Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV 1 trên nấm men pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC MỞ ĐẦU Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên nghành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đinh Nho Thái TS Nguyễn Thị Hồng Loan Hà Nội, 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Nho Thái, người thầy tận tình bảo, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm thí nghiệm viết luận văn Thầy không ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ làm quen từ nguyên tắc thao tác nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hồng Loan, tận tình hướng dẫn giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Trong trình học tập nghiên cứu, nhận giúp đỡ cán bộ, thành viên nhóm nghiên cứu môn Di truyền học, Khoa Sinh học phòng protein tái tổ hợp, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin cảm ơn thầy, cô giáo môn Di truyền học thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN giảng dạy bảo cho kiến thức kỹ cần thiết trình học tập làm luận văn tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo đồng nghiệp Trường THPT Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, ủng hộ, tạo điều kiện cho thời gian học tập vừa qua Lời cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng, con, người thân gia đình chia sẻ, động viên hết lòng giúp đỡ trình học tập nghiên cứu hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên: Đặng Thị Thanh Nhàn MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆUERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.1 TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV .ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.1.1 Lịch sử hình thành AIDS Error! Bookmark not defined 1.1.2 Thực trạng nhiễm HIV-1 Error! Bookmark not defined 1.1.3 Cấu trúc hình thể hệ gen HIV-1 Error! Bookmark not defined 1.1.4 Các thuốc điều trị HIV/AIDS Error! Bookmark not defined 1.2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 .ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.2.1 Protease HIV-1 Error! Bookmark not defined 1.2.2 Chức protease HIV – Error! Bookmark not defined 1.2.3 Sơ lƣợc nghiên cứu biểu protease HIV-1 giới Error! Bookmark not defined 1.2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV-1 Việt NamError! Bookmark not defined 1.3 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P PASTORIS ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.3.1 Đặc điểm P pastoris Error! Bookmark not defined 1.3.2 Ƣu nhƣợc điểm hệ thống biểu P pastorisError! Bookmark not defined 1.3.3 Chủng nấm men P pastoris biểu protease HIV-1Error! Bookmark not defined 1.3.4 Vector nhân dòng biểu P pastorisError! Bookmark not defined 1.3.5 Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P pastorisError! Bookmark not defined 1.3.6 Quá trình tiết protein ngoại bào P pastorisError! Bookmark not defined Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 NGUYÊN LIỆU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.1.1 Chủng vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác Error! Bookmark not defined 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.2.1 Nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined 2.2.2 Điện di DNA gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.3 Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: Error! Bookmark not defined 2.2.4 Tách chiết định lƣợng DNA plasmid Error! Bookmark not defined 2.2.5 Giải trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1Error! Bookmark not defined 2.2.6 Biến nạp vector vào nấm men phƣơng pháp xung điện Error! Bookmark not defined 2.2.7 Điện di protein gel polyacyamide (SDS-PAGE)Error! Bookmark not defined 2.2.8 Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) Error! Bookmark not defined 2.2.9 Phƣơng pháp biểu thu nhận protein 35 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………37 3.1 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.1.1 Nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 PCRError! Bookmark not defined 3.1.2 Tinh plasmid pPIC9 từ E coli Error! Bookmark not defined 3.1.3 Cắt sản phẩm PCR cắt mở vòng plasmid enzym giới hạn Error! Bookmark not defined 3.1.4 Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 phản ứng ligase Error! Bookmark not defined 3.1.5 Kết giải trình tự xác định có mặt protease HIV-1 vector biểu pPIC9 Error! Bookmark not defined 3.2 TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN P PASTORIS .ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.2.1 Tạo dòng nấm men P pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 Error! Bookmark not defined 3.2.2 Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV-1 P pastoris Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED KẾT LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED KIẾN NGHỊ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Cấu trúc hạt virus HIV-1 Hình Cấu tạo hệ gen virus HIV-1 Hình Mô hình cấu trúc bậc hai protease HIV-1 12 Hình Bản đồ vector biểu pPIC9 .21 Hình Cơ chế trao đổi chéo xảy locus HIS4 gen tế bào với vector biểu 22 Hình Kết nhân đoạn gen mã hóa protease HIV-1 PCR .Error! Bookmark not defined Hình Điện di sản phẩm tách chiết plasmid Error! Bookmark not defined Hình Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid sản phẩm PCR enzym giới hạn NotI EcoRI Error! Bookmark not defined Hình Điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli DH5α Error! Bookmark not defined Hình 10 So sánh trình tự cấu trúc Prot khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết Error! Bookmark not defined Hình 11 Sự hình thành khuẩn lạc P pastoris SMD1168 Error! Bookmark not defined Hình 12 Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men E rror! Bookmark not defined Hình 13 Đƣờng cong sinh trƣởng chủng P pastoris SMD1168 sau biểu môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian…………………………Error! Bookmark not defined Hình 14 Điện di SDS-PAGE kiểm tra có mặt protease HIV-1 chủng tái tổ hợp SMD1168 Error! Bookmark not defined Hình 15 Kết kiểm tra protein thẩm tách miễn dịch Western Blot Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Một số chủng P pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu protein tái tổ hợp Er ror! Bookmark not defined Bảng Các cặp mồi sử dụng phản ứng PCR .Error! Bookmark not defined Bảng Thành phần phản ứng PCR .Error! Bookmark not defined Bảng Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn Error! Bookmark not defined Bảng Thành phần gel tách gel cô SDS-PAGE Error! Bookmark not defined Bảng Khả sinh trƣởng dòng nấm men tái tổ hợp thông qua số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm lần Error! Bookmark not defined BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immuno Deficiency Syndrome) ART Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus(Antiretroviral drug therapy) AOX Alcohol oxidase Amp Ampicillin BMGY Buffered Minimal Glycerol Yeast Bp Base pair DNA Axit deoxyribonucleic ddNTP dideoxyribonucleotide – triphosphate E coli Escherichia coli HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ngƣời (Human immunodeficiency virus) HIS: Histidine KLPT Khối lƣợng phân tử kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani mRNA RNA thông tin (Messenger RNA) MM: Môi trƣờng Minimal Methanol P pastoris Pichia pastoris PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction) PI Chất ức chế protease (Protease Inlibitor) RNA Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sunfat SDS-PAGE: phƣơng pháp điện di gel polyacrylamid có SDS (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) UNAIDS Chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc ( United Nation Program on HIV/AIDS) MỞ ĐẦU Virus gây suy giảm miễm dịch ngƣời (Human Immuno Deficiency VirusHIV) nguyên nhân gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ngƣời (AIDS) Đây bệnh làm nhiều ngƣời chết lịch sử loài ngƣời [49] Có hai type HIV gây nên AIDS HIV type (HIV-1) HIV type (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc HIV-2 nguyên nhân ca nhiễm HIV toàn giới từ xuất [28] Để tồn phát triển, HIV-1 cần đến enzym quan trọng thiếu chép, đóng gói hình thành virus hoàn chỉnh là: enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase enzym protease Nếu ba enzym bị ức chế chu kì sống HIV bị ảnh hƣởng, hƣớng nghiên cứu tìm chất ức chế enzym để sản xuất thuốc điều trị cho bệnh nhân AIDS đƣợc nhiều nhà khoa học giới quan tâm Các điều trị theo hƣớng sử dụng chất ức chế enzym gọi liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus ART (antiretroviral drug therapy) [28] Enzym protease HIV-1 (đƣợc gọi tắt protease HIV-1) đƣợc mã hoá gen pol virus có chức cắt chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành protein cấu trúc chức cần thiết cho virus tiếp tục lây nhiễm Nếu protease bị hoạt tính, HIV-1 không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [19] Tuy nhiên, HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt virus đƣợc tạo ngày tỷ lệ sai sót enzym reverse transcriptase 1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến bệnh nhân nhiễm bệnh chí chƣa điều trị Ngày có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển thƣơng mại hóa nhƣng chƣa tìm đƣợc chất ức chế thực có hiệu Vì vậy, việc nghiên cứu tìm chất ức chế protease cách hiệu nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS Quá trình nghiên cứu nhằm tìm chất ức chế protease cần lƣợng lớn protease nên việc sản xuất, tinh protease HIV-1 cần thiết Cho đến nay, có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 toàn giới Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu tế bào vật chủ đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu đƣợc sau biểu thƣờng thấp, khó phát Do đó, cần có nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 có tính tan hiệu Phần lớn công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 Escherichia coli (E coli), hệ thống biểu đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41] Tuy nhiên, E coli sinh vật nhân sơ thiếu quan nội bào chẳng hạn nhƣ mạng lƣới nội chất máy golgi nhƣ sinh vật nhân chuẩn (có chức cải biến protein sau tổng hợp) Nhiều protein sinh vật nhân chuẩn biểu E coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức cải biến sau dịch mã không diễn Hạn chế đƣợc khắc phục cách sử dụng hệ thống biểu sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men động vật có vú Nấm men có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ đặc điểm thể mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn Nhiều protein tế bào nhân thực đƣợc sản xuất thành công hệ thống biểu nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) [10] Ngoài S cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P pastoris) bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu protein sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập tạo dòng P pastoris hệ thống biểu đáng tin cậy có tiềm E coli hay S cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27] Để tạo chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế nhân lên virus HIV-1, làm sở cho việc nghiên cứu tìm thuốc điều trị HIV/AIDS, với thuận lợi hệ thống biểu nấm men P pastoris so với E coli, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV-1 nấm men P pastoris” với nội dung: - Nhân gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu - Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV-1 nấm men P pastoris TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Phan Trọng Hoàng, Ngô Văn Trƣờng, Lê Văn sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2007) “Tách dòng biểu gen mã hóa tiểu đơn vị p66 enzym phiên mã ngƣợc virus HIV-1”, Tạp chí khoa học Công nghệ Sinh học, 5, tr 463-470 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thành Hổ, Chương 20 – Di truyền học vi sinh vật học, giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Hồng Loan (2012), Nhân dòng, biểu nghiên cứu số tính chất protease từ HIV-1 Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trƣờng Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu vùng gen preM-env virus Dengue typ nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hóa sinh học thực nghiệm, giáo trình, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 91-109 Phạm Đức Minh, Đặng Xuân Kiên, Trần Văn Tuấn, Trần thị Oanh, Lê Bách Quang, (2013), “Đặc điểm phân bố subtyp HIV-1 Việt nam”, tạp chí Y-Dược học quân (số 5-2013) tr 33-40 Đồng Văn Quyền, Hoàng Anh, Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Tùng, Lê Thị Tâm, Đinh Duy Kháng (2008), “Tách dòng biểu gen p24 từ chủng HIV lƣu hành Việt Nam nghiên cứu phản ứng protein tái tổ hợp với kháng thể HIV huyết bệnh nhân”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6, tr 27-34 Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Phƣơng Hoa, Lê Phƣơng Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), “ Biểu protein GP41 virus HIV phân type CRF01_ AE E coli ứng dụng để phát kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân Western blot ELISA”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9, tr 29-36 Bạch Thị Nhƣ Quỳnh (2012), Nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp HIV-1 ứng dụng để phát triển kit chẩn đoán HIV/AIDS, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 10 Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Kim Young-Ho, Đinh Duy Kháng, Đồng Văn Quyền (2007), "Tách dòng biểu gen mã hóa polymerase virus viêm gan B bề mặt tế bào Sacharomyces", Tạp chí Công nghệ sinh học 5(4), 419-424 II Tài liệu Tiếng Anh 11 Randy S., (2007), And The Band Played On, St Martin's Press, pp 227 12 Aurel Lupulescu, Maibach Howard I., (1990), Hormone and vitamins in cancer treatment, CRC PR INC, pp 131 - 133 13 Anson B.D., Weaver J.G., Ackerman M.J., Akinsete O., Henry K., January C.T., Badley A.D.(2005), “Blockade of HERG channels by HIV protease inhibitors”, Lancet 365: pp 682-686 14 Chen J., Liang Z., Wang W., Yi C., Zhang S., Zhang Q., (2014), "Revealing origin of decrease in potency of darunavir and amprenavir against HIV-2 relative to HIV-1 protease by molecular dynamics simulations", Sci Rep Nov 3;4:6872 doi: 10.1038/srep06872 15 Cheng Y.S.E., McGowan M.H., Kettner C.A., Schloss J.V., Erickson S., Yin F.H (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active enzym from inclusion bodies”, Gen, 87, pp 243-248 16 Cereghino L N., Geoffrey P., Sunga A J., Lin Cereghino J., and Cregg J M (2001), “Expression of foreign gens in the yeast P pastoris”, Gent End 23, pp 157-16 17 Cuba reports modest progress in HIV -1 (2013), Xinhua via NewsPoints Desk 18 Danley D.E., Geoghegan K.F., Scheld K.C., Lee S.E., Merson J.R., Hawrylik S.J., Rickett G.A., Atmnirati M.J and Hobart P.M (1989), “Crystallizable HIV-l protease derived from expression of the viral pol gen in Escherichia coli” Biochem Biophys Res Commun, 165, pp 1043-1050 19 Darke P.L., Leu C.T., Davis L.J., Heimbach J.C., Diehl R.E., Hill