Nghiên cứu quy trình biểu hiện gen mã hóa protein ESAT6 CFP10 phục vụ việc chế tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HÀ THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA KHÁNG NGUN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 PHỤC VỤ VIỆC CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN NHIỄM LAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - HÀ THỊ HIÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 PHỤC VỤ VIỆC CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN NHIỄM LAO Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THÁI SƠN PGS.TS NGÔ TỰ THÀNH Hà Nội – Năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơnngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn PGS.TS Ngô Tự Thành giúp đỡ thông qua cho luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, đặc biệt thầy, cô môn Vi sinh vật học, trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên-Đại học Quốc Gia Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền đạt cho tơi kiến thức bổ ích suốt q trình tơi học tập trƣờng Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể phòng Sinh học phân tử-Khoa Miễn dịch sinh học phân tử- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ƣơng tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ ủng hộ suốt trình thực đề tài Tơi xin đƣợc cảm ơn gia đình, bạn bè ln quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa học Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2014 Học viên Hà Thị Hiên i MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 KHÁI QUÁT VỀ BỆNH LAO Error! Bookmark not defined 1.4 VI KHUẨN LAO Error! Bookmark not defined 1.4.1 Đặc điểm phân loại Error! Bookmark not defined 1.4.2 Đặc điểm hình thái Error! Bookmark not defined 1.4.3 Cấu trúc thành tế bào Error! Bookmark not defined 1.4.4 Đặc điểm nuôi cấy Error! Bookmark not defined 1.4.4.1 Môi trƣờng dạng khuẩn lạc Error! Bookmark not defined 1.4.4.2 Chu kì tế bào Error! Bookmark not defined 1.4.5 Khả gây bệnh Error! Bookmark not defined 1.4.6 Đặc điểm hệ gen vi khuẩn lao Error! Bookmark not defined 1.4.6.1 Đặc điểm hệ gen Mycobacteria tuberculosisError! Bookmark not defined 1.4.6.2 Đặc điểm di truyền vùng gene biệt hóa RD1.Error! Bookmark not defined 1.5 PROTEIN ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 1.5.1 Cấu trúc phân tử phức hệ protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 1.5.2 Kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6-CFP10 tiềm ứng dụng.Error! Bookmark not defined Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined ii 2.4 PHƢƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử Error! Bookmark not defined 2.4.2.1 Tách chiết ADN Error! Bookmark not defined 2.4.2.2 PCR khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 Error! Bookmark not defined 2.4.2.3 Tách dòng gen mã hóa protein ESAT6-CFP10.Error! Bookmark not defined 2.4.2.4 Giải trình tự ADN Error! Bookmark not defined 2.4.2.5 Thiết kế vector tách dòng pGEMT chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined 2.4.2.6 Thiết kế vector biểu pET21a chứa đoạn gen mã hóa protein CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined 2.4.2.7 Biểu protein ESAT6-CFP10 tế bào vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) Error! Bookmark not defined 2.4.2.8 Tinh protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 3.1.1 Xác định tính ổn định gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 3.1.1.1 Kết khuếch đại trình tự gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 M.tuberculosis Error! Bookmark not defined 3.1.1.2 Xác định tính ổn định gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 3.1.2 Kết tách dòng Error! Bookmark not defined iii 3.1.2.1 Kết khuếch đại, nối gen mã hóa protein ESAT6-CFP10 M.tuberculosis