Các chủng nấm men P. Pastoris SMD1168 nuôi cấy trên đĩa MD, sau khi
khẳng định sự có mặt của vector tái tổ hợp pPIC9-Prot và pPIC9 trong hệ gen của
nấm men bằng PCR. Chúng tôi chuyển các chủng P. pastoris SMD1168 mang
plasmid pPIC9 và pPIC9-Prot sang môi trƣờng BMGY và nuôi cấy song song đến OD600 đạt khoảng 6 -7. Sau đó, các chủng SMD1168 này đƣợc chuyển sang môi trƣờng MM có methanol 0,5%. Methanol đƣợc thêm vào sau mỗi 24 giờ nuôi cấy
để cảm ứng biểu hiện protease HIV-1. Điều kiện nuôi lắc là nhiệt độ 30oC, trong 100 giờ ở tốc độ lắc 200 vòng/phút. Dịch môi trƣờng nuôi cấy đƣợc thu nhận ở các thời điểm 24 h, 48 h, 72 h và 96 h trƣớc mỗi lần bổ sung methanol. Sau khi thu dịch môi trƣờng, chúng tôi tiến hành ly tâm ở 5000 vòng / 1 phút để loại tế bào rồi chuyển dịch môi trƣờng sang ống mới. Dịch môi trƣờng đƣợc tủa bằng cách thêm vào 5 ml ethanol nồng độ 100% rồi ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 3 phút để thu dịch tủa. Sau khi loại dịch nổi và để khô tủa bằng cách để bay hơi ethanol (ống mở nắp qua đêm), chúng tôi sử dụng đệm tra mẫu (chứa SDS, urea) để hồi tính và hòa tủa rồi chạy điện di trên gel acrylamide (SDS-PAGE).
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR
Dựa vào trình tự đã biết của đoạn gen mã hóa protease HIV-1, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi (bảng 2) để sử dụng cho quá trình nhân bản đoạn gen này bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR dự kiến là một đoạn DNA có kích thƣớc 364 bp với các thành phần là: (EcoRI)_ TT tự cắt_ gen mã hóa protease HIV-1 _ TT mã hóa HA_(NotI), gọi tắt là cấu trúc Prot có trình tự theo lý thuyết nhƣ sau:
5’GACTGAATTCGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAACGACC
CCTTGTCACAATAAAAATAGAAGGACAGCTGAAAGAAGCTCTATTAGATACAG GAGCAGATGATACAGTATTAGAAGATATAAATTTGCCAGGAAAATGGAAACC AAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAGGTAAGGCAATATGATCAG ATACTTATAGAAATTTGTGGAAAAAAGGCTATAGGTACAGTGCTAGTAGGACC TACACCGATCAACATAATTGGACGAAATATGTTGACTCAGATTGGCTGCACTTT AAATTTTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAGGCGGCCGCGGAT-3’
Cấu trúc Prot theo lý thuyết có các thành phần cụ thể:
- Đầu tiên từ đầu 5’: Là vị trí nhận biết của enzym giới hạn EcoR I (trình tự đã bôi đen).
- Thứ hai là trình tự tự cắt: bao gồm 6 codon mã hóa cho 6 axit amin lần lƣợt là: Prolin- Valin- Serin- Phenylalanin- Asparagin- Phenylalanin (trình tự đã đƣợc gạch chân).
- Thứ ba là gen mã hóa protease HIV-1 có chiều dài 297 nucleotide mã hóa cho một
monomer bao gồm 99 axit amin. Trong trình tự gen mã hóa protease HIV-1 có trình tự mã hóa cho vị trí cắt của tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc in đậm nghiêng).
- Thứ tƣ là trình tự mã hóa cho một đoạn peptide là epitope của kháng nguyên vỏ
hemagglutinin (HA - phần trình tự in nghiêng đầu 3'). Trình tự này có ý nghĩa trong công đoạn tinh sạch protease HIV-1.
Vector nhân dòng pCR21 mang gen [3] đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng
PCR gồm 35 chu kỳ phản ứng: 950C - 30 giây để biến tính DNA, 530C - 1 phút cho
gắn mồi và 720C - 30 giây để kéo dài chuỗi.
Ngoài ra, để xác định khoảng nhiệt độ gắn mồi tối ƣu, chúng tôi đã tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR với các chu trình nhiệt khác nhau ở nhiệt độ gắn mồi.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% để kiểm tra sự nhân lên đặc hiệu của cặp mồi với đoạn gen (Hình 6).
Hình 6. Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR
Giếng 1: Thang chuẩn DNA 100 bp
Giếng 2: Sản phẩm PCR cấu trúc Prot với nhiệt độ gắn mồi: 500C Giếng 3: Sản phẩm PCR cấu trúc Prot với nhiệt độ gắn mồi: 530 C Giếng 4: Sản phẩm PCR cấu trúc Prot với nhiệt độ gắn mồi: 570 C.