W.S., Dixon R.A.F and Siga I.S (1989), “Human immunodeficiency virus protease bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J Biol Chem, 264, pp 2307-2312 20 Dalgleish A.G., Beverley P.C., Clapham P.R., “The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus” Nature 1984, 312: 763-7 http://amedeo.com/lit.php?id=6096719 21 Ellis S B., Brust, P F., Koutz, P J., Waters, A F., Harpold, M M., and Gingeras, T R (1985), “Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable gens from the yeast P pastoris”, Mol Cell Biol, 5, pp 1111-1121 22 Jahic M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O (2006), “Process technology for production and recovery of heterologous proteins with P pastoris”, Biotechnol Prog, 22, pp 1465–1473 23 Frank Bruce H., Heiney, Richard E., ( 1995) "Process for transformating a human insulin precursor to human insulin", US Patent 5457066 24 Greene W.C (2007), "A history of AIDS: looking back to see ahead", Eur J Immunol, 37, pp 94-102 25 Galli M., Ridolfo A.L., Adorni F., Gervasoni C., Ravasio L., Corsico L., Gianelli E., Piazza M., Vaccarezza M., d'Arminio Monforte A., Moroni M (2002), "Body habitus changes and metabolic alterations in protease inhibitor-naive HIV-1-infected patients treated with two nucleoside reverse transcriptase inhibitors", AIDS, 29, pp 21-31 26 Hare B.C., (2006), "Clinical Overview of HIV Disease", HIV Insite Knowledge Base Chapter- Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu 27 Higgins D.R and Cregg J.M., (1998), Pichia protocol, Methods in molecular biology, Humana Prees 28 Hoffmann C., Rockstroh J.K., Kamps B.S HIV medicine (2007), www HIV Medicine.com 29 Invitrogen, Pichia Expression Kit: A manual of Method for Expression of Recombinant Protein in P pastoris Catalog K1710-01 30 Laemmli U.K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227, pp 680-685 31 Leuthardt A., Roesel J.L.(1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant poly-HIStidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 36, pp 275280 32 Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N., Poerwanto, H., Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al (2013), “The Effect of?-Mating Factor Secretion Signal Mutations on Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris”, Gene 519, pp 311–317 33 Marx J.L (August 1982) "New disease baffles medical community" Science 217 (4560): 618–21 34 Macauley-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil B., and Harvey L.M., (2005), “Heterologous protein production using the P pastoris expression system” Yeast, 22, pp 249–270 35 McCormac A C., et al., (1998) “A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation” Molecular Biotechnology 9:155-159 36 Miyeko Mana and David Marcey (2001), HIV-1 Protease, Clu Biology Department 37 Mike Romanos (1995), “Advances in the use of P pastoris for high level gen expression”, Current Opinion in Biotechnology, 6, pp 527-533 38 Oriol C., Ramon R., Jose Luis M., & Francisco V., (2006), “Monitoring and control of hetorologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters”, Bio Med central Operation strategies 39 Pichuantes S., Babe L M., Barr P l & Craik C S (1989), “Recombinant HIVl protease secreted by Saccharomyes cerevisiae correctly processes myristylated gag polyprotein”, Proteins: Struct Funct Gent 6, 324-337 40 Plantier, J.C (2009) ''A new human immunodeficiency virus derived from gorillas'', Nature Medicine, 2nd August 41 Rangwala S.H., Finn R.F., Smith C.E., Berberich S.A., Salsgiver W.J., Stallings W.C., Glover G.I., Olins P.O (1992), “High-level production of active HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gen, 122, pp 263-269 42 Sanger F., Nicklen S and Coulson A.R (1977), “DNA sequencing with chain terminator inhibitors”, Proc Natl Acad Sci U S A 74, pp 5463-5467 43 Shedlock D.J., Daniel H., Andy Y.C., Christopher W.C., Karuppiah M., David B.W (2008), "HIV-1 viral gen and mitochondria apoptosis", Apoptosis, 13, pp 1088-1099 44 Siliciano J.D., Kajdas J., Finzi D., Quinn T.C., Chadwick K., Margolick J.B., Kovacs C., Gange S.J., Siliciano R.F (2003), "Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells", Nat Med, 9, pp 727-728 45 Seelmeier S., Schmidt H., Turk, V and Helm K.V.D (1988), "Human immunodeficiency virus has an aspartic-type protease that can be inhibited by pepstatin A", Proc Natl Acad Sci U S A 85, pp 6612-6616 46 Taylor A., Brown P.D., Kadam S., Maus M., Kohlbrenner E.W., Weigl D., Turon C.M and Katz L (1992), “High-level expression and purification of mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter”, Appl Microbiol Biotechnol 37, pp 205-210 47 Tie Y (2006), Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1 protease and drug-resistant mutants, Chemistry Dissertations, Department of Chemistry, Georgia State University, pp 48 Tie Y., Wang YF, Boross PI, Chiu TY, Ghosh AK, Tozser J, Louis J M., Harrison RW, Weber IT, (2012), Critical differences in