Nghiên cứu đặc điểm nhiễm orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò tại khu vực tây bắc và chế tao bộ sinh phẩm phát hiện (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -*** - TRẦN QUANG PHỤC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NHIỄM Orientia tsutsugamushi, ẤU TRÙNG MÒ TẠI KHU VỰC TÂY BẮC VÀ CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số: 62.72.01.16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Hà Nội - 2019 CƠNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Văn Ba PGS TS Lê Thành Đồng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Vào hồi … … , ngày … tháng … năm … Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sốt ấu trùng mò (thường gọi bệnh sốt mò) bệnh truyền nhiễm cấp tính tác nhân Orientia tsutsugamushi gây ra, bệnh có ổ dịch thiên nhiên, truyền sang người bị ấu trùng mò đốt Bệnh gặp chủ yếu vùng nông thôn, rừng núi Triệu chứng bệnh sốt mò nhầm với triệu chứng nhiều loại bệnh khác có phác đồ điều trị khác (như bệnh sốt xuất huyết dengue, bệnh sốt xoắn khuẩn vàng da) Tỷ lệ tử vong cao không chẩn đoán kịp thời dùng kháng sinh đặc hiệu Do vậy, việc phát bệnh sớm có vai trò định điều trị bệnh sốt mò [5], [42], [133] Ở Việt Nam, có phương tiện kỹ thuật chẩn đốn sốt mò, đặc biệt vùng sâu, vùng xa nơi có nguồn lực y tế hạn chế Với phát triển mạnh mẽ lĩnh vực sinh học phân tử, nhiều công cụ đại nhằm xác định chẩn đoán mầm bệnh ứng dụng Trong đó, phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification (RPA) có nhiều ưu điểm bật so với kỹ thuật sinh học phân tử truyền thống, cho phép khuếch đại nhiệt độ thấp (37 - 420C), thời gian phản ứng để xác định mẫu ngắn (5 - 20 phút) Phương pháp RPA cho phép khuếch đại acid nucleic không cần sử dụng hệ thống máy luân nhiệt đắt tiền, cồng kềnh hoạt động không ổn định điều kiện thực địa, thiếu thốn nguồn lực Trong đó, độ nhạy phương pháp RPA đánh giá tương đương tốt phương pháp PCR Các trang thiết bị dễ dàng sử dụng, vận chuyển đến nơi lấy mẫu bệnh phẩm [64], [97], [140] Vùng Tây Bắc nước ta khu vực có điều kiện kinh tế - xã hội khó khăn, vùng có nhiều đồng bào dân tộc thiểu số sinh sống Điều kiện tự nhiên khu vực thuận lợi cho phát triển nhiều ổ bệnh tự nhiên, có bệnh sốt mò Trong năm qua, có số nghiên cứu trung gian truyền bệnh sốt mò tỉnh khu vực Đơng Bắc [8], [12], [13] chưa có nghiên cứu triển khai khu vực Tây Bắc Vì vậy, cần nghiên cứu xác định đặc điểm ổ bệnh tự nhiên tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi cộng đồng nhằm tăng cường hiệu phòng chống bệnh sốt mò cho khu vực Tây Bắc Xuất phát từ vấn đề trên, “Nghiên cứu đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò khu vực Tây Bắc chế tạo sinh phẩm phát hiện” triển khai nhằm mục tiêu: 1) Mô tả số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò đặc điểm phân bố bệnh sốt mò khu vực Tây Bắc năm 2016 - 2017 2) Chế tạo sinh phẩm phát Orientia tsutsugamushi kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase Polymerase Amplification quy mơ phòng thí nghiệm TÍNH MỚI, TÍNH KHOA HỌC VÀ TÍNH THỰC TIỄN Tính Đây lần sử dụng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification để sản xuất sinh phẩm chẩn đốn bệnh sốt mò Việt Nam Đây phương pháp xét nghiệm có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, cho kết nhanh (chỉ sau 20 phút), không cần tách chiết mẫu, không cần máy luân nhiệt hay trang bị phức tạp kèm tiện dụng thích hợp để triển khai thực địa Nghiên cứu đánh giá thực trạng người phơi nhiễm với tác nhân gây bệnh sốt mò O.tsutsugamushi, trung gian truyền bệnh sốt mò tỷ lệ nhiễm