Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV 1 trên nấm men pichia pastoris

Nếu một trong ba enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hưởng, chính vì vậy hướng nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh nhân AID

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN

NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE

CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Nho Thái,

người thầy đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thí nghiệm và viết luận văn Thầy đã không ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ tôi làm quen từ những nguyên tắc và thao tác đầu tiên trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Hồng Loan, đã tận tình hướng

dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này

Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ, thành viên trong nhóm nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học

và phòng protein tái tổ hợp, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Tôi xin chân thành cảm ơn

về sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Di truyền học cũng như các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng cần thiết trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại Trường THPT Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, đã ủng hộ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học tập vừa qua

Lời cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng, con, những người thân trong gia đình tôi đã chia sẻ, động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Học viên:

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.TỔNGQUANVỀAIDSVÀHIV 3

1.1.1 Lịch sử hình thành AIDS 3

1.1.2 Thực trạng nhiễm HIV-1 4

1.1.3 Cấu trúc hình thể và hệ gen của HIV-1 5

1.1.4 Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay 9

1.2.TỔNGQUANVỀPROTEASEHIV-1 12

1.2.1 Protease HIV-1 12

1.2.2 Chức năng của protease HIV – 1 13

1.2.3 Sơ lược về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới 13

1.2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam 16

1.3.GIỚITHIỆUCHUNGVỀP PASTORIS 17

1.3.1 Đặc điểm của P pastoris 18

1.3.2 Ưu nhược điểm của hệ thống biểu hiện P pastoris 19

1.3.3 Chủng nấm men P pastoris biểu hiện protease HIV-1 20

1.3.4 Vector nhân dòng và biểu hiện ở P pastoris 21

1.3.5 Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P pastoris 22

1.3.6 Quá trình tiết protein ngoại bào ở P pastoris 22

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.NGUYÊNLIỆU 24

2.1.1 Chủng vi sinh vật 24

2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác 24

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 25

2.2.1 Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR 25

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose 27

2.2.3 Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: 28

2.2.4 Tách chiết và định lượng DNA plasmid 30

2.2.5 Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 31

2.2.6 Biến nạp vector vào nấm men bằng phương pháp xung điện 32

2.2.7 Điện di protein trên gel polyacyamide (SDS-PAGE) 33

2.2.8 Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) 34

2.2.9 Phương pháp biểu hiện và thu nhận protein 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………37

3.1.NHÂNDÒNGĐOẠNGENMÃHÓAPROTEASEHIV-1 37

3.1.1 Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR 37

3.1.2 Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E coli 39

3.1.3 Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn 40

3.1.4 Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản ứng ligase 41

3.1.5 Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của protease HIV-1 trong vector biểu hiện pPIC9 42

3.2.TẠODÒNGVÀBIỂUHIỆNGENMÃHÓAPROTEASEHIV-1TRÊNP PASTORIS 44

3.2.1 Tạo dòng nấm men P pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 44

3.2.2 Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P pastoris 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

1.KẾTLUẬN 53

2.KIẾNNGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc của một hạt virus HIV-1 6

Hình 2 Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1. 7

Hình 3 Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1 12

Hình 4 Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 21

Hình 5 Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus HIS4 giữa bộ gen của tế bào với vector biểu hiện 22

Hình 6 Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR 38

Hình 7 Điện di sản phẩm tách chiết plasmid 39

Hình 8 Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzym giới hạn NotI và EcoRI 40

Hình 9 Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E coli DH5α 42

Hình 10 So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạcvới cấu trúc Prot lý thuyết 43

Hình 11 Sự hình thành khuẩn lạc trên P pastoris SMD1168 45

Hình 12 Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu được sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men 46

Hình 13 Đường cong sinh trưởng của các chủng P pastoris SMD1168 sau khi biểu hiện ở môi trường có chứa 0.5% methanol theo thời gian………49

Hình 14 Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng tái tổ hợp SMD1168 50

Hình 15 Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western Blot 51

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Một số chủng P pastoris phổ biến được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ

hợp 20

Bảng 2 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR 26

Bảng 3 Thành phần phản ứng PCR 27

Bảng 4 Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn 28

Bảng 5 Thành phần gel tách và gel cô trong SDS-PAGE 33

Bảng 6 Khả năng sinh trưởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3 lần 48

Ampicillin Buffered Minimal Glycerol Yeast Base pair

Axit deoxyribonucleic dideoxyribonucleotide – triphosphate

Escherichia coli

Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus) Histidine

Khối lượng phân tử

Kilobase Kilo Dalton Luria-Bertani RNA thông tin (Messenger RNA) Môi trường Minimal Methanol

Pichia pastoris

Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction) Chất ức chế protease (Protease Inlibitor)

Axit ribonucleic Sodium dodecyl sunfat phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có SDS (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

Chương trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc ( United Nation Program on HIV/AIDS)

MỞ ĐẦU

Virus gây suy giảm miễm dịch ở người (Human Immuno Deficiency Virus- HIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở người (AIDS) Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều người chết nhất trong lịch

sử loài người [49] Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV - 2), nhưng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28]

Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã ngược reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease Nếu một trong ba enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hưởng, chính vì vậy hướng nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh nhân AIDS đã được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm Các điều trị theo hướng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus ART (antiretroviral drug therapy) [28]

Enzym protease của HIV-1 (được gọi tắt là protease HIV-1) được mã hoá bởi

gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các

protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không được đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [19] Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là 1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chưa điều trị Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV được phát triển và thương mại hóa nhưng vẫn chưa tìm được chất ức chế nào thực sự có hiệu quả Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS Quá trình nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lượng lớn protease nên việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết

Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 trên toàn thế giới Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lượng protease thu được sau biểu hiện thường thấp, khó phát hiện Do đó, cần có những nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn

Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia

coli (E coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41] Tuy

nhiên, E coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn như

mạng lưới nội chất và bộ máy golgi như trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng cải biến protein sau tổng hợp) Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện

ở E coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến

sau dịch mã không diễn ra Hạn chế này được khắc phục bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn như nấm men và động vật có vú Nấm men

có cấu trúc đơn giản, nhưng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn Nhiều protein của tế bào

nhân thực đã được sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men

Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) [10] Ngoài S cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P pastoris) cũng bắt đầu được quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của

sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase được phân lập và tạo

dòng P pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E coli hay S cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27].

Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS,

cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P pastoris so với E coli,

chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa

protease của HIV-1 trên nấm men P pastoris” với các nội dung:

- Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện

- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P

pastoris

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV

1.1.1 Nguyên nhân hình thành AIDS

Thuật ngữ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome - Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) được đề xuất trong cuộc họp tại Washington của các nhà lãnh đạo cộng đồng người đồng tính, các quan chức và CDC (trung tâm kiểm soát

và phòng ngừa dịch bệnh Hoa kỳ) để thay thế cho GRID (suy giảm miễn dịch liên quan đến đồng tính) vào tháng 7 năm 1982 [11] Đến tháng 8 năm 1982, AIDS đã trở thành tên gọi về hội chứng suy giảm miễn dịch ở người do tác nhân HIV gây nên [38] Virus gây suy giảm miễn dịch được phát hiện lần đầu vào năm 1959 tại Châu Phi, và phân lập đầu tiên do Luc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris thực hiện năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV) Năm 1986, virus này được Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV [24] Cũng vào 1986, L Montagnier lại phân lập được một loại virus tương tự ở Tây Phi và đặt tên là HIV type 2 (HIV-2), đây là loại virus gốc của HIV-1 Cả HIV-1 và HIV-2 đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của người nên được đặt tên chung là HIV Chúng giống nhau về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phương pháp điều trị nhưng người nhiễm HIV-2 ít phát sinh bệnh hơn so với HIV-1 và HIV-2 chủ yếu thấy ở các vùng Châu Phi [28] Bởi vậy, bệnh AIDS hiện nay được hình thành do tác nhân chính là virus HIV-1

Theo phân loại, HIV thuộc họ Retrovirus, chi Lentivirus, có hai loại là

HIV-1 và HIV-2 Retrovirus là họ gây ung thư cho người và động vật HIV-HIV-1 có 4 nhóm chính là M (main), N (new) và O (outlier) và nhóm P [40] Trong đó, nhóm M xuất hiện tới 90% tổng số các ca lây nhiễm HIV trên toàn thế giới, nhóm này có 9 phân type (subtypes or clades) được kí hiệu bằng các chữ cái A; B; C; D; E; F; G; H; J; K

và 49 dạng tái tổ hợp khác gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) [6] Sự khác nhau giữa phân nhóm này và phân nhóm khác là trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vượt quá 30% Vị trí địa lý có thể ảnh hưởng đến sự

lây nhiễm các phân nhóm khác nhau như phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Austalia, còn ở các nước đang phát triển như Châu Á và Châu Phi, nơi mà có nhiều người bị nhiễm HIV-1 đang sinh sống thì lại phổ biến các phân nhóm không thuộc nhóm B Cụ thể, theo ghi nhận của Ngân hàng Gen HIV Hoa Kỳ, kiểu gen CRF25_CPX thường chỉ xuất hiện ở Châu Phi [53] Những nghiên cứu ban đầu về dịch tễ học phân tử của HIV đã xác định được phân týp chính lưu hành tại Việt Nam đó là phân týp CRF01_AE (96,7%) và phân týp B (3,3%) [10] Năm 2013, Phạm Đức Minh và cộng sự đã công bố kết quả phân typ AE và B ở Việt Nam lần lượt là 98,53% và 1,33% [6]

1.1.2 Thực trạng nhiễm HIV-1

Sau gần nửa thế kỷ phát hiện ra HIV đến nay, HIV/AIDS vẫn là đại dịch thế

kỷ chưa có vaccine phòng ngừa hay thuốc chữa trị đặc hiệu Với tốc độ lây lan nhanh, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Phi và các nước Châu Á Theo ước tính của chương trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc UNAIDS, trung bình mỗi ngày trên thế giới có thêm khoảng 7000 người nhiễm HIV UNAIDS đã công bố báo cáo thống kê trong năm 2012 thế giới có khoảng 2,3 triệu các trường hợp nhiễm mới HIV ở người lớn và trẻ em, giảm 33% so với năm

2001, các trường hợp tử vong liên quan đến AIDS cũng giảm 30% so với mức đỉnh năm 2005 [49] Đây là kết quả của sự nỗ lực không ngừng trong công tác truyền thông phòng, chống HIV và việc mở rộng tiếp cận điều trị theo hướng kháng virus làm giảm số người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh Những con số thống

kê này cho thấy hy vọng có thể ngăn chặn và đẩy lùi đại dịch HIV/AIDS trên toàn cầu khi nâng cao hơn nữa tính hiệu quả của các phương pháp điều trị phòng và chống HIV/AIDS

Tuy nhiên, theo công bố của WHO, HIV vẫn tiếp tục là một vấn đề y tế công cộng quan trọng toàn cầu Đến hết năm 2013 trên toàn thế giới, có khoảng 1,5 triệu người chết vì các nguyên nhân liên quan đến HIV, 33,2 - 37,2 triệu người sống chung với HIV với hơn 2,1 triệu người nhiễm mới Trong đó, Sahara Châu Phi là khu vực có số người nhiễm HIV lớn nhất thế giới với trên 24,7 triệu người sống

chung với HIV, số người nhiễm mới cũng chiếm gần 70% tổng số người nhiễm trên toàn cầu [56]

Ở Việt Nam, năm 1990 phát hiện bệnh nhân dương tính với HIV đầu tiên Theo báo cáo của Cục phòng chống AIDS, giữa những năm 2000 đến 2007, số người nhiễm HIV đã tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 người và mỗi năm có khoảng 40.000 người nhiễm mới Tính đến 30/9/2010 trên cả nước có 180.631 người nhiễm HIV, đến ngày 30/9/2013 cả nước có 218.427 người nhiễm HIV, trong

đó có 66.729 người ở giai đoạn AIDS, 66.116 trường hợp tử vong do HIV/AIDS, và trung bình mỗi ngày cả nước phát hiện thêm 34 người nhiễm HIV [49] Theo báo cáo mới nhất của cục phòng chống HIV/AIDS, tính đến ngày 30/4/2014, toàn quốc hiện có 219.163 trường hợp báo cáo hiện nhiễm HIV (trong đó số bệnh nhân chuyển sang giai đoạn AIDS là 67.557), đến 31/8/2014 có 223.130 người nhiễm HIV được phát hiện Đây chỉ là số người nhiễm HIV được phát hiện và xác nhận, số người nhiễm thực tế có thể lớn hơn[49]

Nhìn chung, đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn tập trung và xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt nhóm tiêm chích ma túy và mại dâm ở các thành phố lớn

1.1.3 Hình dạng cấu trúc và hệ gen của HIV-1

1.1.3.1 Hình dạng cấu trúc của HIV-1

HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc hình thể không khác nhau nhiều mà chỉ khác biệt với nhau về khối lượng của các protein và các gen phụ trợ Chúng đều nhân bản trong tế bào lympho CD4 và cùng gây bệnh ở người, nhưng mức độ suy giảm miễn dịch do HIV-1 gây ra nhiều hơn so với HIV-2 [28]