Theo kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, cặp mồi chúng tôi thiết kế đã nhân bản đƣợc đoạn DNA có băng kích thƣớc khoảng 360 bp. Theo kết quả tính toán trên lý thuyết, đoạn DNA đƣợc nhân lên sẽ có kích thƣớc khoảng 364 bp phù hợp với kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 6). Ngoài ra, ở ba mức nhiệt gắn mồi
cho băng rõ ràng, sáng nét và ở cùng kích thƣớc phù hợp với lý thuyết. Tuy nhiên, ở
mức nhiệt 50oC và 53oC, hiệu quả gắn mồi với đoạn gen cao hơn ở mức nhiệt 57 oC.
Dựa vào kết quả này, chúng tôi đã xác định đƣợc khoảng nhiệt độ thích hợp cho cặp
mồi đƣợc thiết kế trong việc nhân bản đoạn gen nghiên cứu là 50 - 53oC.
3.1.2. Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E. coli
Để chuẩn bị cho công đoạn tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1. Chúng tôi đã tiến hành biến nạp plasmid pPIC9 vào tế bào khả biến
E. coli DH5α bằng sốc nhiệt, sau đó cấy trải sản phẩm biến nạp trên đĩa LB đặc có
chứa Amp. Theo lý thuyết, chỉ có tế bào E. coli chứa pPIC9 mang gen kháng Amp mới có thể phát triển trên môi trƣờng chứa Amp. Trên đĩa LB nuôi cấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc, chúng tôi lấy ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc và tách chiết plasmid trong các khuẩn lạc này theo công thức Alkaline Lysis và SDS của Birnboim & Doly. Sản
phẩm tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 7).
Hình 7. Điện di sản phẩm tách chiết plasmid
Giếng 1: Thang DNA chuẩn 1 kb
Kết quả điện di trên hình 7 cho thấy các plasmid đƣợc tách chiết từ các khuẩn lạc (các giếng 2 - 5) khác nhau đều cho băng DNA sáng, rõ, có độ sạch cao và cùng ở một băng kích thƣớc. Nhƣ vậy, các plasmid pPIC9 đã đƣợc tinh sạch đạt tiêu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.3. Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn
Sau khi plasmid pPIC9 và sản phẩm PCR đã đƣợc tinh sạch, để chuẩn bị cho việc chèn đoạn gen nghiên cứu vào vector nhân dòng, chúng tôi tiến hành dùng các enzym giới hạn EcoRI và NotI để cắt mở vòng plasmid. Plasmid pPIC9 sau khi cắt bằng cặp enzym giới hạn đƣợc tinh sạch bằng bộ kit của Qiagen nhằm thu đƣợc đúng một băng pPIC9 mở vòng, sạch, làm nguyên liệu cho phản ứng gắn. Kết quả cắt plasmid bằng enzym giới hạn đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 8A - giếng 3) cho thấy, thu đƣợc băng DNA kích thƣớc khoảng 7,9 kb nhƣ tính toán lý thuyết bằng kích thƣớc của plasmid trừ đi trình tự giữa EcoRI và NotI bị cắt đi.
(A) (B)
Hình 8. Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid (A) và sản phẩm PCR (B) bằng các enzym giới hạn NotI và EcoRI
(8A): Giếng 1: Thang DNA 1 kb, Giếng 2: pPIC9 không cắt, Giếng 3: pPIC9 sau cắt (8B): Giếng 1: Thang DNA 100bp, Giếng 2: Sản phẩm PCR sau cắt
Để tạo sự tƣơng đồng ở hai đầu với pPIC9, gen mã hóa protease HIV-1 cũng
đƣợc xử lý cắt bằng hai enzym EcoRI và NotI, kết quả điện di trên gel agarose 1%
đã thu nhận đƣợc băng kích thƣớc khoảng 360 bp (Hình 8B- giếng 2). Theo tính toán lý thuyết, sau khi cắt bằng hai enzym trên thì đoạn DNA mang gen mã hóa
protease HIV-1 sẽ có kích thƣớc là 356 bp (bằng kích thƣớc gen mã hóa protease
HIV-1 sau khi nhân bản trừ đi 4 bp trên mỗi đầu 3' và 5').