O.tsutsugamushi trung gian truyền bệnh tỉnh Tây Bắc Hòa Bình, Sơn La, Điện Biên Lai Châu Tính khoa học Đề tài sử dụng phương pháp nghiên cứu khoa học chuẩn mực như: - Nghiên cứu dịch tễ học mô tả có phân tích với đợt điều tra cắt ngang để nghiên cứu đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, vật chủ trung gian truyền bệnh sốt mò; Nghiên cứu hồi cứu có phân tích đặc điểm phân bố bệnh sốt mò từ hồ sơ bệnh nhân sốt mò lưu bệnh viện tuyến tỉnh - Nghiên cứu labo: Xây dựng quy trình chế tạo sinh phẩm phát O tsutsugamushi phòng thí nghiệm cơng nghệ khuếch đại đẳng nhiệt RPA Nghiên cứu đánh giá, phân tích độ nhạy, độ đặc hiệu, độ ổn định sản phẩm Đây phương pháp nghiên cứu chuẩn mực, đại áp dụng Việt Nam giới nên có độ tin cậy cao Ngồi ra, đề tài sử dụng kỹ thuật đại như: Kỹ thuật chuyển nạp gen thông qua plasmid, kỹ thuật khuyếch đại gen PCR, kỹ thuật đại có độ tin cậy cao Tính thực tiễn Kết nghiên cứu đề tài cung cấp cho ngành y tế cơng cụ chẩn đốn mầm bệnh sốt mò nhanh, xác phù hợp với tuyến y tế sở góp phần làm giảm gánh nặng bệnh tật cho cộng đồng Mặt khác, đề tài cung cấp tài liệu tham khảo dùng nghiên cứu khoa học giảng dạy trường đại học, đồng thời sở cho nghiên cứu CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 121 trang: Đặt vấn đề (2 trang), chương Tổng quan tài liệu (35 trang), chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu (23 trang), chương Kết nghiên cứu (34 trang), chương Bàn luận (24 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang), 33 bảng, 17 hình, 150 tài liệu tham khảo Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm bệnh sốt mò Bệnh sốt ấu trùng mò (bệnh sốt mò) bệnh truyền nhiễm cấp tính thuộc nhóm C Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm Bệnh tác nhân O tsutsugamushi gây nên [2], [4], [141]; trung gian truyền bệnh ấu trùng mò Leptotrombidium Bệnh có đặc điểm lâm sàng sốt kéo dài - tuần, kèm theo có vết loét da, hạch tồn thân ban Nếu khơng điều trị bệnh có biến chứng nặng, tổn thương nhiều quan nội tạng dễ dẫn đến tử vong Nếu khơng chẩn đốn kịp thời để điều trị kháng sinh đặc hiệu, tỷ lệ tử vong từ từ - 10% [141], chí lên tới 70% tùy theo vùng dịch tễ khác [40], [136] 1.1.1 Triệu chứng bệnh sốt mò Ca bệnh lâm sàng: Ủ bệnh, trung bình - 12 ngày (6 đến 21 ngày); Lúc đầu nơi ấu trùng mò đốt có nốt nước kích thước khoảng - 5mm, không đau [3], bệnh nhân thường không ý; sau thời gian ủ bệnh, bệnh phát với triệu chứng sau: Sốt ≥ 38 - 400C, liên tục, kéo dài 15 - 20 ngày, có trường hợp sốt tới 27 ngày khơng điều trị; Có rét run - ngày đầu, kèm theo sốt nhức đầu nặng, đau mỏi [4], [19] Nốt lt đặc trưng (điển hình sốt mò): Ở Việt Nam, nhiều ổ dịch tỷ lệ có vết loét phổ biến, khoảng 80%, số lại chấm nhỏ có vị trí kín đáo khó phát (như ống tai, âm hộ, ) Vết loét gặp nhiều vùng da mềm ẩm phận sinh dục, vùng hậu môn, bẹn, nách, cổ, đến vùng khác đùi, bụng, ngực, lưng Đơi vết lt vị trí bất ngờ vành tai, rốn, mi mắt (dễ nhầm với lẹo mắt) Đặc điểm vết loét thường không đau, khơng ngứa; người bệnh thường có nốt, nốt hình tròn bầu dục đường kính từ đến 20 mm; nốt ban đầu phát triển dần thành dịch đục sẩn đỏ, sau - ngày vỡ thành nốt có vẩy nâu nhạt đen tùy vào vùng da mềm hay cứng độ non hay già nốt loét; sau thời gian, vẩy bong để lộ nốt loét lõm đáy nông, hồng nhạt, không mủ, không tiết dịch, bờ viền hồng đỏ thâm tùy theo bệnh phát triển hay lui; từ hết sốt nốt loét liền dần [4], [19] Hạch ban dát sẩn: Hạch khu vực nốt loét thường sưng đau, không đỏ, di động, xuất với sốt sau - ngày, điểm tìm nốt loét; Hạch toàn thân sưng đau nhẹ hơn, trừ ca nặng Ban