Các protein sau khi đƣợc tổng hợp ra thƣờng trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã. Trong quá trình này, các protein đƣợc hoàn thiện về mặt cấu trúc, hình thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein. Các protein tạo ra sau quá trình chế biến có thể đƣợc giữ lại trong tế bào chất hoặc đƣợc tiết ra ngoài tế bào. Những protein đƣợc tiết ra ngoài tế bào gọi là protein ngoại bào. Ở P.
pastoris, quá trình tiết của protein ngoại bào cũng đòi hỏi phải có một trình tự tiết gồm các acid amin đặc biệt hay còn gọi là tín hiệu dẫn ở đầu tận cùng N để giúp cho protein có thể đi qua màng tế bào [34]. Tùy thuộc vào tín hiệu dẫn khác nhau mà protein có thể đƣợc vận chuyển đến các bào quan khác nhau hoặc đƣợc tiết khỏi tế bào. Trình tự tiết cho protein ngoại lai đã đƣợc sử dụng rất có hiệu quả trong một số vector biểu hiện, nhờ đó mà một lƣợng lớn protein ngoại lai đã đƣợc tiết ra ở mức độ cao, ví dụ nhƣ tín hiệu dẫn α-MF prepro gồm khoảng 89 acid amin có nguồn gốc từ S. cerevisiae [32]. Tín hiệu này giúp protein đi qua màng của mạng lƣới nội chất dễ dàng. Trong khi chuyển vào lƣới nội chất, trình tự tiết α-MF prepro của protein sẽ đƣợc loại bỏ khỏi sản phẩm dịch mã sơ cấp và protein đƣợc tiết ra môi trƣờng là các protein hoàn chỉnh. Quá trình này đòi hỏi 3 loại enzym phân hủy protein là: (1) peptidase cắt 19 acid amin ở vùng pre; (2) endopeptidase đƣợc mã hóa bởi gen
KEX2 sẽ cắt acid amin Lys và Arg ở đầu tận cùng C nối giữa α-MF prepro với
protein ngoại lai; (3) enzym dipeptid amino peptidase, sản phẩm của gen STE13, sẽ loại bỏ gốc Glu-Ala từ đầu tận cùng N của protein ngoại lai. Đồng thời trong khi đi vào lƣới nội chất protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác nhƣ quá trình glycosyl hóa.
Sau khi đƣợc chế biến trong mạng lƣới nội chất, protein sẽ đƣợc vận chuyển đến thể golgi, tại đây chúng sẽ đƣợc bao gói trong các túi tiết và dung hợp với màng tế bào để tiết ra ngoài [4].
Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Chủng vi sinh vật
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α và chủng nấm men P. pastoris SMD1168 của hãng Invitrogen.
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác
- Đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector nhân dòng pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể, 2012.
- Plasmid pPIC9 và kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pCR2.1 TA cloning từ
hãng Invitrogen:
- Enzym giới hạn, nHOT Taq DNA polymerase, hỗn hợp dNTP vàKit PCR từ hãng
Enzynomics
- Thang chuẩn DNA và protein đƣợc mua từ hãng Fermentas.
- Kit tách và tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli từ hãng Bioneer và Qiagen - Các hóa chất dùng trong phƣơng pháp nhiệt biến nạp vào E. coli
- Thành phần các hóa chất trong điện biến nạp vào P. pastoris - Thành phần hóa chất dùng trong phƣơng pháp điện di SDS-PAGE - Thành phần các hóa chất dùng trong phƣơng pháp lai Western blot
+ Dung dịch chuyển màng
+ Phosphate buffer saline (PBS) 1lit – 10X
Tất cả hòa tan trong 800ml nƣớc cất, sau đó thêm nƣớc dẫn đến thể tích 1lit + Tween PBS (0.1% Tween)
+ Dung dịch đệm Alkaline phosphatase (AP) + Dung dịch BCIP
+ Dung dịch NBT
+ Dung dịch hiện màu: 10ml dung dịch đệm Alkaline phosphatase + 66µl dung dịch NBT + 33µl dung dịch BCIP
- Thành phần các loại môi trƣờng:
+ Thành phần môi trƣờng LB: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, nƣớc cất + Thành phần môi trƣờng LB rắn: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, 1.5% agar + Thành phần môi trƣờng BMGY: 1% cao nấm men, 2% peptone, 1.34% yeast nitrogen base, 4x10-5 biotin, 1% glycerol, pH 6.0
+ Môi trƣờng MM: 10%YNB; 1% methanol; 1.10-5% biotin
+ Môi trƣờng MD: 1,34 % YNB; 4.10-5% biotin; 2% glucose
Các hóa chất trên và một số hóa chất khác đều có độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.