3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản ứng ligase ứng ligase
Sau khi cắt mở vòng plasmid và đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng cùng một cặp enzym giới hạn để chuẩn bị cho phản ứng ligase. Phản ứng chèn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào plasmid pPIC9 đƣợc thực hiện nhờ đến enzym T4 DNA ligase, hỗn hợp phản ứng ligase đƣợc ủ qua đêm. Chúng tôi tiến hành biến nạp sốc nhiệt vector tái tổ hợp pPIC9 (sản phẩm ligase) chứa gen mã hóa protease HIV-1 vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α ngay sau khi phản ứng ligase kết thúc. Sản phẩm biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa LB đặc có Amp. Trên pPIC9 có gen kháng Amp nên chỉ có những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp chứa gen kháng Amp mới có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trƣờng LB có chứa Amp (50 µg/ml).
Kết quả biến nạp thu nhận đƣợc đĩa thạch có một số khuẩn lạc trắng. Chúng tôi chọn ngẫu nhiên hai khuẩn lạc và tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi Prot-F và AOX1-R (cặp mồi 2 - bảng 2). Mồi Prot sẽ xác định đƣợc sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1, còn mồi AOX1-R có thể xác định gen mã hóa protease HIV-1 đã đƣợc chèn đúng chiều vào pPIC9. Theo tính toán, nếu gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc chèn đúng chiều vào pPIC9, đoạn DNA đƣợc nhân lên sẽ có chiều dài khoảng 440 bp (bằng 44 bp trình tự mồi Prot-F+ 356 bp của gen Prot + 85 bp trình tự trên pPIC9). Ngƣợc lại, nếu đoạn gen này không đƣợc chèn đúng chiều, sản phẩm PCR sẽ không lên băng.
1 2 3
Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli DH5α
Giếng 1: Thang DNA 100bp;
Giếng 2, 3: Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc mang pPIC9-Prot
Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc (Hình 9) cho thấy các khuẩn lạc đều lên băng có kích thƣớc khoảng 440 tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn DNA chứa gen mã hóa protease HIV-1 nhƣ tính toán lý thuyết. Chứng tỏ, chúng tôi đã tạo thành công vector pPIC9 tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 (kí hiệu là pPIC9-Prot). Gen mã hóa protease HIV-1 đã đƣợc chèn đúng chiều và đƣợc nhân lên trong tế bào chủ E. coli DH5α. Để khẳng định này thêm chắc chắn, chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự đối với các khuẩn lạc thu đƣợc ở trên.
3.1.5. Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 trong vector biểu hiện pPIC9
Nhằm xác định chính xác việc cài đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào pPIC9 đúng vị trí và đúng chiều hay chƣa, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật giải trình tự. Trƣớc tiên, hai khuẩn lạc trắng bƣớc đầu đã đƣợc khẳng định mang pPIC9-
đã tinh sạch (kí hiệu là pPIC9-Prot 1 và pPIC9 - Prot 2) đƣợc pha loãng ở nồng độ
thích hợp (khoảng 50 - 100 ng/µl) và gửi đến Hàn Quốc để giải trình tự.
Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết
Kết quả giải trình tự đƣợc so sánh với cấu trúc thiết kế dự tính theo lý thuyết (trên hình 10) cho thấy cấu trúc Prot1 có trình tự trùng khớp với cấu trúc Prot lý thuyết. Khuẩn lạc mang cấu trúc Prot2 bị đột biến mất nucleotide ở vị trí bộ ba mã hóa cho axit amin thứ 6 và đột biến thay thế ở hai vị trí của hai bộ ba mã hóa axit amin thứ 44 và 58,trong 99 axit amin của protease HIV-1. Các đột biến mất và thay thế này đã dẫn đến sự biến đổi về trình tự chuỗi polypeptide, cụ thể đột biến mất ở codon 6 khiến cho axit amin này không đƣợc tổng hợp và làm dịch chuyển khung đọc dẫn đến sản phẩm protein đƣợc dịch mã sai, tức là chuỗi polypeptide đƣợc tổng hợp ra không phải là protease HIV-1. Khi đã bị đột biến mất nucleotide ở codon 6, có thể không cần xét đến đột biến ở codon 44 và 58 nữa. Tuy nhiên, nếu đột biến ở
codon 6 không xảy ra, sự biến đổi của codon 44 và 58 dẫn đến axit amin đƣợc hình thành lần lƣợt là Ser (Serin) và Arg (Arginin) khác với các axit amin trong protease HIV-1 là Prolin và glutamic. Theo cấu trúc của protease HIV-1, hai axit amin này nằm trong vùng mũ. Mặc dù chƣa xác định ảnh hƣởng cụ thể của đột biến này, nhƣng theo kết quả của một số nghiên cứu, đột biến xuất hiện ở vùng mũ có thể làm giảm mạnh hoạt tính của protease HIV-1 [47]. Những đột biến xảy ra ở trên có thể là đột biến ngẫu nhiên do sự sai sót của enzym DNA Taq polymerase.
