Nghiên cứu đặc điểm nhiễm orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò tại khu vực tây bắc và chế tao bộ sinh phẩm phát hiện

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN QUANG PHỤC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NHIỄM Orientia tsutsugamushi, ẤU TRÙNG MÒ TẠI KHU VỰC TÂY BẮC VÀ CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN QUANG PHỤC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NHIỄM Orientia tsutsugamushi, ẤU TRÙNG MÒ TẠI KHU VỰC TÂY BẮC VÀ CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số: 62 72 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 PGS TS Nguyễn Văn Ba 2 PGS TS Lê Thành Đồng Hà Nội - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án này là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa từng được công bố ở bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Nếu có gì sai sót tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Nghiên cứu sinh Trần Quang Phục ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án này tôi đã được các Thầy, Cô, các nhà khoa học, bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Ba, PGS TS Lê Thành Đồng những người Thầy tâm huyết đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc PGS TS Trần Thanh Dương, Viện trưởng và các đồng chí Phó viện trưởng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương đã luôn động viên, tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Chủ nhiệm đề tài, các thành viên nhóm nghiên cứu của đề tài Nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tiên tiến trong chẩn đoán, dự phòng một số bệnh truyền nhiễm ở địa bàn trọng điểm” Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc GS TSKH Thiếu tướng Lê Bách Quang, PGS TS Nguyễn Mạnh Hùng đã tận tình ủng hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án Xin cảm ơn các đồng nghiệp Phòng Khoa học - Đào tạo, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ tôi trong quá trình học tập Xin cảm ơn bạn bè và những người thân trong gia đình đã luôn ở bên tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BamHI Bacillus amyloliquefaciens BLAST Basic local alignment search tool dNTP Deoxy nucleoside triphosphate EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid FAM Fluorescein amidite FN False negative - Âm tính giả FP False positive - Dương tính giả IFA Indirect fluorescent antibody IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M IIP Indirect immunoperoxidase kDa Kilo dalton LAMP Loop mediated isothermal amplification LF Lateral flow - Thẩm thấu ngang MgOAc Magnesium acetate NASBA Nucleic acid sequence-based amplification NAT Nucleic acid test PCR Polymer chain reaction RDT Rapid diagnostic test - Tét chẩn đoán nhanh RPA Recombinase polymerase amplification SDS Sodium dedocyl sunfate TP True positive - Dương tính thật TN True negative - Âm tính thật iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Đặc điểm bệnh sốt mò 3 1.1.1 Triệu chứng bệnh sốt mò 3 1.1.2 Chẩn đoán bệnh sốt mò 5 1.1.3 Điều trị bệnh sốt mò 6 1.1.4 Phòng bệnh sốt mò 7 1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sốt mò 8 1.2.1 Phân bố bệnh sốt mò 8 1.2.2 Nguồn bệnh và cơ chế lây truyền bệnh sốt mò 12 1.3 Tác nhân gây bệnh và các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán bệnh sốt mò 19 1.3.1 Tác nhân gây bệnh 19 1.3.2 Các nghiên cứu xét nghiệm chẩn đoán huyết thanh học 26 1.3.