- Dụng cụ:
+ Bộ pipetman 10, 20, 200, 1000 µl và đầu tip tƣơng ứng. Các ống eppendorf 0.2ml và 1.5ml, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon
- Thiết bị
Bộ điện di đứng (Biorad), máy chuyển màng khô (Biorad), máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), máy PCR gradient của hãng Kyratec, thiết bị điện di ngang và hệ thống chụp ảnh điện di Geldox (Biorad), tủ an toàn sinh học cấp II (Labtech).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR
Nguyên lý phản ứng PCR:
PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzym DNA polymerase cùng với sự có mặt của mồi và nguyên liệu dNTPs. Sự khuếch đại này đƣợc thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (25-40
lần) gồm biến tính DNA tại 95oC (DNA sợi đôi thành sợi đơn), hạ nhiệt xuống 37–
65oC (mồi bắt cặp với sợi đơn tƣơng ứng) và kéo dài chuỗi ở khoảng 72oC (tổng
hợp chuỗi DNA). Nhờ vậy, 1 phân tử DNA sợi đôi, sau n chu kỳ phản ứng, sẽ thành 2n phận tử.
Trong nghiên cứu này, để thuận lợi cho bƣớc chèn đoạn gen vào vị trí vùng tạo dòng cũng nhƣ biểu hiện gen nên mồi cho phản ứng PCR đƣợc thiết kế có thêm trình tự nhận biết của các enzym giới hạn và trình tự qui định các axit amin đặc hiệu (tag để sử dụng cho bƣớc tinh sạch). Ngoài ra, dựa theo một số nghiên cứu của các tác giả, trong qúa trình biểu hiện, protease HIV-1 sẽ cắt protein gag - pol tại những vị trí đặc hiệu và giải phóng ra dạng protease có hoạt tính [18; 46]. Hơn nữa, sự mở đầu bằng axit amin Prolin (P) tại đầu N của protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong hình thành cấu trúc homodimer và quyết định hoạt tính của protease HIV-1. Một số nghiên cứu cũng đã biểu hiện protease HIV-1 thành công khi chèn thêm trình tự tự cắt của enzym tại đầu N [3]. Vì thế, chúng tôi kế thừa kết quả trƣớc, cũng chèn thêm trình tự tự cắt trên mồi. Trình tự tự cắt đƣợc chọn là 18 nucleotide TTCGTATCCTTTAACTTC mã hóa cho 6 axit amin FVSFNF ở đầu C của protein gag. Khi protease đƣợc tạo ra nếu có hoạt tính tự cắt thì sẽ giải phóng ra dạng protease mở đầu bằng Pro. Trình tự các mồi cũng nhƣ mục đích sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR Tên Trình tự Mục đích Cặp mồi 1 Prot-F1 (44 bp) 5’GACTGAATTCGTATCCTTTAACTTC
CCTCAGATCACTCTTTGGC-3’ (EcoRI) Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 từ plasmid pCR2.1 (Thiết kế) Prot-R1 (64 bp) 5’GGATGCGGCCGCCTAAGCGTAATC TGGAACATCGTATGGGTAAAAATTTA AA GTGCAGCCAATC-3’(NotI) Cặp mồi 2 Prot-F1 (44 bp) 5’GACTGAATTCGTATCCTTTAACTTC CCTCAGATCACTCTTTGGC-3’ (EcoRI)
Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 từ khuẩn lạc E. coli tái tổ hợp AOX1-R 5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’ Cặp mồi 3 AOX1-F (20 bp)
5’GACTGGTTCCAATTGACAAC 3’ Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 từ khuẩn lạc P. pastoris
- Thành phần của một phản ứng 25 µl PCR (bảng 3)
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)
Đệm nHOT Taq DNA polymerase 10X 2,5
dNTPs 2 mM 2,5
Mồi xuôi 1
Mồi ngƣợc 1
DNA khuôn (15 ng/µl) 1
nHOT-Taq DNA polymerase 1
Nƣớc khử ion khử trùng 16
Tổng 25
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 từ plasmid pCR2.1: - 94oC – 4 phút - 95oC – 30 giây - 50 - 57oC – 1 phút 35 chu kỳ - 72oC – 30 giây - 72oC – 7 phút - Giữ ở 4oC
Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% - 1,2%. Sau khi kiểm tra sự nhân lên đặc hiệu đoạn gen với kích thƣớc mong muốn, sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng Kit tinh sạch PCR của Bioneer.