HIV-1 and HIV-2 protease specificity for clinical inhibitors, Protein Sci Epub 2012 Jan 24 49 UNAIDS in Vietnam from www.unaids.org.vn 50 Yanchunas J., Langley D.R., Tao L., Rose R.E., Friborg J., Colonno R.J., Doyle M.L (2005), "Molecular basis for increased susceptibility of isolates with atazanavir resistance-conferring substitution I50L to other protease inhibitors", Antimicrob Agents Chemother, 49, pp 3825-3832 51 Zhang W., Bevins M.A., Plantz B.A., Smith L.A., Meagher M.M (2000), "Modelling Pichia pastoris growth on methanol and optimising the production of a recombinant protein, the heavy-chain fragment C of botulinum neurotoxin, serotype A" Biotechnol Bioeng 70: 1–8 52 Zhang W., Inan M., Meagher M M (2005), Fermentation strategies for recombinant protein expression in the methylotrophic yeast P pastoris, Biotechnol Bioprocess Eng, 5, pp 275 – 28 53 http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html 54 http://www.anninhthudo.vn/506855.antd 55 http://www.diabetes.co.uk/diabetes-types.html 56 http://vietbao.vn/Bao-dong-ty-le-nhiem-HIV-AIDS-tren-the-gioi [...]... với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P pastoris so với E coli, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV- 1 trên nấm men P pastoris với các nội dung: - Nhân bản gen mã hóa protease HIV- 1 vào vector biểu hiện - Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV- 1 trên nấm men P pastoris 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt 1 Phan Trọng... để sản xuất protease HIV- 1 trên toàn thế giới Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV- 1 không dễ dàng biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện Do đó, cần có những nghiên cứu để sản xuất protease HIV- 1 có tính tan và hiệu quả hơn Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV- 1 ở Escherichia coli (E coli),... thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú Nấm men có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn Nhiều protein của tế bào nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) [10 ] Ngoài S cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P pastoris) ... (2007) “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tiểu đơn vị p66 của enzym phiên mã ngƣợc của virus HIV- 1 , Tạp chí khoa học Công nghệ Sinh học, 5, tr 463-470 2 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thành Hổ, Chương 20 – Di truyền học vi sinh vật học, giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam 3 Nguyễn Thị Hồng Loan (2 012 ), Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV- 1 tại Việt Nam, Luận... mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức chế nào thực sự có hiệu quả Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/ AIDS Quá trình nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên việc sản xuất, tinh sạch protease HIV- 1 là rất cần thiết 1 Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV- 1. .. Hồng (2005), Nghiên cứu biểu hiện vùng gen preM-env của virus Dengue typ 2 trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 5 Phan Tuấn Nghĩa (2 012 ), Hóa sinh học thực nghiệm, giáo trình, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 91- 109 6 Phạm Đức Minh, Đặng Xuân Kiên, Trần Văn Tuấn, Trần thị Oanh, Lê Bách Quang, (2 013 ), “Đặc điểm phân bố các subtyp HIV- 1 tại Việt nam”,... Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2 011 ), “ Biểu hiện protein GP 41 của virus HIV phân type CRF 01_ AE trong E coli ứng dụng để phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot và ELISA”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9, tr 29-36 3 9 Bạch Thị Nhƣ Quỳnh (2 012 ), Nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp của HIV- 1 và ứng dụng để phát triển kit chẩn đoán HIV/ AIDS, Luận án Tiến sỹ Sinh học,... VirusHIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời (AIDS) Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch sử loài ngƣời [49] Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV- 1) và HIV type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV- 1 độc hơn HIV- 2 và là nguyên nhân chính của các ca nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28] Để tồn tại và phát triển, HIV- 1. .. doi: 10 .10 38/srep06872 15 Cheng Y.S.E., McGowan M.H., Kettner C.A., Schloss J.V., Erickson S., Yin F.H (19 90), “High-level synthesis of recombinant HIV- 1 protease and the recovery of active enzym from inclusion bodies”, Gen, 87, pp 243-248 16 Cereghino L N., Geoffrey P., Sunga A J., Lin Cereghino J., and Cregg J M (20 01) , “Expression of foreign gens in the yeast P pastoris , Gent End 23, pp 15 7 -16 17 ... để biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo dòng P pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E coli hay S cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27] Để tạo ra chế phẩm protease HIV- 1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên của virus HIV- 1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/ AIDS,