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh sốt mò .28 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò tại khu vực Tây Bắc 38 v 2.1.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 38 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.1.3 Nội dung nghiên cứu 42 2.1.4 Các biến số nghiên cứu 43 2.1.5 Các chỉ số nghiên cứu 44 2.1.6 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 45 2.2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm (kit) phát hiện Orientia tsutsugamushi quy mô phòng thí nghiệm .49 2.2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 49 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 49 2.2.3 Nội dung nghiên cứu 51 2.2.4 Các kỹ thuật đã áp dụng chế tạo bộ kit 52 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 58 2.4 Sai số và khống chế sai số 59 2.5 Đạo đức nghiên cứu 59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61 3.1 Một số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò tại khu vực Tây Bắc 61 3.1.1 Kết quả điều tra huyết thanh phát hiện kháng thể Orientia tsutsugamushi lưu hành trong cộng đồng dân cư 61 3.1.2 Một số đặc điểm phân bố bệnh sốt mò điều trị tại bệnh viện 64 3.1.3 Kết quả điều tra vật chủ và vector truyền bệnh sốt mò 67 3.2 Kết quả nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện Orientia tsutsugamushi quy mô phòng thí nghiệm 72 3.2.1 Thiết kế phản ứng khuếch đại acid nucleic bằng các công nghệ khác nhau để phát hiện Orientia tsutsugamushi 72 3.2.2 Tối ưu hóa phản ứng khuếch đại acid nucleic bằng các công nghệ khác nhau sử dụng ADN khuôn tổng hợp từ plasmid 75 vi 3.2.3 Xây dựng quy trình chế tạo kit chẩn đoán O tsutsugamushi 83 Chương 4: BÀN LUẬN 95 4.1 Một số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò tại khu vực Tây Bắc 95 4.1.1 Điều tra huyết thanh phát hiện kháng thể Orientia tsutsugamushi lưu hành trong cộng đồng dân cư 95 4.1.2 Một số đặc điểm phân bố của bệnh sốt mò 97 4.1.3 Đặc điểm vật chủ và vector truyền bệnh sốt mò 101 4.2 Chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện Orientia tsutsugamushi bằng công nghệ đẳng nhiệt RPA quy mô phòng thí nghiệm 104 4.2.1 Điều kiện phản ứng của bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi quy mô phòng thí nghiệm 105 4.2.2 Các thông số kỹ thuật chính của bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi quy mô phòng thí nghiệm .111 4.2.3 Đánh giá về ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu của phản ứng RPA so với công nghệ realtime PCR phát hiện Orientia tsutsugamushi 115 4.2.4 Khả năng ứng dụng của bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát hiện Orientia tsutsugamushi 117 KẾT LUẬN 119 KIẾN NGHỊ 121 HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU TÍNH MỚI VÀ TÍNH THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 - 2016 9 Bảng 1.2 Các tác nhân rickettsia gây bệnh chủ yếu 20 Bảng 2.1 Danh sách, định nghĩa biến số nghiên cứu 43 Bảng 3.1 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo tỉnh 61 Bảng 3.2 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo giới 62 Bảng 3.3 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo tuổi 62 Bảng 3.4 Tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo dân tộc 63 Bảng 3.5 Tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo nghề nghiệp 63 Bảng 3.6 Tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo đặc điểm sinh cảnh khu vực sinh sống 