Error! Bookmark not defined 3.1.2.2 Kết tách dòng Error! Bookmark not defined 3.1.2.3 Kết thiết kế vector biểu pET21a+ mang gen ESAT6-CFP10 Error! Bookmark not defined 3.1.2.3.1 Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le gen pET21a+ Error! Bookmark not defined 3.1.2.3.2 Gắn đoạn gen đích vào vector biểu pET21a+ Error! Bookmark not defined 3.1.2.3.3 Chọn lọc dòng tế bào chứa vector tái tổ hợp phản ứng PCRcolonies Error! Bookmark not defined 3.2 KẾT QUẢ BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 3.2.1 Biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/ESAT6-CFP10 vào E.coli chủng BL21(DE3) Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kiểm tra biểu gen CFP10/ESAT6Error! Bookmark not defined 3.2.3 Tối ƣu điều kiện biểu protein tái tổ hợp CFP10-ESAT6 Error! Bookmark not defined 3.2.3.1 Kết tối ƣu nhiệt độ cảm ứng Error! Bookmark not defined 3.2.3.2 Kết tối ƣu nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian cảm ứng gen CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined 3.2.4 Tinh protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined 3.2.5 Kiểm tra độ tinh sản phẩm Error! Bookmark not defined 3.2.6 Kết kiểm tra protein tái tổ hợp kháng thể đặc hiệu Error! Bookmark not defined 3.2.7 Xác định hoạt tính kháng nguyên Error! Bookmark not defined iv KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các sinh phẩm hóa chất Error! Bookmark not defined Bảng 2.2 Các máy thiết bị Error! Bookmark not defined Bảng 2.3 Các cặp mồi dùng nghiên cứuError! Bookmark not defined Bảng 3.1 Mức độ tƣơng đồng gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 từ chủng vi khuẩn lao Việt Nam so sánh với chủng chuẩn H37Rv Error! Bookmark not defined Bảng 3.2 Mức độ biểu CFP10/ESAT6 điều kiện khác Error! Bookmark not defined Bảng 3.3 Nồng độ độc tố sản phẩm Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Đáp ứng với nồng độ kháng nguyên khác Error! Bookmark not defined vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn lao M tuberculosis kính hiển vi điện tử [57] Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Trực khuẩn M tuberculosis sau nhuộm Ziehl – Nielsen [57] Error! Bookmark not defined Hình 1.3 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn lao [72].Error! Bookmark not defined Hình 1.4 Khuẩn lạc M tuberculosis môi trƣờng Lowenstein - Jensen Error! Bookmark not defined Hình 1.5 Vùng gen RD [31] Error! Bookmark not defined Hình 1.6 Mơ cấu trúc phức hệ protein ESAT6/CFP10 [49] Error! Bookmark not defined Hình 3.1 Kết khuếch đại gen mã hóa protein ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined Hình 3.2 Kết khuếch đại gene mã hóa protein CFP10 ESAT6 Error! Bookmark not defined Hình 3.3 Khuẩn lạc sau biến nạp plasmid.Error! Bookmark not defined Hình 3.4 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại plasmid tái tổ hợp, sử dụng cặp mồi P1, P4 Error! Bookmark not defined Hình 3.5 Kết mở vòng pET21a+ pGEMT/ESAT6/CFP10 Error! Bookmark not defined Hình 3.6 Trình tự khung đọc mở mã hóa protein CFP10/ESAT6 Error! Bookmark not defined Hình 3.7 Kết kiểm tra khuẩn lạc chứa pET21a+/CFP10-ESAT6 Error! Bookmark not defined vii Hình 3.8 Kết kiểm tra protein đích gel SDS.Error! Bookmark not defined Hình 3.9 Kết cảm ứng điều kiện nhiệt độ khác nhau.Error! Bookmark not defined Hình 3.10 Kết tinh protein tái tổ hợp.Error! Bookmark not defined Hình 3.11: Westerm blot Error! Bookmark not defined Hình 3.12: Westerm blot Error! Bookmark not defined viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BCG Bp Bacillus Calmette-Guérin ` Base pair (Cặp bazo) CFP10 Culture Filtetrate Protein 10 CTCLQG Chƣơng trình chống lao Quốc gia DNA Deoxyribonucleotide acid ESAT6 Early Secretory Antigenic Target INF γ Interferon gamma IS Insert sequence (Trình tự