dát sẩn mọc cuối tuần thứ đầu tuần thứ hai, mọc khắp người, trừ lòng bàn tay bàn chân, tồn vài đến tuần, thưa so với sốt Dengue cổ điển, khoảng 35 - 70% số bệnh nhân xuất ban, tùy thời điểm bệnh nhân khám; đơi có đốm xuất huyết (dưới 10%) Trong ngày đầu, da niêm mạc xung huyết đa số trường hợp (khoảng 88%), khác với sốt rét thương hàn [5], [71], [115] Ở bệnh nhân nặng hay gặp tiếng tim mờ, huyết áp thấp, mạch chậm, chảy máu cam, xuất huyết tiêu hóa, viêm phế quản, viêm phổi khơng điển hình [37], [146] Ngồi ra, sốt mò ẩn thể khơng điển hình (khơng có nốt lt) Nếu điều trị kháng sinh thích hợp, cắt sốt nhanh Nếu can thiệp muộn khơng hiệu quả, có biến chứng viêm tim, sốc nhiễm khuẩn, viêm phổi, suy hô hấp, viêm não - màng não dẫn đến tử vong [39], [102] Tỷ lệ tử vong O tsutsugamushi khác nước, phụ thuộc vào chủng lưu hành địa phương Ở Việt Nam, tỷ lệ tử vong khoảng 1%; Indonesia Đài Loan 5-20%, Malaysia 15 - 20%, Nhật Bản 20 - 60% [5], [134] 1.1.2 Chẩn đốn bệnh sốt mò Chẩn đốn bệnh sốt mò dựa vào tiêu chuẩn lâm sàng xét nghiệm Tiêu chuẩn xác định bệnh [5]: - Chỉ cần tiêu chuẩn lâm sàng + Sốt, vết loét đặc trưng, hạch sưng đau, ban dát sẩn, bạch cầu 4.000 12.000, Lympho bình thường tăng, máu lắng tăng + Chỉ tiêu bắt buộc: Phải có vết lt đặc trưng - Nếu khơng có vết loét đặc trưng, bắt buộc phải có test sau dương tính: Test xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (IgM ELISA); xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (test IFA); xét nghiệm kháng thể miễn dịch peroxidase gián tiếp (test IIP) - Phản ứng Weil-Felix với kháng nguyên OX-K vi khuẩn Proteus mirabilis, độ nhạy độ đặc hiệu không cao rẻ tiền, phù hợp với tuyến huyện - Test điều trị thử: Để giải sớm bệnh nhân nên dùng thử tetracycline hay chlorocid, có giá trị chẩn đoán nghi ngờ [5], [119], [137] Chẩn đoán phân biệt: Bệnh xoắn khuẩn; Thương hàn; Sốt Dengue; Sốt rét Điều trị bệnh sốt mò Kháng sinh đặc hiệu điều trị bệnh sốt mò chloramphenicol, doxycycline tetracycline Tuy nhiên, kháng sinh khơng có tác dụng diệt vi khuẩn mà có tác dụng hãm khuẩn nên vi khuẩn O tsutsugamushi sống tồn hạch bạch huyết, hệ võng nội mô nhiều ngày, nhiều tháng dễ tái phát bệnh [5], [26], [30] 1.1.3 Phòng bệnh sốt mò Thực biện pháp tuyền truyền giáo dục sức khỏe kết hợp vệ sinh phòng bệnh Điều tra phát ổ dịch địa bàn nghi ngờ có người để xử lý (bắt thú nhỏ gặm nhấm, bắt mò, phân loại, phân lập R.orientalis, tìm kháng thể, phát bệnh nhân) Tại ổ dịch xác định nghi ngờ: Biện pháp ngăn ngừa mò đốt: Diệt mò mơi trường: phun tồn lưu vào đất ẩm, bờ bụi cỏ cao 20 cm quanh nhà nơi dâm mát thuốc diazinon, fenthion, malathion, lindane, dieldrin, chlordan Diệt chuột theo mùa, ý rắc thuốc diệt mò trước Phát quang thảm thực vật quanh nhà chọn lọc đám thực vật có nhiều ấu trùng mò (đảo mò) Điều trị dự phòng: Biện pháp hạn chế nhiễm bệnh ổ dịch khơng dễ dàng; sử dụng có đơn vị đội phải vượt qua ổ dịch làm nhiệm vụ, dùng Doxycycline 200 mg/tuần [4], [5], [19] 1.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đốn bệnh sốt mò Các xét nghiệm huyết học để phát kháng thể Orientia tsutsugamushi khơng phù hợp để chẩn đốn bệnh giai đoạn cấp nồng độ kháng thể ngưỡng phát giai đoạn bệnh khởi phát Do đó, việc phát kháng nguyên/mầm bệnh trước nồng độ kháng thể đặc hiệu tăng lên quan trọng Hầu hết xét nghiệm phát kháng nguyên/mầm bệnh dựa vào phương pháp PCR, realtime PCR định lượng hay nested PCR nhắm vào gen đích khác nhau, bao gồm 56 kDa, 47 kDa, groEL Orientia tsutsugamushi [47], [74], [94] Tuy nhiên, tất xét nghiệm đòi hỏi phải đào tạo để vận hành máy luân nhiệt PCR, điều