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý điện di DNA
Các phân tử DNA (tích điện âm) dƣới tác dụng của điện trƣờng sẽ di chuyển trong gel từ cực âm sang cực dƣơng. Tốc độ di chuyển trên mạng lƣới gel trong điện trƣờng của DNA phụ thuộc vào kích thƣớc, điện tích, mức độ cuộn xoắn, cấu trúc phân tử. Đoạn DNA có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn đoạn DNA có
kích thƣớc nhỏ hơn và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy.
Quy trình điện di:
- Chuẩn bị gel agarose 1%: hòa tan 1 gram agarose vào 100ml dung dịch
TBE 1X, đun sôi cho dung dịch tan hoàn toàn. Để nhiệt độ xuống khoảng 50 – 600
C, đổ dung dịch agarose vào khay điện di, cài lƣợc thích hợp. Sau 20- 40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lƣợc ra và đặt vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X ngập gel, cách mặt gel khoảng 0,5 cm.
- Mẫu DNA đƣợc trộn với loading dye (đã pha với ethidium bromide) theo tỷ lệ mẫu và loading dye là 5:1, mẫu đƣợc tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế thích hợp ở 100 V trong 30 phút.
- Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio- Rad với tia UV có bƣớc sóng 320nm.
2.2.3. Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện
2.2.3.1. Cắt mở vòng vector và sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc kiểm tra sự nhân lên chính xác sẽ đƣợc xử lý với cặp enzym giới hạn có trình tự cắt đặc hiệu đã thiết kế trên cặp mồi số 1 (Bảng 2) để tạo các đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời vector biểu hiện pPIC9 đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzym giới hạn với sản phẩm PCR để tạo đầu tƣơng thích tƣơng ứng và cố định chiều của đoạn DNA đƣa vào vector biểu hiện. Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với 20 µl tổng thể tích (bảng 4).
Bảng 4. Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn
Thành phần EcoRI NotI SalI
DNA (2 µg/ µl) 5 µl 5 µl 5µl Đệm của enzym 10X 2 µl 2 µl 2µl BSA 10X 0 µl 2 µl 0µl Enzym (RE) 0,5 µl 1 µl 0,5µl H2O 12,5 µl 10 µl 12,5µl Tổng 20 µl 20 µl 20 µl
Hỗn hợp phản ứng đƣợc vortex và ly tâm nhẹ rồi ủ ở 37 oC trong 2 giờ hoặc qua đêm, sau đó đƣợc kiểm tra trên gel agarose.
2.2.3.2. Tinh sạch sản phẩm cắt enzym giới hạn bằng kít thôi gel của Bioneer
Sau khi cắt bằng enzym giới hạn, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện đang ở dạng mạch hở đƣợc tinh sạch bằng kit thôi gel của Bioneer nhằm loại bỏ các trình tự DNA không mong muốn và tăng nồng độ, chuẩn bị cho phản ứng gắn. Theo qui trình của Bioneer, trƣớc tiên sản phẩm cắt enzym giới hạn đƣợc chạy trên gel agarose 1% để phân tách các băng. Sau đó bản gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng UV, phần gel chứa đoạn DNA với kích thƣớc phù hợp với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 (khoảng 360 bp) và vector biểu hiện dạng mạch hở đƣợc cắt và chuyển vào ống eppedorf 2 ml. Bổ sung năm lần thể tích của đệm GB (Gel Binding Buffer) vào một thể tích của miếng gel đã cắt. Hỗn
hợp đệm và gel đƣợc ủ ở 60oC trong bể ổn nhiệt khoảng 10 phút để tan hết gel.
Sau đó hỗn hợp đƣợc đƣa lên cột thôi gel, cột này sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ
13.000 vòng/phút trong 1 phút, 4oC. Phần dịch dƣới cột bị đổ bỏ và cột đƣợc rửa 2
lần bằng 500 µl đệm rửa WB (Washing buffer), kèm theo ly tâm mỗi lần với cùng điều kiện. DNA gắn trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 30-50 µl đệm EB (Elution Buffer). Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút, cột đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, nhiệt độ phòng. DNA trong dịch sau ly tâm đƣợc
giữ ở -20oC cho đến khi đƣợc dùng.