chèn) MDR Multi drug resistant (Chủng lao đa kháng thuốc) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RD1 Region deletion RFLP Restriction fragment length polymorphisms (Đa hình độ dài đoạn cắt enzym giới hạn) RNA Ribonucleotide acid TST Tuberculin Skin Test (Phản ứng mẫn muộn với tuberculin) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế Giới) XDR Extensively drug resistant (Chủng lao kháng thuốc tuyệt đối) ix MỞ ĐẦU Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỉ lệ nhiễm lao chiếm 1/3 dân số giới Hàng năm có thêm khoảng triệu ngƣời mắc lao có khoảng triệu ngƣời chết lao [6] Tuy nhiên, theo ƣớc tính tỷ lệ phát bệnh đạt 37% Nhƣ số bệnh nhân mắc lao nhƣng không đƣợc phát chữa trị kịp thời chiếm đến 63%, nguồn lây nhiễm khó kiểm sốt Việt Nam 22 nƣớc có tỉ lệ nhiễm lao cao giới Tính riêng khu vực Tây Thái Bình Dƣơng, Việt Nam đứng thứ 3, sau Trung Quốc Philipine [6, 70 ] Điều đồng nghĩa với việc Việt Nam phải đối mặt với nguy lây nhiễm lao cộng đồng mà nguyên nhân lây nhiễm lao trƣớc chẩn đoán Số ngƣời mắc bệnh lao ngày tăng, số ngƣời không đƣợc phát hiện, điều trị nhiều nguồn lây nhiễm đến cộng đồng Mặt khác, số ngƣời mắc đƣợc phát hiện, điều trị có đến 20% bệnh nhân khơng khỏi kháng thuốc làm tăng nguy lây lan nhanh bệnh lao [6] Trƣớc diễn biến nghiêm trọng đó, WHO kêu gọi quốc gia giới quan tâm đặc biệt đến phịng chống kiểm sốt bệnh lao Bệnh lao ngày trở nên nguy hiểm hơn, đặc biệt lao kháng đa thuốc gây tử vong lớn, việc phát điều trị sớm trở nên cần thiết Việc kiểm soát bệnh lao phụ thuộc vào việc chẩn đoán nhanh xác Tuy nhiên việc chẩn đốn cịn gặp nhiều khó khăn Trong nhiều thập kỉ nay, phản ứng tuberculin skin test (TST) đƣợc sử dụng để chẩn đoán nhiễm lao Tuy nhiên, nghiên cứu gần TST có độ đặc hiệu thấp đặc biệt đối tƣợng có chủng ngừa BCG Một phƣơng pháp dựa đáp ứng miễn dịch tế bào thông qua việc xác định interferon gamma đƣợc tiết tế bào T đƣợc kích thích kháng nguyên đặc hiệu vi khuẩn lao đƣợc chứng minh có độ đặc hiệu cao TST Hai kháng nguyên 10 Kdal Culture Filtetrate Proteinn (CFP10) Kdal Early Secretory Antigenic Target (ESAT6) đƣợc mã hóa gen Ihp nằm vùng đặc hiệu RD1 vi khuẩn lao Vùng RD1 có chiều dài 9,5 kb có chứa khung đọc mở (ORFs) [36, 55] Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu giới chứng 10 minh RD1 quan sát đƣợc chủng Mycobacterium tuberculosis, khơng có mặt chủng BCG chủng Mycobacteria môi trƣờng [42,49] Do việc nghiên cứu, ứng dụng gen mã hóa protein ESAT6 CFP10 chẩn đốn lao phát triển vacxin có hiệu bảo vệ cao đƣợc coi hƣớng đƣợc nghiên cứu nhiều nơi giới [29, 59, 65] Xuất phát từ lý trên, tiến hành: “Nghiên cứu quy trình biểu gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 phục vụ cho việc chế tạo sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao” Đề tài thuộc phần nghiên cứu nhiệm vụ Nghị định thƣ Hoa Kỳ:‫ ״‬Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo sinh phẩm ELISPOT chẩn đốn nhiễm lao quy mơ phịng thí nghiệm‫״‬ Mục tiêu đề tài: Thiết kế vector biểu gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp ESAT6/CFP10 Biểu tinh protein ESAT6/CFP10 tế bào vi khuẩn E coli tạo nguyên liệu chế tạo sinh phẩm chẩn đoán nhiễm lao TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sỹ Sinh học Đặng Đức Anh, Hồ Minh Lý, Trần Thị Thanh Hoa, Hoàng Thị Minh Tú, Nguyễn Thị Nguyệt (2006), ″Giải trình tự phân tích gen ESAT6 Mycobacterium tuberculosis phân lập từ bệnh nhân lao màng não″, Tạp chí Y học dự phòng tập XVI, số 6(85), tr 14-18 Nguyễn Đình Bảng (1992), Vi sinh vật y học, Học viện quân y Bộ Y tế.