Về cấu tạo (Hình 1), HIV-1 có dạng hình cầu, có đường kính 100 nm và được bao quanh bởi màng lipoprotein Lớp ngoài cùng của virus là lớp lipit kép với

nhiều protein Env gắn vào và nhô lên Protein Env gồm hai phần là phần chỏm

(gp120) và phần thân (gp41) Trong quá trình nảy chồi, các protein khác nhau từ màng của tế bào vật chủ có thể được gắn vào màng lipoprotein của virus, (chẳng hạn như protein HLA lớp I và II, hay protein bám dính ICAM) tạo điều kiện cho virus tiếp xúc, gắn vào các tế bào mục tiêu Bên trong màng lipoprotein là protein P17, tiếp đến là lõi của virus Lõi có dạng hình trụ được bao bọc bởi lớp capsid được tạo thành từ 2000 bản sao của protein p24 Bên trong lõi có hai bản sao của RNA HIV-1, các enzym phiên mã ngược và integrase[28]

1.1.3.2 Cấu tạo hệ gen của HIV

Virus HIV-1 có hệ gen nằm trong phần lõi với hai sợi RNA (+) đơn, trên mỗi sợi có 9 gen mã hoá cho 15 protein khác nhau và có chiều dài khoảng 9,8 kb Mỗi

sợi RNA (Hình 2), có 3 gen cấu trúc là gen gag “group- antigen (kháng nguyên nhóm)”; gen pol “polymerase” và gen env “envelope - vỏ” Các gen gag và env mã

Hình 1 Cấu trúc của một hạt virus HIV-1 [28]

Protein tế bào chủ

reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease Ngoài 3 gen chính,

HIV-1 còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các

protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm

các loại bệnh khác nhau [28]

1.1.3.3 Sự xâm nhiễm vào tế bào và nhân lên của HIV-1

HIV truyền nhiễm theo các con đường bao gồm quan hệ tình dục không an

toàn với người nhiễm HIV, truyền máu và các sản phẩm của máu (có thể qua thụ

tinh nhân tạo, ghép da và ghép tạng), dùng lại kim tiêm không tiệt trùng của người

nhiễm và từ mẹ sang con [28]

Virus HIV xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua các thụ thể Phân tử

CD4 là thụ thể chính của HIV-1, HIV-2 và SIV, đã được mô tả từ năm 1984 [20]

CD4 có thể thấy trên bề mặt của 60% các tế bào: lympho T; các tế bào tiền thân của

lympho T trong tủy xương, tuyến ức; trên các tế bào đơn, đại thực bào, bạch cầu ưa

Hình 2 Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1 [28]

Bao gồm 9 gen: gag, pol, vif, vpr, vpu, env, tat, rev và gen nef

Gal, pol, env là 3 gen cấu trúc mã hóa các protein cấu tạo vỏ và lõi virus HIV-1

Tat, rev, vif, vpr, vpu và nef là 6 gen phụ

kiềm, tế bào tua (dendritic cell) và các tế bào thần kinh đệm (microglial cell) [28] Các tế bào này có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, chúng nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt vi sinh vật

lạ xuất hiện trong cơ thể Chu trình nhân bản của HIV gồm 6 bước: I) gắn và xâm nhập, II) cởi bỏ lớp vỏ bên ngoài, III) phiên mã ngược, IV) gắn provirus, V) tổng hợp protein virus và lắp ráp, VI) nảy chồi Toàn bộ con đường sao chép của HIV có thể được chia thành 3 sự kiện chính: virus gắn vào tế bào, quá trình hoạt hóa và dung hợp Quá trình lây nhiễm HIV được bắt đầu khi protein bề mặt vỏ gp120 gắn vào thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào đích Sự liên kết đầu tiên của gp120 với CD4 để

lộ ra các vùng đặc hiệu trên vòng V3 của gp120 để gp120 có thể gắn với các đồng thụ thể chemokine (CCR5, CXCR4) trên bề mặt tế bào đích Tiếp đó phân tử gp41 qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích và hòa tan màng, HIV-1 cởi bỏ lớp vỏ lipid bên ngoài và bơm vật liệu di truyền RNA của nó cùng với enzym reverse transcriptase vào tế bào chất của tế bào vật chủ Nhờ enzym reverse transcriptase

mà sợi RNA của virus được tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA) Tiếp đến là

sự kết hợp của RNA virus với sợi cDNA thành chuỗi RNA/DNA - chuỗi lai này chuyển thành 2 sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành DNA xoắn dạng vòng chui qua màng nhân vào trong nhân tế bào Nhờ enzym integrase mà sợi DNA virus được chèn vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào chủ DNA virus được hợp thành

có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trước khi trở thành dạng hoạt động mà không có biểu hiện bệnh [26] Sau khi lây nhiễm vào vật chủ, hệ gen của virus HIV-1 sẽ được sao chép nhờ sự điều khiển phức tạp của một

số protein như Tat và các yếu tố sao chép DNA của tế bào vật chủ Do hệ gen vật chủ bị thay đổi cấu trúc khi DNA của virus chèn vào, DNA của virus chỉ thị cho tế bào phiên mã ra RNA virus nhờ enzym DNA polymerase tế bào vật chủ Số lượng

RNA của virus được tăng lên, tiếp tục tổng hợp các protein virus nhờ ribosome của

tế bào vật chủ, chúng cùng di chuyển ra tế bào chất hoặc màng tế bào, sau đó là quá trình nảy chồi tạo thành các viron nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi vào máu và tiếp tục gắn vào các tế bào lympho T khác [26; 28]

1.1.4 Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay

Lý do khiến cho việc phát triển vaccine phòng chống nhiễm HIV-1 gặp rất nhiều khó khăn và thường thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, lại thường xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên Sau nhiều nghiên cứu, đến ngày 6 tháng 3 năm 2012, các nhà nghiên cứu sinh học hàng đầu Cuba đã thử nghiệm thành công một loại vaccine mới với tên Teravac chống HIV/AIDS trên chuột, đã sẵn sàng để thử nghiệm trên con người Vaccine được triển khai từ một protein tái tổ hợp có những phân tử giống virus, kích thích đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, theo Iglesias, trưởng nhóm nghiên cứu vaccine Teravac, vaccine này ban đầu phải được thử nghiệm lâm sàng với số lượng nhỏ, trên một nhóm bệnh nhân AIDS đang ở giai đoạn đầu và cũng không nên hy vọng quá cao vào vaccine này Tiếp theo là các cuộc thử nghiệm nhằm kiểm tra độ an toàn của vaccine, và việc phát triển một vaccine hiệu quả đòi hỏi nhiều năm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

trước khi đưa ra loại vaccine có thể thử nghiệm trên người lành [17]