kiện với nguồn lực hạn chế việc trang bị, bảo dưỡng, chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo hoạt động ổn định khó khăn Cơng nghệ khuếch đại acid nucleic: Xét nghiệm phân tích acid nucleic hứa hẹn mang lại cơng cụ chẩn đốn nhanh, nhạy đặc hiệu bệnh ký sinh trùng Các thiết bị chẩn đoán hệ cho phép phát mầm bệnh ký sinh trùng thực địa, cho phép nhà lâm sàng nhanh chóng đưa chẩn đốn tin cậy để có biện pháp điều trị hiệu Bản chất sinh hoá phức tạp mẫu bệnh phẩm lâm sàng, nồng độ thấp acid nucleic hầu hết mẫu bệnh phẩm cơng nghệ cảm biến sinh học đòi hỏi phải dùng đến số công nghệ khuếch đại acid nucleic để cải thiện độ nhạy, đáp ứng yêu cầu lâm sàng phân tích mẫu nhỏ, áp dụng phân tích mẫu thực địa [97], [141] Hầu hết công nghệ phân tích acid nucleic có giá thành cao cần người làm xét nghiệm đào tạo, phù hợp với phòng thí nghiệm trung tâm đầu tư nhiều với nguồn lực dồi thành phố đô thị lớn Điều khiến lợi ích xét nghiệm phân tích acid nucleic không đến với cư dân sinh sống vùng có nguồn lực hạn chế khu vực địa lý biệt lập Bởi vậy, cơng nghệ chẩn đốn phân tử với giá thành hợp lý, không phức tạp cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cá nhân cộng đồng Những tiến khoa học kỹ thuật gần cho thấy trang thiết bị phân tích acid nucleic thu nhỏ, dễ dàng vận chuyển xuống thực địa Để khắc phục giới hạn phương pháp PCR truyền thống kỷ nguyên khuếch đại acid nucleic dùng chẩn đoán phân tử thực địa, nghiên cứu gần có xu hướng chuyển sang phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Các phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt sử dụng enzyme để thực bước tách sợi, khác với phương pháp PCR truyền thống buộc phải sử dụng nhiệt độ cao Những kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt cơng cụ hữu ích để phát triển mơ hình chẩn đốn thực địa có khả khuếch đại acid nucleic mà không cần bước luân nhiệt chế điều khiển liên quan [109], [111] Công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification Recombinase polymerase amplification (RPA) công nghệ sử dụng hỗn hợp recombinase sinh vật tiền nhân để giúp primer gắn đặc hiệu vào gen đích Enzyme ADN polymerase thay sợi (tiểu phần lớn Bacillus subtilis PolI, Bsu) xúc tác phản ứng kéo dài primer để tổng hợp sợi ADN bổ sung [49] Điểm quan trọng RPA việc sử dụng enzyme recombinase phân tử SSB để thay cho bước biến tính PCR truyền thống Kỹ thuật RPA phát huy tối đa ưu tính đơn giản, tiết kiệm chi phí thời gian phản ứng ngắn Để xác định trình tự mục tiêu, RPA yêu cầu mồi oligonucleotide thiết kế đơn giản (có thể cần thêm probe) để phản ứng bắt cặp xảy Phương pháp có độ đặc hiệu trình tự cao hỗn hợp acid nucleic mà không cần tách chiết mẫu Cơng nghệ cho phép khuếch đại gen đích cách tổng hợp liên tục ADN mà không cần biến tính sợi kép ADN nhiệt độ cao Xét nghiệm tiến hành khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C với hiệu suất cao nhờ phát tín hiệu từ đơn phân tử đích sau - 20 phút, ngắn so với PCR truyền thống (20 - 180 phút), Reltime PCR (3 - giờ) LAMP (45 - 60 phút) Công nghệ RPA phát triển để phát HIV, Rift Valley Fever virus, virus Ebola, Sudan Marburg, MERS-CoV, virus gây bệnh chân tay miệng Coronavirus bò Kỹ thuật phát triển để phát Chlamydia trachomatis mẫu nước tiểu, chẩn đoán Cryptosporidiosis động vật mẫu bệnh phẩm người phát Neisseria gonorrhoeae, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Francisella tularensis, Streptococci nhóm B [81], [93], [105] Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật RPA cao Các nghiên cứu cho thấy, cơng nghệ RPA phát mẫu ADN đích (hoặc