( 2012), Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia 2012 Bơ ̣ Y tế (2010), Chiế n lược phòng chố ng lao quố c gia giai đoạn 2011-2015 Bộ Y tế, Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2005), Báo cáo tổng kết Chương 11 trình chống lao quốc gia 2005 Lê Huy Chính (2001), Vi sinh Y học, NXB Y học, Hà Nội, Tr 207-214 Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hồ (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Chƣơng Trình Chống Lao Quốc Gia (2011), Báo cáo tổng kết Chương trình Chống lao Quốc gia năm 2010 phương hướng hoạt động năm 2011 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục 11 Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng (2004), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục 12 Phan Thị Thu Hƣơng, Đỗ Quỳnh Nga, Vũ Tân Trào (2005), “Phát M tuberculosis môi trƣờng bệnh viện lao sử dụng kỹ thuật PCR”, Hội nghị khoa học tồn quốc cơng nghệ sinh học, Tháng 12/2005 13 Nguyễn Văn Hƣng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi, Luận án Tiến sỹ Y học 14 Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi (2004), Kĩ thuật di truyền ứng dụng, NXB Giáo dục 15 Lê Thị Luyến, Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ, điều trị, dự phịng nghiên cứu Lao Việt Nam, Hội thảo sinh học phân tử bệnh lao, Đại học Quốc gia Hà Nội, Tháng 8/2007 16 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị, NXB Giáo dục 17 Nguyễn Thái Sơn, Hoàng Văn Tổng, Bùi Tiến Sỹ, Lê Quốc Tuấn (2007), “Nghiên cứu tối ƣu hố quy trình PCR đa mồi (multiplex PCR) dùng chẩn đốn nhanh vi khuẩn lao” Tạp chí Y học Việt Nam, 337(1), p.27-31 18 Quyền Đình Thi (2005), Cơng nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật 19 Nguyễn Xuân Triều (2006), “Chẩn đoán lao”, Bài giảng Lao Bệnh phổi sau đại học, Học Viện Quân Y 12 20 Nguyễn Văn Viê ̣t (2011), ″Mycobacterium tuberculosis‫״‬, Vi sinh y học , NXB Quân đô ̣i nhân dân, Hà Nội, Tr 228 - 235 Tài liệu tiếng Anh 21 A.S.Mustafa., F Oftung., H.A Amoudy., N.M Madi., A.T Abal., F Shaban., et al (2000), ″Multiple Epitopes from the Mycobacterium tuberculosis ESAT6 Antigen are recognized by antigen-Specific –Human T Cell Lines″, Clinical Infectious Diseases, Vol 30, S201-S205 22 Ashtekar M.D and Vidis S.S (1993), ″T lymphocytes in pulmonary tuberculosis,″ Indian J.Med.Res, 97, pp 14-17 23 Barrett-Connor E (1979), "The epidemiology of tuberculosis in physicians," JAMA, 241, pp.33-38 24 Behr MA., Wilson MA., Gill WP., Salamon H., Schoolnik GK., Rane S., et al (1999), "Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray," Science 1999, 284(5419), 1520-1523 25 Bluberg H M., Watkins D L., Berschling J.D and Antle A "Moore tuberculosis," Ann Internal Med, 122, pp.658-663 26 Brosch R., G.S.V., Marmiesse M and et al (2002), "A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex," Proc Nalt Acad Sci USA, 99, 3684-3689 27 Capewell S., Leaker AR and Leitch AG (1988), "Pulmonary tuberculosis in health service staff-is it still a problem," Tubercle, 69, pp 113-118 28 Collins D M , D M Stephens (1991), “Identification of an insertion sequence, IS1081, in Mycobacterium bovis”, FEMS Microbiol Lett, 15(67), 11-15 29 Cooper M.A., Dalton D and Orme I.M (1993), "Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice," Jounal of Experimental Medicine 178, pp.2243-2247 30 Ellner J.J and Wallis R.S (1989), "Immunologic aspects of mycobacterial infections," Review of Infectious Diseases II, pp.S455-S459 31 F.X Berthet., P.B Rasmussen., I Rosenkrands., P Andersen And B Gicquel 13 (1988), “A Mycobacterium tubersulosis operon encoding ESAT6 and a novel lowmolecular-mass culture filtrate protein (CFP10),” Microbiology, 1443195e3203 32 G.G Mahairas., P.J.Sabo., M.J Hickey., D.C Singh And C.K Stover (1996), ″Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M.bovis″, J.Bacteriol, 178 1274e1282 33 Gerston K.F and et all (2004), "Viability of Mycobacteria in the formalin- Fixed Lungs," Hunman Pathology, 35, 571-575 34 Gordon SV., Brosch R., Billault A., Garnier