64 Bảng 3.7 Phân bố của bệnh nhân sốt mò theo tỉnh 65 Bảng 3.8 Phân bố của bệnh nhân sốt mò theo tuổi 66 Bảng 3.9 Số lượng và loài chuột điều tra tại các điểm nghiên cứu 67 Bảng 3.10 Mật độ chuột tại các điểm nghiên cứu 68 Bảng 3.11 Tỷ lệ chuột nhiễm ấu trùng mò 69 Bảng 3.12 Định loại mò trên chuột tại các điểm nghiên cứu 70 Bảng 3.13 Thành phần loài mò tại từng điểm nghiên cứu 70 Bảng 3.14 Kết quả xét nghiệm huyết thanh phát hiện kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi trên chuột 71 Bảng 3.15 Trình tự primer và probe khuếch đại acid nucleic sử dụng các công nghệ khác nhau 74 Bảng 3.16 Trình tự primer/probe cho phản ứng khuếch đại chứng nội 74 Bảng 3.17 Bảng điều kiện tối ưu của phản ứng Realtime PCR .75 Bảng 3.18 Bảng điều kiện tối ưu của phản ứng RPA 75 viii Bảng 3.19 Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng realtime PCR 76 Bảng 3.20 Tổng hợp kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA 77 Bảng 3.21 So sánh các thông số về chu kỳ ngưỡng tương ứng .83 Bảng 3.22 So sánh độ đặc hiệu của từng công nghệ 84 Bảng 3.23 Thành phần của bộ kit 86 Bảng 3.24 Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ kit dựa trên kết quả phát hiện Orientia tsutsugamushi trong mẫu bệnh phẩm 88 Bảng 3.25 Kết quả đánh giá độ ổn định bộ kit dựa trên thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại 89 Bảng 3.26 So sánh độ nhạy kit đẳng nhiệt RPA phát hiện 90 Bảng 3.27 So sánh độ đặc hiệu kit đẳng nhiệt RPA phát hiện 90 Bảng 3.28 Kết quả đánh giá độ tương hợp của 2 loại kit 91 Bảng 3.29 Thành phần hỗn hợp phản ứng 93 Bảng 3.30 Chu trình nhiệt 94 Nồng độ 0,24µM Nồng độ 0,48µM Nồng độ 0,42µM Nồng độ 0,52µM Hình 1 Kết quả chạy phản ứng RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi với các nồng độ mồi khác nhau Nồng độ 0,06µM Nồng độ 0,08µM Nồng độ 0,1µM Nồng độ 0,12µM Nồng độ 0,15µM Hình 2 Kết quả chạy phản ứng RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi với các nồng độ probe khác nhau a) Nồng độ MgOAc 12mM b) Nồng độ MgOAc 14mM c) Nồng độ MgOAc 18mM d) Nồng độ MgOAc 20 mM Hình 3 Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA Orientia tsutsugamushi Sau 7 ngày bảo quản Sau 14 ngày bảo quản Sau 30 ngày bảo quản Sau 60 ngày bảo quản Sau 90 ngày bảo quản Hình 4 Kết quả kiểm tra đánh giá độ ổn định của bộ kit phát hiện Orientia tsutsugamushi sau 7, 14, 30, 60 và 90 ngày bảo quản PHỤ LỤC 2: TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT 1 MỤC ĐÍCH CỦA BỘ KIT Phát hiện và chẩn đoán Orientia tsutsugamusi bằng công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) nhằm phục vụ công tác chẩn đoán, dự phòng bệnh sốt mò ở các địa bàn trọng điểm 2 NỘI DUNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ 2.1 Nguyên lý bộ kit Orientia tsutsugamusi được phát hiện bằng bộ kit nhờ công nghệ khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification RPA là công nghệ sử dụng hỗn hợp các recombinase của sinh vật tiền nhân để giúp các primer gắn đặc hiệu vào gen đích Enzyme ADN polymerase thay thế sợi (tiểu phần lớn của Bacillus subtilis PolI, Bsu) xúc tác phản ứng kéo dài primer để tổng hợp sợi ADN mới bổ sung Bộ kít phát hiện O tsutsugamushi sử dụng công nghệ RPA với một cặp mồi (primer) được thiết kế đặc hiệu nhằm khuếch đại vùng trình tự trên gen 47 kDa Để có độ đặc hiệu cao nhất, mẫu dò được đánh dấu huỳnh quang (probe) đặc hiệu với vùng trình tự khuếch