Nghiên cứu đặc điểm nhiễm orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò tại khu vực tây bắc và chế tao bộ sinh phẩm phát hiện

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN QUANG PHỤC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NHIỄM Orientia tsutsugamushi, ẤU TRÙNG MÒ TẠI KHU VỰC TÂY BẮC VÀ CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN QUANG PHỤC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NHIỄM Orientia tsutsugamushi, ẤU TRÙNG MÒ TẠI KHU VỰC TÂY BẮC VÀ CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT HIỆN Chuyên ngành: Ký sinh trùng y học Mã số: 62 72 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Văn Ba PGS TS Lê Thành Đồng Hà Nội - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trình bày luận án hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu có sai sót tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Nghiên cứu sinh Trần Quang Phục ii LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Thầy, Cô, nhà khoa học, bạn bè đồng nghiệp gia đình nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Ba, PGS TS Lê Thành Đồng người Thầy tâm huyết tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, dành nhiều thời gian giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc PGS TS Trần Thanh Dương, Viện trưởng đồng chí Phó viện trưởng Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương động viên, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn Chủ nhiệm đề tài, thành viên nhóm nghiên cứu đề tài Nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tiên tiến chẩn đoán, dự phòng số bệnh truyền nhiễm địa bàn trọng điểm” Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc GS TSKH Thiếu tướng Lê Bách Quang, PGS TS Nguyễn Mạnh Hùng tận tình ủng hộ, giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận án Xin cảm ơn đồng nghiệp Phòng Khoa học - Đào tạo, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ tơi q trình học tập Xin cảm ơn bạn bè người thân gia đình ln bên tơi, động viên giúp đỡ tơi q trình học tập hoàn thành luận án iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic BamHI Bacillus amyloliquefaciens BLAST Basic local alignment search tool dNTP Deoxy nucleoside triphosphate EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid FAM Fluorescein amidite FN False negative - Âm tính giả FP False positive - Dương tính giả IFA Indirect fluorescent antibody IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M IIP Indirect immunoperoxidase kDa Kilo dalton LAMP Loop mediated isothermal amplification LF Lateral flow - Thẩm thấu ngang MgOAc Magnesium acetate NASBA Nucleic acid sequence-based amplification NAT Nucleic acid test PCR Polymer chain reaction RDT Rapid diagnostic test - Tét chẩn đoán nhanh RPA Recombinase polymerase amplification SDS Sodium dedocyl sunfate TP True positive - Dương tính thật TN True negative - Âm tính thật iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm bệnh sốt mò 1.1.1 Triệu chứng bệnh sốt mò 1.1.2 Chẩn đốn bệnh sốt mò 1.1.3 Điều trị bệnh sốt mò 1.1.4 Phòng bệnh sốt mò 1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sốt mò 1.2.1 Phân bố bệnh sốt mò 1.2.2 Nguồn bệnh chế lây truyền bệnh sốt mò 12 1.3 Tác nhân gây bệnh phương pháp xét nghiệm chẩn đốn bệnh sốt mò 19 1.3.1 Tác nhân gây bệnh 19 1.3.2 Các nghiên cứu xét nghiệm chẩn đoán huyết học 26 1.3.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh sốt mò .28 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò khu vực Tây Bắc 38 v 2.1.