T., Eiglmeier K and Cole ST (1999), "Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays," Mol Microbiol 1999, 32(3), 643-655 35 Goyal et al (1996), “Rapid detection of multidrug – resistant tuberculosis”, Eur Respir, 1997, 10, p1120 – 1124 36 Guinn KM., Hickey MJ., Mathur SK., Zakel KL., Grotzke JE., Lewinsohn DM., et al (2004), ″Individual RD1-region genes are required for export of ESAT6/CFP10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis,″ Mol Microbiol, 51, 359-370 37 Gurpreet S Sandhu, Bruce C Kline, Glenn D Roberts, Marcia E Lewis (1998), “IS6110 based molecular detection of Mycobacterium tuberculosis”, United States Patent , 5731150 38 Herrera EA, Perez O, Segovia M (1996), “Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex polymerase reaction”, Journal of Applied Bacteriology, 80, 596-604 39 Hill PC., Jackson-SillahD., Fox A and et al (2005), ″ESAT6/CFP10 fusion protein and peptide for optional diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection by ex vivo enzym-linked immunospot assay in Gambia,″ J Clin Microbiol, 43, 20702074 40 Hsu T., Hingley-Wilson SM., Chen B., Chen M., Dai AZ., Morin PM., et al (2003), "The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of 14 secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue," Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100, 12420-12425 41 Jaber M., A Rattan, A Verma, J Tyag F, R Kumar (1995), “A simple method of DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis”, Tubercle and Lung Disease, 76, 578-581 42 K.N Lewis., R.Liao.,K.M Guinn., M.J.Hickey., S Smith And M.A.Behr D.R.S (2003), ″Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmettee- Guein attenuation,″ J Infec Dis., 187, 117e123 43 Kremer L and B.G (2005), "A waxy tale - by Mycobacterium tuberculosis," In Tuberculosis and the Tubercle bacillus ASM Press, Washington DC, P.287305 44 Kurabachew M., Sandaad R A., Engere, Bjorvatna B., (2003), “Sequence analysis in the 23S rDNA region of Mycobacterium tuberculosis and related species”, Journal of Microbiological Methods, 54, 373 - 380 45 Lazraq R, el Baghdadi J, Guesdon JL, Benslimane A (1999), “Evaluation of IS6110 as amplification target for direct tuberculosis diagnosis”, Pathologie Biologie, 47(8):790-6 46 L Brant., T Oettinger., A.Holm., A.B Anderson And P Andersen.(1996), ″Key epitopes on the ESAT6 antigen recognize in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis,″ J Immunol., 157, 3527e3533 47 Lewis KN., Liao R., Guinn KM., Hickey MJ., Smith S., Behr MA., et al (2003), "Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille CalmetteGuerin attenuation," J Infect Dis 2003, 187, 117-123 48 Lin Sang., Guihua Xiong And Hongxia Zhang (2012),″ Immunogenicity and protective efficacy against tuberculosis with DNA expressing ESAT6 protein,″ African Journal of Microbiology Research, 6, pp.431-435 49 M Harboe., T Oettinger., H.G Wiker., I Rosenkrands and P Andesen (1996), 15 ″Evidence for occurrence of the ESAT6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG,″ Infec Immun., 64,16e22 50 Marri P.R and et al (2006), "Comparative genomics of metabolic pathways in Mycobacterium species: gene duplication, gene decay and lateral gene transfer," FEMS Microbiol Rev, 30, 906-925 51 Murray P.J., Wang L., Onufryk C., Tepper RI.and Young R.A (1997), ″T cellderive IL-10 antagonizes macrophage funtion in mycobacterial infection,″ Journal of Immunology, 158, pp.668s-675s 52 Musser I.M., A Amin and and S Ramaswamy (2000), "Negligible genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis host immune system protein targets: evidence of limited selective pressure," Genetics, 155, 7-16 53 Mustafa A.S., Abal A.T and Chugh T.D (1999), “Detection of Mycobacterium tuberculosis complex and non-tuberculous