2.2.3.3. Gắn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện
Đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện sẽ đƣợc gắn với nhau sau khi đã tinh sạch, việc gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector nhờ sự hoạt động của enzym nối T4 DNA ligase. Phản ứng nối ghép đƣợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng là 10 µl, thành phần phản ứng nhƣ sau: 2 µl vector; 6 µl sản phẩm PCR; 1µl đệm T4 DNA ligase 10X; 1 µl T4 DNA ligase
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC qua đêm và đƣợc biến nạp vào tế bào khả
2.2.3.4. Biến nạp vector bằng phương pháp sốc nhiệt
Năm 1928, Griffith phát hiện hiện tƣợng biến nạp (transformation) ở vi
khuẩn Diplococus pneumoniae (nay gọi là Streptococus pneumoniae). Năm 1944,
T.Avery, Mc Leod và Mc Carty đã xác định rõ DNA là tác nhân chuyển thông tin di truyền trong quá trình biến nạp [2].
Nguyên lý:
Tế bào E. coli khi đƣợc xử lý bằng các cation nhƣ calcium, magnesium,
rubidium hay hexamine cobalt sẽ bị thay đổi tính thấm của màng, do đó sẽ cho phép DNA đi vào tế bào vi khuẩn E. coli. Việc xử lý các cation cho phép làm trung hòa điện tích âm của màng ngoài tế bào, cho phép DNA cũng tích điện tích âm đi xuyên qua lớp vỏ tế bào để đi vào bên trong. Tế bào sau khi bổ sung DNA đƣợc đặt trên đá
để làm ổn định sự tƣơng tác giữa ion Ca2+ và các cấu trúc tích điện âm của màng
DNA. Hỗn hợp này sau đó đƣợc đƣa vào bể ổn nhiệt 42oC trong khoảng thời gian
rất ngắn để làm thay đổi tính lƣu động của trạng thái bán tinh thể của màng tế bào, qua đó cho phép các phân tử DNA đi vào trong tế bào qua các kênh vận chuyển.
Các bước thực hiện:
Trƣớc tiên, cần chuẩn bị sẵn tế bào khả biến E. coli chủng DH5α và bảo
quản ở -800C. Các tế bào khả biến này đƣợc lấy ra để trên đá 10 phút cho tan dần.
Hỗn hợp phản ứng gắn DNA đƣợc bổ sung vào, trộn đều và để lại ngay trên đá trong 20 - 30 phút, tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó hỗn hợp
đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút để ổn định
tế bào. Bổ sung 300-500 µl môi trƣờng LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó
đƣợc giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37oC trong
50 phút. 100 µl hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa petri LB đặc có bổ sung
kháng sinh ampicllin nồng độ 100 µg/ml và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm.
2.2.4. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid
Trong nghiên cứu này, DNA plasmid đƣợc tinh sạch theo công thức của Birnboim & Doly (1979), sử dụng 3 loại đệm: đệm Bib-Do 1 (25 mM Tris pH 8, 10
mM EDTA, 50 mM Glucose); đệm Bib-Do 2 (0.2 N NaOH, 1 % SDS) và đệm Bib- Do 3 (3 M potassium acetate, 11.5 % axit acetic pH 5.2).
Quy trình thực hiện như sau:
Khuẩn lạc (E. coli) đƣợc cấy vào 4 ml LB lỏng có bổ sung Amp 100 g/ml
và đƣợc nuôi lắc ở 37oC khoảng 200 vòng/phút trong 14-16 giờ. Dịch nuôi cấy
đƣợc ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút, 4 oC để thu tế bào. Sau khi
loại bỏ hoàn toàn dịch nổi, cặn tế bào đƣợc hoà trở lại trong 200 l đệm Bib-Do 1
đã đƣợc làm lạnh, trộn đều bằng vortex, ủ ở nhiệt độ thƣờng 10 phút. Tiếp đó 400
l đệm Bib-Do 2 đƣợc bổ sung vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ 4 - 6 lần và đặt ở trên đá
5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp đƣợc trung hoà bằng 300 l
đệm Bib-Do 3 đã đƣợc làm lạnh, đảo nhẹ 4 - 6 lần, đặt trên đá 10 phút. Dịch nổi
đƣợc thu lại bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC và chuyển nhẹ nhàng
750 µl dịch nổi sang ống eppendorf mới. Bổ sung 12 ul dung dịch RNase (1 mg/ml) vào và ủ ở 37oC khoảng 30 phút. Bổ sung 750 µl dung dịch Phenol-Chloroform- Isoamy-alcohol (25:24:1). Hỗn hợp đƣợc vortex trong 15 giây và phân tách bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Chuyển nhẹ nhàng 750 µl dịch ở trên sang ống eppendorf mới, 750 µl thể tích isopropanol đƣợc thêm vào, ủ ở - 20oC.