đại chứa 1 vị trí THF giúp enzyme Exo nuclease III nhận biết và cắt đặc hiệu khi lai với sản phẩm khuếch đại Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản sẽ tương ứng với một tín hiệu huỳnh quang, được đầu dò của máy ghi nhận Công nghệ này cho phép khuếch đại gen đích bằng cách tổng hợp liên tục ADN mà không cần biến tính sợi kép ADN ở nhiệt độ cao Xét nghiệm có thể được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C với hiệu suất rất cao nhờ đó có thể phát hiện được tín hiệu từ đơn phân tử đích chỉ sau 20 phút 2.2 Đích phát hiện Trình tự gen đích dùng để thiết kế bộ primer và probe cho phát hiện O tsutsugamushi sử dụng trong bộ kit là gen 47 kDa 2.3 Thành phần bộ kit Bảng 1: Thành phần bộ kit TT Thành phần Ký hiệu 1 Reaction Buffer A1,A2 2 dNTPs B1,B2 3 Nuclease-freewater D1,D2 4 Probe E-mix 5 Orientia tsutsugamushi C1, C2 I1,I2 oligo-mix 6 Core Reaction Mix F1,F2 7 Exo E1,E2 8 MgOAc 9 Positive Control H1, H2 G1,G2 2.4 Vật liệu, hóa chất và thiết bị cung cấp bởi người sử dụng 2.4.1 Hóa chất - Cồn (Ethanol) 90% và 70% - Kít chiết tách ADN: E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit (Omega Biotek); E.Z.N.A.® SQ Blood DNA Kit (Omega Bio-tek); QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ); QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN ) hoặc kít tương đương 2.4.2 Thiết bị, dụng cụ - Máy trộn mẫu (Vortex) - Máy ly tâm nhỏ (Centrifuge Spin) - Máy lắc và ủ nhiệt - Máy ly tâm lạnh cho ống eppendorf 1,5 ml - Micropipettes và đầu típ có lọc tương ứng lấy được các thể tích: 0,5 – 10 µl; 10 -100 µl và 100 - 1000µl - Ống PCR 200 µl - Ống eppendorf thể tích 0,5 ml và 1 ,5 ml - Ống ly tâm nhựa thể tích 5 ml, 10 ml và 50 ml 2.5 Cách tiến hành 2.5.1 Sơ đồ thực hiện Mẫu bệnh phẩm Tách chiết DNA RPA khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Đọc kết quả Hình 1: Sơ đồ thực hiện xét nghiệm 2.5.2 Chuẩn bị mẫu Tất cả các loại mẫu phù hợp cho phản ứng khuếch đại RPA đều có thể được sử dụng Hãy đảm bảo các mẫu ADN có độ tinh sạch, nồng độ và tính toàn vẹn cao Luôn luôn chạy ít nhất một mẫu đối chứng dương đi kèm với các mẫu Để chuẩn bị mẫu đối chứng âm, thay thế mẫu ADN bằng nước không có RNase / Dnase 2.5.3 Tách chiết ADN Mẫu bệnh phẩm có thể được tách chiết ADN bằng cách sử dụng các bộ kit sau: E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit (Omega Bio-tek); E.Z.N.A.® MicroElute Viral RNA/DNA (Omega Bio-tek); E.Z.N.A.® SQ Blood DNA Kit (Omega Bio-tek); QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ); QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN ) hoặc kít tương đương Quy trình tách chiết ADN được thực hiện theo hướng dẫn của của nhà sản xuất bộ kit tách chiết E.Z.N.A.® MicroElute Viral RNA/DNA (Omega Bio-tek) Mẫu ADN sau tách chiết nên được bảo quản trong tủ -80°C cho đến khi tiến hành thử nghiệm 2.5.4 Thực hiện phản ứng RPA khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt - Rã đông hoàn toàn các thành phần phản ứng và mẫu ADN đã tách chiết (nếu đông) và giữ chúng ở trên đá - Trộn đều và ly tâm các thành phần phản ứng để được các hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ chúng ở trên đá để có hiệu quả xét nghiệm cao nhất - Chuẩn bị Master Mix theo Bảng 2: Bảng 2: Chuẩn bị Master Mix STT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cho 1 phản ứng (µl) 1 Reaction Buffer 2X 10 2 dNTPs 25 mM 1.44 3 Nuclease-freewater 4 Probe