- Khái niệm: Western Blotting là kỹ thuật lai giữa protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng thể), protein kháng nguyên đƣợc phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzym hoạt hóa phản ứng.
- Nguyên tắc: Kỹ thuật Western Blotting đƣợc tiến hành dựa trên sự tƣơng tác đặc
hiệu giữa protease (kháng nguyên) và kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (thƣơng mại) làm kháng thể sơ cấp, sau đó phức hợp protease HIV-1 và kháng thể tƣơng ứng này lại đƣợc nhận ra bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzym phosphatase kiềm Alkaline phosphatase (AP), và cuối cùng phức hợp protease HIV -1 gắn kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp đƣợc phát hiện bằng cách cho hỗn hợp này ủ với dung dịch cơ chất NBT và BCIP, enzym gắn trên kháng thể thứ cấp biến đổi cơ chất NBT và BCIP từ không màu thành sản phẩm có màu dễ dàng nhận ra bằng mắt thƣờng [5].
- Các bƣớc cơ bản của phƣơng pháp Western Blotting [5]
+ Tách protein tổng số, xử lý protein thành cấu trúc bậc 1 bằng cách trộn với đệm biến tính protein và nhiệt độ cao.
+ Chuyển gel sang màng lai bằng phƣơng pháp thẩm thấu, điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có 10% methanol. Trong khi chuyển màng thì vị trí các băng protein đƣợc giữ nguyên.
+ Xử lý màng lai bằng dung dịch BSA 3% trong đệm PBS pH 7,4 bằng cách lắc nhẹ
trong 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng, hoặc để qua đêm ở 4oC, bƣớc này nhằm
lấp đầy khoảng trống trong màng lai nhằm ngăn cản protein lạ bám vào màng lai. Lƣợng BSA thừa sẽ đƣợc rửa 3 lần với đệm PBS 1X có pH 7,4, đã đƣợc bổ sung Tween 80 0,1%. Mỗi lần bổ sung PBS vào màng, lắc nhẹ trong 15 phút.
+ Lai: màng lai đƣợc lai với kháng thể sơ cấp (mẫu dò 1), mẫu dò dùng lai là kháng thể của protein cần phát hiện (kháng nguyên), trong nghiên cứu này mẫu dò 1 là kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1.
+ Rửa màng lai 3 lần với PBS 1X có pH 7,4, đã đƣợc bổ sung Tween 80 0,1% để loại bỏ mẫu dò 1 không lai và lai tiếp với kháng thể thứ cấp trên chuột có gắn phosphatase kiềm phân hủy cơ chất tạo màu. Kháng thể thứ cấp là kháng thể kháng với kháng thể sơ cấp.
+ Phát hiện vị trí lai: rửa loại bỏ kháng thể sơ cấp bằng PBS 1X có pH 7,4, đã đƣợc bổ sung Tween 80 0,1%, lặp lại 3 lần giống rửa kháng thể sơ cấp.
+ Ủ màng với đệm AP 1X và lắc nhẹ trong 10 phút
+ Hiện màu các băng protein bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất NBT và BCIP pha trong đệm AP đến khi nhìn thấy băng. Dung dịch này đƣợc pha nhƣ sau 10ml AP 1X có 66 µl NBT/50 µg/ µl và 33 µl BCIP/ µg/ µl.