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 38 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 39 2.1.3 Nội dung nghiên cứu 42 2.1.4 Các biến số nghiên cứu 43 2.1.5 Các số nghiên cứu 44 2.1.6 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 45 2.2 Đối tượng phương pháp nghiên cứu chế tạo sinh phẩm (kit) phát Orientia tsutsugamushi quy mơ phòng thí nghiệm .49 2.2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 49 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 49 2.2.3 Nội dung nghiên cứu 51 2.2.4 Các kỹ thuật áp dụng chế tạo kit 52 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 58 2.4 Sai số khống chế sai số 59 2.5 Đạo đức nghiên cứu 59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61 3.1 Một số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò khu vực Tây Bắc 61 3.1.1 Kết điều tra huyết phát kháng thể Orientia tsutsugamushi lưu hành cộng đồng dân cư 61 3.1.2 Một số đặc điểm phân bố bệnh sốt mò điều trị bệnh viện 64 3.1.3 Kết điều tra vật chủ vector truyền bệnh sốt mò 67 3.2 Kết nghiên cứu chế tạo sinh phẩm phát Orientia tsutsugamushi quy mơ phòng thí nghiệm 72 3.2.1 Thiết kế phản ứng khuếch đại acid nucleic công nghệ khác để phát Orientia tsutsugamushi 72 3.2.2 Tối ưu hóa phản ứng khuếch đại acid nucleic công nghệ khác sử dụng ADN khuôn tổng hợp từ plasmid 75 vi 3.2.3 Xây dựng quy trình chế tạo kit chẩn đốn O tsutsugamushi 83 Chương 4: BÀN LUẬN 95 4.1 Một số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò khu vực Tây Bắc 95 4.1.1 Điều tra huyết phát kháng thể Orientia tsutsugamushi lưu hành cộng đồng dân cư 95 4.1.2 Một số đặc điểm phân bố bệnh sốt mò 97 4.1.3 Đặc điểm vật chủ vector truyền bệnh sốt mò 101 4.2 Chế tạo sinh phẩm phát Orientia tsutsugamushi công nghệ đẳng nhiệt RPA quy mơ phòng thí nghiệm 104 4.2.1 Điều kiện phản ứng kit khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát Orientia tsutsugamushi quy mơ phòng thí nghiệm 105 4.2.2 Các thơng số kỹ thuật kit khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát Orientia tsutsugamushi quy mơ phòng thí nghiệm .111 4.2.3 Đánh giá ngưỡng phát độ đặc hiệu phản ứng RPA so với công nghệ realtime PCR phát Orientia tsutsugamushi 115 4.2.4 Khả ứng dụng kit khuếch đại đẳng nhiệt RPA phát Orientia tsutsugamushi 117 KẾT LUẬN 119 KIẾN NGHỊ 121 HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU TÍNH MỚI VÀ TÍNH THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Dịch sốt mò số quốc gia từ năm 2007 - 2016 Bảng 1.2 Các tác nhân rickettsia gây bệnh chủ yếu 20 Bảng 2.1 Danh sách, định nghĩa biến số nghiên cứu 43 Bảng 3.1 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo tỉnh 61 Bảng 3.2 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo giới 62 Bảng 3.3 Tỷ lệ người có kháng thể kháng O tsutsugamushi theo tuổi 62 Bảng 3.4 Tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo dân tộc 63 Bảng 3.5 Tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo nghề nghiệp 63 Bảng 3.6 Tỷ lệ người có kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi theo đặc điểm sinh cảnh khu vực sinh sống 64 Bảng 3.7 Phân bố bệnh nhân sốt mò theo tỉnh 65 Bảng 3.8 Phân bố bệnh nhân sốt mò theo tuổi 66 Bảng 3.9 Số lượng loài chuột điều tra điểm nghiên cứu 67 Bảng 3.10 Mật độ chuột điểm nghiên cứu 68 Bảng 3.11 Tỷ lệ chuột nhiễm ấu trùng mò 69 Bảng 3.12 Định loại mò chuột điểm nghiên cứu 70 Bảng 3.13 Thành phần lồi mò điểm nghiên cứu 70 Bảng 3.14 Kết xét nghiệm huyết phát kháng thể kháng Orientia tsutsugamushi chuột 71 Bảng 3.15 Trình tự primer probe khuếch đại acid nucleic sử dụng công nghệ khác 74 Bảng 3.16 Trình tự primer/probe cho phản ứng khuếch đại chứng nội 74 Bảng 3.17 Bảng điều kiện tối ưu phản ứng Realtime PCR .75 Bảng 3.18 Bảng điều kiện tối ưu phản ứng RPA 75 viii Bảng 3.19 Bảng kết tối ưu thành phần phản ứng realtime PCR 76 Bảng 3.20 Tổng hợp kết tối ưu thành phần phản ứng RPA 77 Bảng 3.21 So sánh thông số chu kỳ ngưỡng tương ứng .83 Bảng 3.22 So sánh độ đặc hiệu công nghệ 84 Bảng 3.23 Thành phần kit 86 Bảng 3.24 Kết đánh giá độ ổn định kit dựa kết phát Orientia tsutsugamushi mẫu bệnh phẩm 88 Bảng 3.25 Kết đánh giá độ ổn định kit dựa thời gian thu nhận tín hiệu khuếch đại 89 Bảng 3.26 So