheon, WesleyI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ Trần Minh Đức - 54 - Sundquist, Christopher P Hill (1997), “Structure of the Carboxyl Terminal Dimerization Domain of the HIV-1 Capsid Protein” Vol 278 no 5339 pp.849-853 29 Rossitza K Gitti, Brian M Lee, Jill Walker, Michael F Summers, Sanghee Yoo and Wesley I Sundquist (1996), “ Structure of the Amino-Terminal Core Domain of the HIV-1 Capsid Protein ” Science, Vol 273 no 5272 pp 231-235 30 http://blog.targethealth.com/?p=517 31 Pornillos, O., Ganser-Pornillos, B K., Kelly, B N., Hua, Y., Whitby, F G., Stout, C D., Sundquist, W I., Hill, C P., and M Yeager, M (2009), “Xray structures of the hexameric building block of the HIV capsid, Cell 137,1 32 Franỗois Ternois, Jana Sticht, Stộphane Duquerroy, Hans-Georg Kräusslich & Félix A Rey (2005), ”The HIV-1 capsid protein C-terminal domain in complex with a virus assembly inhibitor”, Nature Structural & Molecular Biology 12, 678 – 682 33 Andrea Rubbert, Mario Ostrowski (2005), Pathogenesis of HIV-1 Infection, ASM, Washington DC., USA 34 Angus G Dalgleish, Robin A Weiss (1999), HIV and the new viruses, Second edition, Academic press, San Diego, pp 14-249 35 Lennette E.H., Schmidt N.J (1979), “Diagnostic procedures for viral, Rickettsial and Chlamydial infection”, Ameican Public Health Associantion, New York, pp 879-899 36 UNAIDS REPORT ON THE GLOBAL AIDS EPIDEMIC 2010 37 Donovan R.S., Robinson C.W., Glick B.R (2000), “Optimizing the expression of a monoclonal antibody fragment under the transcriptional control of the Escherichia coli lac promoter”, Canadian Journal of Microbiology, 46, pp 532-541 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ - 55 - Trần Minh Đức 38 Barre-Sinoussi F, Chermann J.C., Rey F (1983), “Isolation of a Tlymphotropic retrovirus from a patient at risk for AIDS”, Science, 220, pp 868-71 39 Plantier, J.C (2009) “A new human immunodeficiency virus derived from gorilla”, Nature Medicine 40 http://www.avert.org/hiv-types.htm 41 http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html 42 Mascolini M (2005), “HIV, HBV, and HCV in Europe: border crossing and buried tombs IAPAC European sessions 2005 October 6-7, 2005 Amsterdam, The Netherlands”, IAPAC Mon, 11(12), pp.386-390, 393403 43 Howard Hughes Medical Institute, Department of Chemistry, University of Maryland Baltimore County, 1000 Hilltop Circle, Baltimore, MD, 21250, USA 44 Bukrinsky M., Adzhubei A (1999), “Viral protein R of HIV-1”, Rev Med Virol, 9, pp 39-49 45 Ishizaki A, Cuong NH, Thuc PV, Trung NV, Saijoh K, Kageyama S, Ishigaki K, Tanuma J, Oka S, Ichimura H (2009), “Profile of HIV type infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in treatment-naive HIV type 1-infected individuals in Hai Phong, Viet Nam”, AIDS Res Hum Retroviruses 25(2):175-82 46 Mandell, Bennett, Dolin (2005), Principles and Practice of Infectious Diseases, Sixth edition, An Imprint of Elsevier, UK, pp 1729-3323 47 Lan NT, Recordon-Pinson P, Hung PV, Uyen NT, Lien TT, Tien HT, Garrigue I, Schrive MH, Pellegrin I, Lafon ME, Aboulker JP, BarréSinousi F, Fleury HJ (2003), “HIV type isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam): ANRS 1257 Study Large predominance of CRF01_AE and presence of major resistance mutations to antiretroviral drugs”, AIDS Res Hum Retroviruses, 19(10):925-8 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ 48 - 56 - Trần Minh Đức Tran TT, Maljkovic I, Swartling S, Phung DC, Chiodi F, Leitner T (2004), “HIV-1 CRF01_AE in intravenous drug users in Hanoi, Vietnam” AIDS Res Hum Retroviruses 20(3):341-5 49 http://uhavax.hartford.edu/bugl/hiv.htm 50 http://www.aidstruth.org/documents/structural-biology-of-hiv.pdf 51 http://www.avert.org/origin-aids-hiv.htm 52 http://www.avert.org/aids-history-86.htm 53 Montagnier L, Chermann JC, Barré-Sinoussi F, Klatzmann D, WainHobson S, Alizon M, Clavel F, Brun-Vezinet F, Vilmer E, Rouzioux C (1984) “Lymphadenopathy associated virus and its etiological role in AIDS”, Princess Takamatsu Symp.15:319-31 54 http://www.jenabioscience.com/images/e7b121c2b2/PR-1231.pdf 55 Ly TD, Laperche S, Courouce AM (2001), “Early detection of human immunodeficiency virus infection using third and fourth genration screening assays” Eur J Clin Microbiol Infect Dis; 20:104–10 56 Poljak M, Babic D, Seme K (2002), “Retrospective evaluation of the Vidas HIV DUO test for simultaneous detection of anti-HIV antibody and p24 antigen”, Acta Dermato Venerologica: Alpina, Pannonica et Adriatica; 11 57 Mahboudi F, Irina NA, Chevalier A, Ghadiri A, Adeli A, Amini-BavilOlyaee S, Barkhordari F, Farzamfar B, Alinejad M (2006), “A serological screening assay of human immunodeficiency virus type antibodies based on recombinant protein p24-gp41 as a fusion protein expressed in Escherichia coli”, J Biotechnol.125(2):295-303 58 Respess RA, Cachafeiro A, Withum D, et al (2005), “Evaluation of an ultrasensitive p24 antigen assay as a potential alternative to human immunodeficiency virus type RNA viral load assay in resource-limited settings”, J Clin Microbiol 43:506–508 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn thạc Sỹ 59 - 57 - Trần Minh Đức Caliendo AM, “Techniques and interpretation of HIV-1 RNA quantitation”, Official reprint from UpToDate Available at: http://www.up-todate.com February 1, 2003 60 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989), “Molecular cloning I, II, III”, A Laboratory Mannual Cold Spring Harbor Laboratory Press, London, UK 61 http://en.wikipedia.org/wiki/Lentivirus Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ………… o0o………… TRẦN MINH ĐỨC TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN P24 CỦA VIRUS HIV – CRFO1_AE LƯU HÀNH TẠI VIỆT NAM VÀ ỨNG DỤNG PROTEIN TÁI TỔ... protein tái tổ hợp với mẫu huyết có khác biệt rõ ràng (hình3 .14 ) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 kDa 72 55 43 34 26 17 - Hình 3 .14 : Kết kiểm tra phản ứng protein p24 tái tổ hợp với... Đức 1. 3.3.2 Tình hình HIV/ AIDS Việt Nam Tại Việt Nam, trường hợp nhiễm HIV phát vào 12 /19 90, 12 /19 92 có thêm 11 trường hợp bị nhiễm HIV đến tháng 06 /19 99, tồn quốc có 13 .623 trường hợp nhiễm HIV,