Vì nhiều nguyên nhân trên mà việc sản xuất vaccine phòng HIV theo phương pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn Người nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có cách duy nhất là dùng thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của HIV-1 Việc điều trị HIV/AIDS phức tạp, tốn kém và chỉ giúp kéo dài sự sống mà không chữa khỏi được bệnh Các loại thuốc điều trị HIV/AIDS có thể hướng đến các đích khác nhau dựa trên cơ sở hiểu biết về quá trình nhiễm và nhân lên của HIV trong tế bào như: Ức chế quá trình nảy chồi; ức chế quá trình hoà màng và xâm nhập của HIV-1 Phương pháp phổ biến nhất là liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) được áp dụng từ những năm 1987 bao gồm thuốc ức chế enzym reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease [28] ART là liệu pháp điều trị sử dụng các thuốc kháng virus hay còn gọi là thuốc ARV (Anti-retrovirus) Các thuốc ARV có tác dụng làm chậm sự nhân lên của HIV trong cơ thể, do đó tăng khả năng miễn dịch và ít mắc các nhiễm trùng cơ hội

Các thuốc kháng retrovirus ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác nhau trong vòng đời của virus Hiện có một số nhóm như:

+ Các chất ức chế reverse transcriptase tương tự nucleoside (NRTI): NRTI ức chế

sự sao chép của enzym phiên mã ngược reverse transcriptase Nhóm thuốc này gồm zidovudine, lamivudine, didanosin, zalcitabine, stavudine và abacavir Đặc tính của thuốc nucleoside cũng gây ra các rối loạn về chuyển hoá đặc biệt là teo mỡ Có thể chúng liên quan đến ức chế hoạt động của ty thể do hoạt động chức năng của ty thể cần đến nucleoside Qúa trình chuyển hóa trong ty thể bị rối loạn do phải sử dụng các nucleoside “giả” dẫn đến sự thoái hoá của ty thể [25]

+ Các chất ức chế protease (PI): Đây là nhóm thuốc gây cản trở sự nhân lên của

HIV bằng cách tác động vào enzym protease của virus, làm cho cấu trúc HIV bị rối loạn và không gây nhiễm Tuy nhiên, khi điều trị bằng PI, bệnh nhân thường phải uống nhiều lần thuốc trong một ngày và việc điều trị kéo dài gây ra một số tác dụng phụ như: bệnh dạ dày, ruột, giảm chức năng gan, rối loạn lipid máu, loạn nhịp tim [13] Những hạn chế này cũng đã được khắc phục khi PI mới (PI tăng cường) ra đời Thuốc PI tăng cường được phân biệt với thuốc PI bằng chữ “r” thêm vào sau tên thuốc Các thuốc trong nhóm gồm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir và atazanavir

+ Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI) Những thuốc

này phong bế hoàn toàn vị trí gắn các chất hoạt hóa enzym reverse transcriptase bằng cách gắn trực tiếp với enzym này, làm giảm quá trình tổng hợp axit nucleic Nhóm thuốc này gồm các thuốc nevirapine, delavirdine và efavirenz Một số nghiên cứu cho rằng nếu đảm bảo đã ức chế được virus thì có thể dùng NNRTI điều trị thay cho PI Trong trường hợp này, sử dụng NNRTI đôi khi đem lại hiệu lực tốt hơn việc tiếp tục điều trị bằng các thuốc PI [28]

+ Các chất ức chế enzym reverse transcriptase nucleoside (NtRTI): Hoạt động của

nhóm thuốc này rất giống với NRTI nhưng tác dụng nhanh hơn Tenofovir là thuốc duy nhất trong nhóm này có thể ức chế cả HIV và viêm gan B, đặc biệt lại có có hiệu quả ngay cả ở bệnh nhân đã kháng NRTI

+ Các chất ức chế hoà nhập: Nhóm thuốc này không cho virus nhân lên bằng cách

ngăn không cho màng virus hoà nhập với màng của tế bào khỏe mạnh Thuốc đầu tiên trong nhóm này là enfuvirtide

Để tăng hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ, các loại thuốc thường được dùng phối hợp trong điểu trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS Thực tế cho thấy, HIV/AIDS rất khó điều trị triệt để Thời gian ước lượng có thể xoá sạch các tế bào mang HIV-1

là 73,3 năm, nghĩa là HIV-1 không thể chữa khỏi hoàn toàn [44]

Đối mặt với nhiều khó khăn, cùng với sự biến đổi phức tạp của HIV-1, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực không ngừng, nghiên cứu và tìm ra thuốc chống HIV mới, hiệu quả hơn mang lại hy vọng sống cho nhiều bệnh nhận HIV/AIDS

1.2 TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1

1.2.1 Protease HIV-1

Protease HIV-1 là enzym có vai trò phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của

virus Protease HIV-1 được mã hóa bởi gen pol trong hệ gen của HIV-1 và là một

protease aspartyl (chứa aspartyl trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A2, được tạo ra khi HIV-1 nhiễm vào tế bào vật chủ

Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt nhau được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng 11 kDa gồm 99 axit amin Mỗi tiểu phần tạo thành các phiến gấp nếp β và một đoạn xoắn α ngắn gần đầu C [47] Trung tâm hoạt động của protease nằm tại mặt phân giới của dimer, chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27 Trong đó, mỗi monomer đều có một bộ ba Asp-Thr-Gly với vị trí axit amin tương ứng như sau: 25 (25’) - 26(26’) -

27 (27’) và phân tử Asp cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease [36] Protease HIV-1 có cấu tạo gồm ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và

vùng mũ

Hình 3 Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1 [47]

Một tiểu phần bao gồm: βa(1-4); βb(9-15); βc(16-27); βd(30-35); βa’(43-49); βb’(52-56);

βc’(69-78); βd’(83-85); Đoạn xoắn αh(86-94); chuỗi thẳng q(95-99) ở đầu C

Vùng dimer hóa gồm các axit amin: Chuỗi βa(1-4), βq(95-99), và axit amin 24-29; Vùng lõi gồm các axit amin nằm ở 4 phần đầu sợi β : 10-32, 63-85, chứa trung tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động

1.2.2 Chức năng của protease HIV – 1

Về mặt sinh học, protease HIV-1 có vai trò quan trọng trong chu trình nhân

lên của HIV-1 Các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) là cơ chất đặc hiệu của

protease HIV-1, các polyprotein này được protease HIV-1 cắt thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh Cụ thể, protease HIV-1 có thể nhận biết và cắt các liên kết khác nhau trên chuỗi polypeptide gag để tạo thành các protein cấu trúc: matrix P17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai trò quan trọng hình thành lớp capsid và các protein bao bọc lõi tạo virus hoàn chỉnh; protease HIV-1 còn thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành ba enzym: protease, reverse transcriptase và integrase cần thiết cho sự sao chép của HIV trong quá trình lây nhiễm [25]