Mycobacteria by multiplex polymerase chain reactions”, Eastern Mediterranean Health Journal, 5(1), 6170 54 Musser J M (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria : Molecular genetic insights”, Clinical Microbiology Reviews, (4), 496-514 55 N Ganguly I ., Siddipui and P Sharma (2008), ″Role of M tuberculosis RD-1 region encoded secretory proteins in protective response and virulence,″ Tuberculosis (Edinb) 88, 510e517 56 N van der Wel., D Hava., D Houben., D Fluitsma., M van Zon., J Pierson., et al (2007), "M tuberculosis and M leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells," Cell, 129, 1287e1298 57 Palomino J C , Sylvia Cardoso Leóo, Viviana Ritacco (2007) Tuberculosis 2007: From basic science to patient care, WWW.TuberculosisTextbook.com 58 P S Renshaw., P Panagiotidou., A Whelan., S.V.Gordon., R.G Hewinson., R.A Williamson., et al (2002), ″Conclusive evidence that the major T-cell antigens of the Mycobacterium tuberculosis complex ESAT6 and CFP10 16 form a tight, 1:1 complex and characterization of the structural properties of ESAT6, CFP10, and the ESAT6/CFP10 complex Implications for pathogenesis and virulence,″ J Biol Chem., 277,21598e21603 59 Pollock JM and Andersen P ″Predominant recognition of the ESAT6 protein in the first phase of interferon with Mycobacterium bovis in cattle.,″ Infect Immun1997, 65, 2587-2592 60 Schlossberg D (2006), “Tuberculosis and nontuberculous Mycobacteria l infections Fifth edition”, Medical Publishing Division 61 Sechi L A et al (1997), “Detection of Mycobacterium tuberculosis by PCR analysis of urine and other clinical samples from AIDS and non-HIV-infected patients”, Molecular and Cellular Probes, 11, 281-285 62 S.T Cole., R Brosch., J Parkhill., T Garnier., C Churcher., D Harris., et al (1998), "Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence," Nature 393, 537e544 63 Todar and K (2005), "tuberculosis," http://www.textbookkofbacteriology.net, Accessed 12 April 2008, 64 Van Pinxteren LA., Ravn P., Agger EM., Pollock J and Andersen P (2000), ″Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT6 and CFP10,″ Clin Diagn Lab Immunol 2000, 7, 155-160 65 Vordermeier HM., Chambers MA., Cockle PJ., Whelan AO and Simmons J (2002), ″Hewinson RG., Correlation of ESAT-6 specific gamma interferon production with pathlogy in cattle following Mycobacterium bovis BCG vaccination against experimental bovine tuberculosis,″ Infect Immun, 70, 3026-3032 66 Waters WR., Nonnecke BJ., Palmer MV., Robbe- Austermann S., Bannantine JP.,Stabel JR., et al (2004), ″Use of recombinant ESAT6:CFP10 fusion protein for differentiation of infections of cattle by Mycobacterium bovis and by M avium subsp.avium and M avium subsp Paratuberculosis,″ Clin Diagn lab Immunol 2004, 11, 729-735 17 67 WHO (2009), ″World health report Global Tuberculosis control,″ 68 WHO (2012), ″World health report Global Tuberculosis control,″ 69 World Health Organization (2010) Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response, WHO/HTM/TB/2010.3 70 World Health Organization (2011), Global Tuberculosis Control, WHO report 2011 71 Yinlan Bai, Ying Xue, Hui Gao et al (2007), ″Expression and purification of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and MPT64 fusion protein and its immunoprophylactic potential in mouse model″ , Elsevier, 59, p.189-196 72 http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Mycobacterial_cell_wall_diagram.pn 73 http://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis 74 http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn 75 http://www.ncbi.nih.gov/BLAST 76 http://www.benhhoc.com/index.php?do=viewarticle&artid=667 77 http://www.who.int/Fact sheet/ Fact sheet No104/2005 78 http://www.textbookofbacteriology.net/tuberculosis.html 18