sánh độ nhạy kit đẳng nhiệt RPA phát 90 Bảng 3.27 So sánh độ đặc hiệu kit đẳng nhiệt RPA phát 90 Bảng 3.28 Kết đánh giá độ tương hợp loại kit 91 Bảng 3.29 Thành phần hỗn hợp phản ứng 93 Bảng 3.30 Chu trình nhiệt 94 Sau ngày bảo quản Sau 14 ngày bảo quản Sau 30 ngày bảo quản Sau 60 ngày bảo quản Sau 90 ngày bảo quản Hình Kết kiểm tra đánh giá độ ổn định kit phát Orientia tsutsugamushi sau 7, 14, 30, 60 90 ngày bảo quản PHỤ LỤC 2: TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT MỤC ĐÍCH CỦA BỘ KIT Phát chẩn đốn Orientia tsutsugamusi công nghệ khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) nhằm phục vụ cơng tác chẩn đốn, dự phòng bệnh sốt mò địa bàn trọng điểm NỘI DUNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ 2.1 Nguyên lý kit Orientia tsutsugamusi phát kit nhờ công nghệ khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification RPA công nghệ sử dụng hỗn hợp recombinase sinh vật tiền nhân để giúp primer gắn đặc hiệu vào gen đích Enzyme ADN polymerase thay sợi (tiểu phần lớn Bacillus subtilis PolI, Bsu) xúc tác phản ứng kéo dài primer để tổng hợp sợi ADN bổ sung Bộ kít phát O tsutsugamushi sử dụng công nghệ RPA với cặp mồi (primer) thiết kế đặc hiệu nhằm khuếch đại vùng trình tự gen 47 kDa Để có độ đặc hiệu cao nhất, mẫu dò đánh dấu huỳnh quang (probe) đặc hiệu với vùng trình tự khuếch đại chứa vị trí THF giúp enzyme Exo nuclease III nhận biết cắt đặc hiệu lai với sản phẩm khuếch đại Mỗi trình tự mục tiêu nhân tương ứng với tín hiệu huỳnh quang, đầu dò máy ghi nhận Cơng nghệ cho phép khuếch đại gen đích cách tổng hợp liên tục ADN mà không cần biến tính sợi kép ADN nhiệt độ cao Xét nghiệm tiến hành khoảng nhiệt độ từ 24°C đến 45°C với hiệu suất cao nhờ phát tín hiệu từ đơn phân tử đích sau 20 phút 2.2 Đích phát Trình tự gen đích dùng để thiết kế primer probe cho phát O tsutsugamushi sử dụng kit gen 47 kDa 2.3 Thành phần kit Bảng 1: Thành phần kit TT Thành phần Ký hiệu Reaction Buffer A1,A2 dNTPs B1,B2 Nuclease-freewater D1,D2 Probe E-mix Orientia tsutsugamushi C1, C2 I1,I2 oligo-mix Core Reaction Mix F1,F2 Exo E1,E2 MgOAc Positive Control H1, H2 G1,G2 2.4 Vật liệu, hóa chất thiết bị cung cấp người sử dụng 2.4.1 Hóa chất - Cồn (Ethanol) 90% 70% - Kít chiết tách ADN: E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit (Omega Biotek); E.Z.N.A.® SQ Blood DNA Kit (Omega Bio-tek); QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ); QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN ) kít tương đương 2.4.2 Thiết bị, dụng cụ - Máy trộn mẫu (Vortex) - Máy ly tâm nhỏ (Centrifuge Spin) - Máy lắc ủ nhiệt - Máy ly tâm lạnh cho ống eppendorf 1,5 ml - Micropipettes đầu típ có lọc tương ứng lấy thể tích: 0,5 – 10 µl; 10 -100 µl 100 - 1000µl - Ống PCR 200 µl - Ống eppendorf thể tích 0,5 ml ,5 ml - Ống ly tâm nhựa thể tích ml, 10 ml 50 ml 2.5 Cách tiến hành 2.5.1 Sơ đồ thực Mẫu bệnh phẩm Tách chiết DNA RPA khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Đọc kết Hình 1: Sơ đồ thực xét nghiệm 2.5.2 Chuẩn bị mẫu Tất loại mẫu phù hợp cho phản ứng khuếch đại RPA sử dụng Hãy đảm bảo mẫu ADN có độ tinh sạch, nồng độ tính tồn vẹn cao Ln ln chạy mẫu đối chứng dương kèm với mẫu Để chuẩn bị mẫu đối chứng âm, thay mẫu ADN nước RNase / Dnase 2.5.3 Tách chiết ADN Mẫu bệnh phẩm tách chiết ADN cách sử dụng kit sau: E.Z.N.A.® Blood DNA Mini Kit (Omega Bio-tek); E.Z.N.A.® MicroElute Viral RNA/DNA (Omega Bio-tek); E.Z.N.A.® SQ Blood DNA Kit (Omega Bio-tek); QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN ); QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN ) kít tương đương Quy trình tách chiết ADN thực theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit tách chiết E.Z.N.A.