E-mix 5 Oligo-mix 6 Core Reaction Mix 20 X 1 7 Exo 50 X 0.4 0.52 10 X 1.64 Tổng thể tích dung dịch đểm thực hiện phản ứng 8 MgOAc 9 Mẫu ADN 2 280 mM Tổng thể tích dung dịch thực hiện phản ứng 17 1 2 20 - Đối với các thành phần Core Reaction Mix và Exo: bổ sung lần lượt từng thành phần lên nắp tube sau đó đảo trộn lên xuống 10 lần và ly tâm - Đảo trộn bằng pipet các thành phần của dung dich đệm trước khi chia 17 µl ra từng ống phản ứng 0,2 ml - Bổ sung MgOAc và mẫu ADN với thể tích tương ứng lên nắp tube phản ứng - Ly tâm để MgOAc và mẫu ADN rơi xuống đáy ống phản ứng ngay khi bắt đầu ủ Lưu ý: MgOAc giúp kích hoạt phản ứng diễn ra Phản ứng RPA sẽ xảy ra khi MgOAc được thêm vào ngay cả ở nhiệt độ phòng Do đó, hạn chế cho MgOAc tiếp xúc với master mix khi chưa tiến hành ủ - Cài đặt điều kiện phản ứng theo Bảng 3: Bảng 3: Chu trình nhiệt Nhiệt độ Thời gian Ghi chú 37°C 20 phút Khuếch đại (20s thu nhận tín hiệu 1 lần) 4°C ∞ Lưu mẫu trên máy - Chuyển các ống phản ứng vào máy đẳng nhiệt và bắt đầu phản ứng theo điều kiện phản ứng đã cài đặt 2.5.5 Đọc kết quả - Kết quả phát hiện O tsutsugamushi sử dụng bộ kit phát hiện O tsutsugamushi được xác định dựa vào tín hiệu khuếch đại nhờ tín hiệu huỳnh quang thu được từ hệ thống thu nhận tín hiệu huỳnh quang - Kiểm tra các mẫu phải là kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả + Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại trùng khớp với thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại của mẫu đã được chuẩn độ trước đó (mẫu chứng dương cung cấp kèm bộ kít có thời gian thu nhận được tín hiệu khuếch đại là 8 10 phút) + Mẫu chứng âm phải cho kết quả âm tính - Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương và đối chứng âm không đúng thì phải thực hiện lại xét nghiệm 2.6 Đóng gói, ghi nhãn 2.6.1 Mô tả sản phẩm - Tên sản phẩm: Orientia tsutsugamushi RPA minikit - Mục đích sử dụng: Phát hiện Orientia tsutsugamushi trong mẫu bệnh phẩm bằng công nghệ khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt RPA 2.6.2 Đóng gói Bộ sinh phẩm Orientia tsutsugamushi RPA mini kit được đóng gói trong hộp carton (50 test/hộp) Trên hộp có nhãn ghi Tên sản phẩm, Số lô, Hạn sử dụng, Điều kiện bảo quản; Tên, địa chỉ, số điện thoại nơi sản xuất và Bảng thành phần bộ kit Trong hộp có tờ hướng dẫn sử dụng bộ kit Thành phần bộ kit gồm: TT Thành phần Số lượng Ký hiệu 1 Reaction Buffer 2 x 300 µl A1, A2 2 dNTPs 2 x 50 µl B1,B2 3 Probe E-mix 2 x 60 µl 4 Nuclease-freewwater 2 x 100 µl D1,D2 5 Orientia tsutsugamushi 2 x 50 µl I1, I2 C1, C2 oligo-mix 6 Exo 2 x 11 µl E1, E2 7 Core Reaction Mix 2 x 30 µl F1, F2 8 Positive Control 2 x 50 µl G1,G2 9 MgOAc 2 x 50 µl H1, H2 PHỤ LỤC 3: BẢN ĐỐ CÁC TỈNH NGHIÊN CỨU Bản đồ hành chính tỉnh Điện Biên Bản đồ hành chính tỉnh Lai Châu Bản đồ hành chính tỉnh Hòa Bình Bản đồ hành chính tỉnh Sơn La ... trùng mò khu vực Tây Bắc chế tạo sinh phẩm phát hiện? ?? triển khai nhằm mục tiêu: 1) Mô tả số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò đặc điểm phân bố bệnh sốt mò khu vực Tây Bắc năm 2016...BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN QUANG PHỤC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NHIỄM Orientia tsutsugamushi, ẤU TRÙNG MÒ TẠI KHU VỰC TÂY BẮC VÀ CHẾ... pháp nghiên cứu số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò khu vực Tây Bắc 2.1.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu mầm