Vì lý do trên, để nâng cao hiệu quả biểu hiện chúng tôi chỉ chọn CT-Prot1 của khuẩn lạc mang cấu trúc Prot để tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protease
HIV-1 ở P. pastoris. Nhƣ vậy, chúng tôi đã nhân dòng đƣợc gen mã hóa protease
HIV-1 vào vector pPIC9.
3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN
P. PASTORIS
3.2.1. Tạo dòng nấm men P. pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 hóa protease HIV-1
Trên plasmid pPIC9 có chứa gen HIS4 mã hóa protein histidinol
dehydrogenase, HIS4 ORF ở vị trí base 4514 - 1980, trong khoảng này lại có một vị trí nhận biết duy nhất của enzym giới hạn SalI tại base 3177. Chính vì vậy, vector tái tổ hợp pPIC9 mang gen mã hóa protease HIV-1 đã qua kiểm tra đƣợc xử lý bằng
enzym cắt giới hạn SalI để tăng khả năng trao đổi chéo giữa plasmid và vùng HIS4-
trên hệ gen của tế bào nấm men, cũng nhƣ để tạo đƣợc chủng P. pastoris tái tổ hợp
dạng Mut+. Vector pPIC9-Prot đã đƣợc cắt mở vòng thành dạng thẳng đƣợc định
hƣớng trao đổi chéo và cài toàn bộ cấu trúc biểu hiện gen ngoại lai vào vùng gen
HIS4 trong hệ gen tế bào P. pastoris SMD1168 bằng phƣơng pháp điện biến nạp. Vì thế, cấu trúc gen AOX1 trong hệ gen đƣợc bảo toàn để sản xuất enzym alcohol oxidase chuyển hóa nguồn methanol nhƣ nguồn carbon cho nấm men sinh trƣởng. Nhờ vậy, gen mã hóa protease HIV-1 từ plasmid đƣợc chuyển vào và tồn tại ổn định trong bộ gen của tế bào. Song song với việc chuyển vector tái tổ hợp pPIC9- Prot vào chủng nấm men SMD1168, chúng tôi cũng tiến hành cài plasmid pPIC9
nhằm xác định xem sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 ảnh hƣởng thế nào đến sinh trƣởng của chủng nấm men SMD1168.
Sản phẩm biến nạp sau đó đƣợc cấy trải trên môi trƣờng MD (khuyết dƣỡng histidin) trong 3 ngày. Nhiệt độ tăng sinh cho nấm men là 30oC. Kết quả là các khuẩn lạc nấm men đã mọc đều, có màu trắng và tách biệt với nhau (Hình 11).
Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris SMD1168
(11A) Sản phẩm biến nạp pPIC9 vào nấm men P. pastoris SMD1168; (11B) Sản phẩm biến nạp pPIC9-Prot vào nấm men P. pastoris SMD1168
Với sự có mặt của gen HIS4 trên pPIC9 thì chỉ những tế bào nấm men có
mang vector này mới có khả năng mọc trên môi trƣờng khuyết dƣỡng histidine. Những khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng MD chứng tỏ chúng có chứa plasmid pPIC9 nên mới có khả năng tổng hợp histidine. Cả hai đĩa nuôi cấy đều xuất hiện các khuẩn lạc trắng vì cùng có mặt pPIC9 trong tế bào. Nhƣ vậy chúng tôi đã biến nạp thành công pPIC9 và vector pPIC9-Prot vào tế bào chủng nấm men P. pastoris
SMD1168.
Về lý thuyết khi plasmid đƣợc chuyển vào tế bào có thể xảy ra sự sát nhập vào bộ gen của tế bào theo hai phƣơng thức là chèn gen hoặc thay thế gen. Để kiểm tra phƣơng thức sát nhập của vector tái tổ hợp vào hệ gen của nấm men, chiều và vị trí chèn gen, chúng tôi đã chọn ngẫu nhiên mỗi đĩa nuôi cấy một khuẩn lạc và tiến
hành kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi số 3 (bảng 2). Theo Kit biểu hiện trên P. pastoris của hãng Invitrogen, sản phẩm PCR của vector pPIC9 khi sử dụng cặp mồi 5’AOX1 sẽ cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 500 bp [29]. Nhƣ vậy, với các khuẩn lạc mang vector pPIC9-Prot, sản phẩm PCR sẽ cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 850 bp (500 bp trình tự trên vector + 356 bp trình tự gen mã hóa
protease HIV-1). Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 12).
Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men
Giếng 1: Thang DNA 1kb; Giếng 2: Đối chứng âm với khuôn là H20 Giếng 3: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9 ; Giếng 4: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9-Prot
Kết quả ở hình 12 cho thấy, sản phẩm PCR từ khuẩn lạc nấm men P. pastoris