Ngoài ảnh hưởng đến quá trình lây nhiễm, protease HIV-1 còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh Khi đã xâm nhiễm vào tế bào người, protease HIV-1 không chỉ phân cắt các polypeptide của chính nó mà còn có thể thủy phân rất nhiều protein của vật chủ như actin, procaspase 8, Bcl2 (protein điều hòa chết theo chương trình - apoptosis) [43] Khi protease HIV-1 xuất hiện, gây độc và làm rối loạn các hoạt động trong tế bào vật chủ Nhiều nghiên cứu cũng khẳng định, sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tượng chết theo chương trình

do protease HIV-1 gây nên [43]

Như vậy, Protease HIV-1 có vai trò quan trọng không thể thiếu trong chu trình nhân lên của virus cũng như quá trình sinh bệnh ở người Khi protease HIV-1

bị ức chế hoặc gen mã hóa protease HIV-1 bị đột biến, virus không thể đóng gói thành virion hoàn chỉnh nên không thể xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19] Một trong những chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 được biết đến đầu tiên là pepstatin A [45]

1.2.3 Sơ lược về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới

Nguyên nhân mà cho đến nay chưa sản xuất được vaccine HIV là do sự biến đổi liên tục của kháng nguyên HIV-1, vì thế mà những bệnh nhân nhiễm HIV-1 chỉ

còn cách dùng thuốc để duy trì sự sống Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chất ức chế sự xâm nhiễm, lây lan của HIV-1 Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng nhất của liệu pháp điều chế thuốc ức chế HIV-1 vì protease HIV-1

có vai trò không thể thiếu trong chu trình sống của HIV-1 Do vậy, cần một lượng lớn protease HIV-1 trong quá trình nghiên cứu tìm ra và tổng hợp các chất ức chế,

mà lượng protease HIV-1 trong virus HIV rất nhỏ nên việc tách chiết trực tiếp gần như không thể thực hiện Ngoài ra, protease HIV-1 cắt cơ chất rất đặc hiệu nên việc dùng các protease khác làm mô hình cũng không có hiệu quả

Protease HIV-1 đã được nghiên cứu sản xuất dưới dạng tái tổ hợp bằng cách

biểu hiện trên vi khuẩn E coli, trên nấm men S cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hóa học các monomer 99 axit amin Vi khuẩn E coli được sử dụng khá phổ biến

trong nhiều nghiên cứu đầu tiên Sau đó một số loại nấm men đã được chọn bởi một

số ưu thế so với vi khuẩn E coli trong biểu hiện protease HIV-1

Năm 1989, một số nhà nghiên đã biểu hiện protease HIV-1 bằng việc sử dụng

các vector pPRT và pHIVexpo15 có promoter trp trong vi khuẩn E coli [18; 19]

Protease thu được sau khi tinh sạch được xác định khối lượng phân tử (KLPT) của một monomer khoảng 11kDa, bao gồm 99 axit amin, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng như phân cắt cơ chất tổng hợp [19] Tuy nhiên, protease HIV-1 biểu hiện thấp, chỉ chiếm 0,02% protein tổng số của tế bào, và băng protease chỉ phát hiện được bằng thẩm tách miễn dịch với kháng thể đặc hiệu

Đến năm 1990, Cheng và tập thể đã sử dụng hệ thống vector pET3AM với

promoter T7 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 ở tế bào E coli JM105 đồng

nhiễm với phage αCE6 [15] Tuy nhiên, với hệ thống biểu hiện này thì việc lây nhiễm phage vào tế bào vi khuẩn là bắt buộc mà sự có mặt của phage có thể không thích hợp cho quá trình lên men để sản xuất lớn [46]

Năm 1992, Rangwala và tập thể đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá

trình biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn E coli Nghiên cứu chỉ ra rằng, protease

HIV-1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản như các protein tái tổ hợp

khác ở vi khuẩn E coli [41]

Năm 1993, Leuthardt và Roesel nghiên cứu gắn thêm 3 gốc histidine (3xHIS) ở đầu N và đầu C của protease trong nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch

protease HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H trên E coli Việc gắn

thêm 6 gốc HIS là một cải tiến tạo thuận lợi cho quá trình tinh sạch [31] Kết quả của nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau biểu hiện được thu ở phân đoạn tủa của tế bào (pellet) và được hòa tan hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6M

Protease HIV-1 đã được nhiều nhóm nghiên cứu biểu hiện trên vi khuẩn E

coli bằng cách thiết kế các vector khác nhau Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng

cho thấy biểu hiện protease HIV-1 có hoạt tính là gây độc giết chết tế bào [18] Các nhà nghiên cứu đưa ra nhiều lý do giải thích, trong đó có dự đoán rằng protease

HIV-1 có thể thủy phân các protein chức năng của tế bào vi khuẩn E coli [18]

Nhằm tìm cách khắc phục tính độc này, một số nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống và quy trình biểu hiện

khác nhau như sử dụng các promoter trp, λP L , ara BAD và tac [19; 46] Một số

nghiên cứu đã tiến hành biểu hiện protease HIV-1 ở nấm men S cerevisiae [39]

Pichuantes và tập thể (1989) đã biểu hiện thành công protease HIV-1 tái tổ hợp ở nấm men [39] Protease tạo ra cũng có hoạt tính tự cắt khỏi dạng protein dung hợp

để giải phóng protease HIV-1 99 axit amin cũng như có hoạt tính cắt cơ chất protein gag tự nhiên

Theo kết quả công bố của nhiều nhóm nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy rằng quá trình sản xuất protease này vẫn còn gặp nhiều khó khăn: Thứ nhất do protease HIV-1 có hoạt tính gây độc với tế bào chủ và chủ yếu được biểu hiện ở dạng không hòa tan (90% dạng thể vùi) [15; 31]; Thứ hai do hàm lượng protease này thu được chưa cao, một số nghiên cứu chỉ có thể phát hiện được bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch [37]; Thứ ba là protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ có hoạt tính khi ở dạng dimer [19; 46] Tuy rằng, một số nhà nghiên cứu đã đưa

plasmid pLysS hay pLysE vào tế bào E coli để hạn chế tính độc và dung hợp

protease với các protein khác nhằm làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng tính tan và thuận tiện cho tinh sạch cũng như đảm bảo hoạt tính [46]

Trong những năm cuối thế kỉ 20, đầu thế kỉ 21, đã có nhiều công trình nghiên cứu về biểu hiện của protease HIV-1 tái tổ hợp mang những đột biến đặc hiệu nhằm làm sáng tỏ cơ chế kháng thuốc, ái lực của protease đột biến với cơ chất, hoặc nghiên cứu phân tích cấu trúc tinh thể của các dạng protease trong phức hợp nhằm tìm ra các chất PI mới có hiệu lực cao [50]

Từ năm 2012 đến nay, những nghiên cứu về protease HIV-1 vẫn được các nhà khoa học trên thế giới cũng như các trung tâm nghiên cứu rất quan tâm Tuy nhiên, hướng nghiên cứu chủ yếu về sự khác biệt trong tính đặc hiệu của protease HIV-1 và protease HIV-2 [48] Ngoài ra, một số nghiên cứu nhằm tìm hiểu các đột biến của gen mã hóa protease HIV-1 khiến HIV-1 có thể kháng được thuốc ức chế,

từ đó tìm ra loại thuốc ức chế mới hiệu quả hơn [14]

Như vậy, các nghiên cứu về protease HIV-1 chủ yếu được biểu hiện ở vi

khuẩn E coli Trong khi, protease HIV-1 là protease của virus HIV-1 chỉ tạo ra ở tế bào sinh vật nhân chuẩn, cần có quá trình biến đổi sau dịch mã mà E coli lại không

thể đáp ứng được điều kiện này Tuy đã có một số nghiên cứu trên thế giới đã biểu

hiện thành công protease HIV-1 trên nấm men S cerevisiae Hiện tại chưa có công

bố nào về biểu hiện protease HIV-1 trên nấm men P pastoris ở Việt Nam

1.2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam

Những nghiên cứu về các enzym của HIV-1 ở Việt Nam có thể kể đến các công trình như: Phan Trọng Hoàng và tập thể (2007) đã nhân dòng và biểu hiện

được gen mã hóa tiểu đơn vị P66 của reverse transcriptase của HIV-1 ở E coli để

dùng cho các phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA và tạo bộ kit chẩn đoán nhiễm retrovirus [1]; Đồng Văn Quyền và tập thể (2008), Bạch Thị Như Quỳnh và tập thể (2011) cũng đã biểu hiện thành công 3 gen mã hóa cho các kháng nguyên GP41,

GP120 và P24 của HIV ở E coli [7; 8]

Từ năm 2003, Việt Nam đã sử dụng thuốc ức chế protease (PI) nhập nội để điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS [49] Việc tự sản xuất protease HIV-1 vẫn còn trong thời gian nghiên cứu và thử nghiệm.Các nghiên cứu chủ yếu nhằm phát hiện

HIV trong huyết thanh, xác định các nhóm virus HIV gây bệnh và các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc, hoặc phát triển kit chẩn đoán HIV ở Việt Nam [3; 6; 9] Nhằm thiết kế thuốc PI mới phù hợp với các chủng HIV lưu hành tại Việt Nam, năm 2010, các nhà khoa học của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym

và Protein, Khoa Sinh học, trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội,

do Giáo sư Phan Tuấn Nghĩa chỉ đạo, đã bắt tay vào nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu protease virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) phân lập tại Việt Nam”, nhằm

mở ra khả năng tự sản xuất PI chống HIV ở Việt Nam Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có tính hệ thống, bài bản về phân lập, nhân dòng và biểu hiện

gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp từ chủng CRF01-AE của Việt Nam trong E

coli[54] Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protease HIV-1 được thu nhận từ bệnh nhân nhiễm HIV tại Việt Nam, tác giả đã biểu hiện thành công gen mã hóa protease

HIV-1 trong E coli bằng vector pET32a, xây dựng được quy trình tinh sạch

protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ với hai bước và nghiên cứu một số tính chất của protease HIV-1 [3] Trong nghiên cứu này, tác giả cũng đã cải tiến gắn vào đầu N trình tự tự cắt là 7 axit amin của protein gag-pol và đuôi 6xHIS tại đầu C của protease HIV-1 Với cải tiến này, protease HIV-1 sau tổng hợp sẽ là chuỗi polypeptide bắt đầu bằng axit amin Pro, và đuôi 6x HIS tạo thuận lợi cho quá trình

tinh sạch Tuy nhiên, E coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào

chẳng hạn như mạng lưới nội chất và bộ máy golgi như trong sinh vật nhân chuẩn

Cho đến nay, Ở Việt nam chưa có nghiên cứu nào biểu hiện protease HIV-1

trong nấm men P pastoris để có thể so sánh và chọn ra một hệ thống tối ưu nhất

trong ứng dụng sản xuất protease HIV-1 trong nước

1.3 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P PASTORIS

Tế bào nấm men được chọn là một giải pháp tốt cho việc biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn với hướng ứng dụng vào sản xuất lớn Có hai hệ thống biểu hiện

nấm men là S cerevisiae và P pastoris Trong đó, S cerevisiae đã được nghiên cứu

biểu hiện từ những năm 1980, hệ thống này có nhược điểm như protein tạo ra có gắn đoạn oligosaccharide khá dài, từ 50-100 đường manose [37] Tuy mới được phát triển

gần đây, P pastoris đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc sản xuất protein Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về biểu hiện protein trên hệ thống P pastoris [52]

1.3.1 Đặc điểm của P pastoris

Nấm men P pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae, có khả năng sử dụng

methanol như nguồn dinh dưỡng carbon chính Tuy nhiên, nồng độ methanol không được quá nhiều và phải được điều khiển chặt chẽ để tránh tổn hại và gây độc đối với

tế bào nấm men P pastoris là sinh vật nhân chuẩn nên có nhiều ưu thế khi dùng để

biểu hiện các protein của các sinh vật nhân chuẩn, ví dụ như có quá trình gấp xếp protein và quá trình cải biến sau dịch mã

P pastoris sử dụng nguồn carbon như glucose, glycerol và methanol Nguồn

nitrogen sử dụng là nguồn hữu cơ và vô cơ như: peptone, casein, dịch chiết thịt (meat extract), dịch chiết nấm men (yeast extract) các muối ammonium muối nitrate,… Ngoài ra, nó còn sử dụng các chất khoáng như: Mn, Zn, P, S,… và các

vitamin như vitamin B12, Vì P pastoris là vi sinh vật hiếu khí, nên cần nguồn oxy

để phát triển [23]

Đặc điểm sinh hóa di truyền, P pastoris có promoter mạnh AOX (promoter

alcohol oxidase), có thể sử dụng methanol như nguồn carbon, trong môi trường không có glucose bằng cách oxy hóa methanol thành formaldehyde và hydrogen peroxide nhờ sự xúc tác của enzym alcohol oxydase (AOX) [21] Sự biểu hiện của gen mã hóa enzym AOX theo một nguyên tắc chặt chẽ: khi nấm men phát triển trên glucose hoặc ethanol thì enzym alcohol oxydase ít được biểu hiện trong tế bào Tuy nhiên, khi được nuôi cấy trên môi trường chứa methanol thì enzym này chiếm

khoảng 35% tổng protein tế bào Có hai gen alcohol oxydase là AOX1 và AOX2, các

vùng mã hóa protein của các gen này lớn tương đương nhau Khi nấm men phát triển trên glycerol thì không có các phân tử RNA thông tin của cả hai gen xuất hiện Promoter của AOX1 và AOX2 có cấu trúc tương tự nhau và cùng một vùng ức chế

để kháng lại sự biểu hiện gen [55] AOX là một promoter mạnh và hoạt động rất chặt chẽ, nó sẽ cảm ứng và điều khiển việc sản xuất các protein ngoại [16]

1.3.2 Ưu điểm của hệ thống biểu hiện P pastoris

Hệ thống tế nấm men P pastoris có hạn chế là cần thời gian biểu hiện dài (5-6 ngày), hàm lượng tiết protein không cao như ở E coli nhưng vì protease HIV-1

là một protease được tạo ra trong tế bào sinh vật nhân chuẩn nên chúng tôi chọn

chủng tế bào nấm men P pastoris với những ưu điểm sau:

Trước hết, P pastoris là một sinh vật nhân chuẩn, nên có thể cung cấp môi

trường thích hợp cho protein tái tổ hợp tiết và gấp cuộn cũng như thực hiện các cải biến sau dịch mã như tế bào động vật [41], đây là điều cần thiết để bảo đảm protease HIV-1

có hoạt tính Đặc biệt, với hệ thống P pastoris, khi protein được biểu hiện ra nếu gây

độc đối với tế bào thì protein đó vẫn được duy trì sản xuất trong tế bào [16]

Ở hệ thống biểu hiện E coli, vector mang gen mục tiêu dạng vòng sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn Nhưng trong hệ thống biểu hiện P pastoris, vector

biểu hiện mang gen mục tiêu được cắt bằng enzym giới hạn để tạo ra dạng thẳng và

dung hợp vào bộ gen của nấm men P pastoris theo con đường tái tổ hợp tương đồng tạo ra thể biến nạp ổn định [12] Hơn nữa, P pastoris có một promoter mạnh

AOX1 (lượng protein tạo ra chiếm đến 30% tổng số protein tế bào) Thành phần môi trường nôi cấy đơn giản, chất cảm ứng là methanol - rẻ tiền hơn so với chất

cảm ứng của hệ thống biểu hiện E coli Nhờ khả năng sử dụng methanol như nguồn

carbon chính nên có thể hạn chế được sự nhiễm các loài vi sinh vật khác bởi sự có mặt nhiều methanol trong môi trường nuôi cấy

Ưu điểm tiếp theo, P pastoris có thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần

so với S cerevisiae [52] P pastoris có khả năng phát triển ở pH từ 3 tới 7, do đó có

thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động của protease đối với protein tiết ra [37] Có thể biểu hiện protein với hàm lượng từ milligram tới gram cả trong nghiên cứu phòng thí nghiệm lẫn trong sản xuất quy mô công nghiệp [34]

Một ưu điểm quan trọng nữa, vector biểu hiện pPIC9 có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu được tiết ra ngoài môi trường nên dễ thu nhận hơn so với các

hệ thống biểu hiện khác, đồng thời các protein của bản thân loại nấm men này được tiết ra môi trường ở mức độ thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protease HIV-1

1.3.3 Chủng nấm men P pastoris biểu hiện protease HIV-1

Phần lớn các chủng P pastoris được sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp đều bị gây đột biến gen HIS4 và đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430

(Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL) Những chủng đột biến gen

HIS4 không có khả năng tổng hợp histidinol dehydrogenase Nên để sinh trưởng

được trên môi trường cơ bản thì cần bổ sung thêm histidine Do vậy, có mặt gen

HIS4 - của P pastoris được xem là một chỉ thị nhận biết chủng chứa vector biểu hiện sau biến nạp vì trên vector biểu hiện chứa gen HIS4 bình thường

Xét về khả năng sinh trưởng trên môi trường methanol, các chủng P pastoris

có 3 kiểu hình là Mut + , Mut s , Mut - [22; 38] Chủng có kiểu hình Mut + mang cả 2 gen

AOX1 và AOX2 có khả năng sinh trưởng mạnh trên môi trường methanol như dạng

kiểu dại và có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhờ có promoter AOX1 Các

chủng Mut - rất mẫn cảm với nồng độ methanol cao [38] Do vậy, sự thay đổi đột ngột nồng độ methanol trong môi trường nuôi cấy thường dẫn đến mất hoạt tính enzym AOX và thậm chí có thể giết chết tế bào nếu nồng độ chất này quá cao [51] Tuy nhiên, nồng độ methanol thấp quá có thể không đủ cảm ứng để bắt đầu phiên mã

[21] Còn chủng Mut s không mẫn cảm với nồng độ methanol dư thừa cao bởi chủng

này vẫn tiêu thụ methanol nhưng tốc độ thấp Có nhiều chủng P pastoris có thể được sử dụng để biểu hiện một số loại protein tiết khác nhau (Bảng 1) [27]

Bảng 1 Một số chủng P pastoris phổ biến được sử dụng để biểu hiện protein

Chủng nấm men P pastoris SMD1168 đã đƣợc chúng tôi lựa chọn và sử dụng trong biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 Ngoài gen HIS4 - , P pastoris

SMD1168 còn có gen PEP4 đã bị đột biến ở dạng PEP4 - , PEP4 là gen mã hóa cho carboxypeptidase A cần thiết cho sự kích hoạt các protease khác Cụ thể, gen PEP4

mã hóa protease A trong không bào nấm men Protease A cần thiết cho sự hoạt hóa các protease không bào khác nhƣ carboxypeptidase Y và protease B Đột biến gen

PEP4 sẽ làm giảm hoạt tính của protease A và carboxypeptidase Y và giảm mạnh

hoạt tính của protease B Nếu đột biến 2 gen PEP4 và PRB1 thì cả 3 protease sẽ giảm hoạt tính [22] Chính vì vậy, khi gen PEP4 bị bất hoạt sẽ là lợi thế lớn trong

việc hạn chế các protease vật chủ cắt protease ngoại lai trong quá trình biểu hiện

1.3.4 Vector nhân dòng và biểu hiện ở P pastoris

Có 4 loại vector biểu hiện phổ biến ở P pastoris là pHIL-D2, pPIC3.5,

pHIL-S1 và pPIC9 Vector pHIL-D2 và pPIC3.5 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein nội bào, còn pHIL-S1 và pPIC9 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tiết ngoại bào [29] Vector pPIC9 đƣợc chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này (hình 4)

Đầu 5’ promoter AOX1: nucleotide base 1-948

Vị trí mồi 5’ AOX1: nucleotide 855-875

Tín hiệu tiết (nhân tố α) (S): nucleotide 949-1218

Vị trí mồi α: nucleotide 1152-1172 Vùng đa nối: nucleotide 1192-1241

Vị trí mồi đầu 3’ AOX1: nucleotide 1327-1347 Đoạn kết thúc phiên mã 3’AOX1 (TT): nucleotide

Hình 4 Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 [29]

1.3.5 Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P pastoris

Để vector biểu hiện được tích hợp vào hệ gen P pastoris, vector biểu hiện

mang gen mục tiêu được cắt mở vòng bằng enzym giới hạn ở một vị trí đã được xác

định trước trên gen chỉ thị HIS4 hoặc trên đoạn promoter AOX1 Khi vector mở

vòng sẽ tạo thành các đầu DNA tương đồng kích thích sự tái tổ hợp của vector biểu hiện với hệ gen của nấm men, dẫn đến sự trao đổi chéo đơn và tích hợp vector vào locus tương đồng [16]

Về lý thuyết khi plasmid được chuyển vào tế bào có thể xảy ra sự sát nhập vào bộ gen của tế bào theo hai phương thức là chèn gen hoặc thay thế Việc tích hợp

được thực hiện bằng sự trao đổi chéo đơn giữa gen HIS4 trên vector và locus HIS4 của hệ gen P pastoris nhờ sự mở vòng vector biểu hiện bằng enzym giới hạn (SalI hoặc StuI) cắt trình tự tương ứng trên gen HIS4 Kết quả là promoter PAOX1 và gen

mong muốn được tích hợp vào hệ gen của P pastoris tại locus HIS4 Lúc này thể biến nạp có hiểu hình HIS4 + Kiểu hình Mut + của chủng sau khi tái tổ hợp xảy ra không bị thay đổi so với ban đầu

Hình 5 Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus his4 giữa bộ gen của tế bào

với vector biểu hiện [29]

1.3.6 Quá trình tiết protein ngoại bào ở P pastoris

Các protein sau khi được tổng hợp ra thường trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã Trong quá trình này, các protein được hoàn thiện về mặt cấu trúc, hình thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein Các protein tạo ra sau quá trình chế biến có thể được giữ lại trong tế bào chất hoặc được tiết ra

ngoài tế bào Những protein được tiết ra ngoài tế bào gọi là protein ngoại bào Ở P

pastoris, quá trình tiết của protein ngoại bào cũng đòi hỏi phải có một trình tự tiết

gồm các acid amin đặc biệt hay còn gọi là tín hiệu dẫn ở đầu tận cùng N để giúp cho protein có thể đi qua màng tế bào [34] Tùy thuộc vào tín hiệu dẫn khác nhau mà protein có thể được vận chuyển đến các bào quan khác nhau hoặc được tiết khỏi tế bào Trình tự tiết cho protein ngoại lai đã được sử dụng rất có hiệu quả trong một số vector biểu hiện, nhờ đó mà một lượng lớn protein ngoại lai đã được tiết ra ở mức

độ cao, ví dụ như tín hiệu dẫn α-MF prepro gồm khoảng 89 acid amin có nguồn gốc

từ S cerevisiae [32] Tín hiệu này giúp protein đi qua màng của mạng lưới nội chất

dễ dàng Trong khi chuyển vào lưới nội chất, trình tự tiết α-MF prepro của protein

sẽ được loại bỏ khỏi sản phẩm dịch mã sơ cấp và protein được tiết ra môi trường là các protein hoàn chỉnh Quá trình này đòi hỏi 3 loại enzym phân hủy protein là: (1) peptidase cắt 19 acid amin ở vùng pre; (2) endopeptidase được mã hóa bởi gen

KEX2 sẽ cắt acid amin Lys và Arg ở đầu tận cùng C nối giữa α-MF prepro với

protein ngoại lai; (3) enzym dipeptid amino peptidase, sản phẩm của gen STE13, sẽ

loại bỏ gốc Glu-Ala từ đầu tận cùng N của protein ngoại lai Đồng thời trong khi đi vào lưới nội chất protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác như quá trình glycosyl hóa

Sau khi được chế biến trong mạng lưới nội chất, protein sẽ được vận chuyển đến thể golgi, tại đây chúng sẽ được bao gói trong các túi tiết và dung hợp với màng

tế bào để tiết ra ngoài [4]

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Chủng vi sinh vật

- Chủng vi khuẩn E coli DH5α và chủng nấm men P pastoris SMD1168 của

hãng Invitrogen

2.1.2 Các hóa chất, nguyên liệu khác

- Đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector nhân dòng pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể, 2012

- Plasmid pPIC9 và kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pCR2.1 TA cloning từ

hãng Invitrogen:

- Enzym giới hạn, nHOT Taq DNA polymerase, hỗn hợp dNTP và Kit PCR từ hãng

Enzynomics

- Thang chuẩn DNA và protein được mua từ hãng Fermentas

- Kit tách và tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E coli từ hãng Bioneer và Qiagen

- Các hóa chất dùng trong phương pháp nhiệt biến nạp vào E coli

- Thành phần các hóa chất trong điện biến nạp vào P pastoris

- Thành phần hóa chất dùng trong phương pháp điện di SDS-PAGE

- Thành phần các hóa chất dùng trong phương pháp lai Western blot

+ Dung dịch chuyển màng

+ Phosphate buffer saline (PBS) 1lit – 10X

Tất cả hòa tan trong 800ml nước cất, sau đó thêm nước dẫn đến thể tích 1lit + Tween PBS (0.1% Tween)

+ Dung dịch đệm Alkaline phosphatase (AP)

- Thành phần các loại môi trường:

+ Thành phần môi trường LB: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, nước cất + Thành phần môi trường LB rắn: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, 1.5% agar + Thành phần môi trường BMGY: 1% cao nấm men, 2% peptone, 1.34% yeast nitrogen base, 4x10-5 biotin, 1% glycerol, pH 6.0

+ Môi trường MM: 10%YNB; 1% methanol; 1.10-5% biotin

+ Môi trường MD: 1,34 % YNB; 4.10-5% biotin; 2% glucose

Các hóa chất trên và một số hóa chất khác đều có độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử

- Dụng cụ:

+ Bộ pipetman 10, 20, 200, 1000 µl và đầu tip tương ứng Các ống eppendorf 0.2ml

và 1.5ml, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon

- Thiết bị

Bộ điện di đứng (Biorad), máy chuyển màng khô (Biorad), máy ly tâm lạnh

5417 R (Eppendorf), máy PCR gradient của hãng Kyratec, thiết bị điện di ngang và

hệ thống chụp ảnh điện di Geldox (Biorad), tủ an toàn sinh học cấp II (Labtech)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR

Nguyên lý phản ứng PCR:

PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự

xúc tác của enzym DNA polymerase cùng với sự có mặt của mồi và nguyên liệu dNTPs Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (25-40 lần) gồm biến tính DNA tại 95oC (DNA sợi đôi thành sợi đơn), hạ nhiệt xuống 37–

65oC (mồi bắt cặp với sợi đơn tương ứng) và kéo dài chuỗi ở khoảng 72oC (tổng hợp chuỗi DNA) Nhờ vậy, 1 phân tử DNA sợi đôi, sau n chu kỳ phản ứng, sẽ thành

2n phận tử