® MicroElute Viral RNA/DNA (Omega Bio-tek) Mẫu ADN sau tách chiết nên bảo quản tủ -80°C tiến hành thử nghiệm 2.5.4 Thực phản ứng RPA khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt - Rã đơng hồn tồn thành phần phản ứng mẫu ADN tách chiết (nếu đông) giữ chúng đá - Trộn ly tâm thành phần phản ứng để hỗn hợp đồng nhất, sau giữ chúng đá để có hiệu xét nghiệm cao - Chuẩn bị Master Mix theo Bảng 2: Bảng 2: Chuẩn bị Master Mix STT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cho phản ứng (µl) Reaction Buffer 2X 10 dNTPs 25 mM 1.44 Nuclease-freewater Probe E-mix Oligo-mix Core Reaction Mix 20 X Exo 50 X 0.4 0.52 10 X 1.64 Tổng thể tích dung dịch đểm thực phản ứng MgOAc Mẫu ADN 280 mM Tổng thể tích dung dịch thực phản ứng 17 20 - Đối với thành phần Core Reaction Mix Exo: bổ sung thành phần lên nắp tube sau đảo trộn lên xuống 10 lần ly tâm - Đảo trộn pipet thành phần dung dich đệm trước chia 17 µl ống phản ứng 0,2 ml - Bổ sung MgOAc mẫu ADN với thể tích tương ứng lên nắp tube phản ứng - Ly tâm để MgOAc mẫu ADN rơi xuống đáy ống phản ứng bắt đầu ủ Lưu ý: MgOAc giúp kích hoạt phản ứng diễn Phản ứng RPA xảy MgOAc thêm vào nhiệt độ phòng Do đó, hạn chế cho MgOAc tiếp xúc với master mix chưa tiến hành ủ - Cài đặt điều kiện phản ứng theo Bảng 3: Bảng 3: Chu trình nhiệt Nhiệt độ Thời gian Ghi 37°C 20 phút Khuếch đại (20s thu nhận tín hiệu lần) 4°C ∞ Lưu mẫu máy - Chuyển ống phản ứng vào máy đẳng nhiệt bắt đầu phản ứng theo điều kiện phản ứng cài đặt 2.5.5 Đọc kết - Kết phát O tsutsugamushi sử dụng kit phát O tsutsugamushi xác định dựa vào tín hiệu khuếch đại nhờ tín hiệu huỳnh quang thu từ hệ thống thu nhận tín hiệu huỳnh quang - Kiểm tra mẫu phải kết âm tính giả dương tính giả + Mẫu đối chứng dương phải cho kết dương tính có thời gian thu nhận tín hiệu khuếch đại trùng khớp với thời gian thu nhận tín hiệu khuếch đại mẫu chuẩn độ trước (mẫu chứng dương cung cấp kèm kít có thời gian thu nhận tín hiệu khuếch đại 10 phút) + Mẫu chứng âm phải cho kết âm tính - Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương đối chứng âm khơng phải thực lại xét nghiệm 2.6 Đóng gói, ghi nhãn 2.6.1 Mơ tả sản phẩm - Tên sản phẩm: Orientia tsutsugamushi RPA minikit - Mục đích sử dụng: Phát Orientia tsutsugamushi mẫu bệnh phẩm công nghệ khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt RPA 2.6.2 Đóng gói Bộ sinh phẩm Orientia tsutsugamushi RPA mini kit đóng gói hộp carton (50 test/hộp) Trên hộp có nhãn ghi Tên sản phẩm, Số lô, Hạn sử dụng, Điều kiện bảo quản; Tên, địa chỉ, số điện thoại nơi sản xuất Bảng thành phần kit Trong hộp có tờ hướng dẫn sử dụng kit Thành phần kit gồm: TT Thành phần Số lượng Ký hiệu Reaction Buffer x 300 µl A1, A2 dNTPs x 50 µl B1,B2 Probe E-mix x 60 µl Nuclease-freewwater x 100 µl D1,D2 Orientia tsutsugamushi x 50 µl I1, I2 C1, C2 oligo-mix Exo x 11 µl E1, E2 Core Reaction Mix x 30 µl F1, F2 Positive Control x 50 µl G1,G2 MgOAc x 50 µl H1, H2 PHỤ LỤC 3: BẢN ĐỐ CÁC TỈNH NGHIÊN CỨU Bản đồ hành tỉnh Điện Biên Bản đồ hành tỉnh Lai Châu Bản đồ hành tỉnh Hòa Bình Bản đồ hành tỉnh Sơn La Bản đồ huyện Mường Ảng - tỉnh Điện Biên Bản đồ huyện Phong Thổ - tỉnh Lai Châu Bản đồ huyện Mai Châu - tỉnh Hòa Bình Bản đồ huyện n Châu - tỉnh Sơn La PHỤ LỤC 4: MỘT SỐ THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU Máy trộn mẫu Voltex Máy ly tâm mini Máy khuếch đại đẳng nhiệt Máy RT-PCR Máy ly tâm ly tâm lạnh ... trùng mò khu vực Tây Bắc chế tạo sinh phẩm phát hiện triển khai nhằm mục tiêu: 1) Mô tả số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng mò đặc điểm phân bố bệnh sốt mò khu vực Tây Bắc năm 2016...BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN QUANG PHỤC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM NHIỄM Orientia tsutsugamushi, ẤU TRÙNG MÒ TẠI KHU VỰC TÂY BẮC VÀ CHẾ... TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng phương pháp nghiên cứu số đặc điểm nhiễm Orientia tsutsugamushi, ấu trùng sốt mò khu vực Tây Bắc 38 v 2.1.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên