2.2.3.1. Cắt mở vòng vector và sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc kiểm tra sự nhân lên chính xác sẽ đƣợc xử lý với cặp enzym giới hạn có trình tự cắt đặc hiệu đã thiết kế trên cặp mồi số 1 (Bảng 2) để tạo các đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời vector biểu hiện pPIC9 đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzym giới hạn với sản phẩm PCR để tạo đầu tƣơng thích tƣơng ứng và cố định chiều của đoạn DNA đƣa vào vector biểu hiện. Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với 20 µl tổng thể tích (bảng 4).
Bảng 4. Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn
Thành phần EcoRI NotI SalI
DNA (2 µg/ µl) 5 µl 5 µl 5µl Đệm của enzym 10X 2 µl 2 µl 2µl BSA 10X 0 µl 2 µl 0µl Enzym (RE) 0,5 µl 1 µl 0,5µl H2O 12,5 µl 10 µl 12,5µl Tổng 20 µl 20 µl 20 µl
Hỗn hợp phản ứng đƣợc vortex và ly tâm nhẹ rồi ủ ở 37 oC trong 2 giờ hoặc qua đêm, sau đó đƣợc kiểm tra trên gel agarose.
2.2.3.2. Tinh sạch sản phẩm cắt enzym giới hạn bằng kít thôi gel của Bioneer
Sau khi cắt bằng enzym giới hạn, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện đang ở dạng mạch hở đƣợc tinh sạch bằng kit thôi gel của Bioneer nhằm loại bỏ các trình tự DNA không mong muốn và tăng nồng độ, chuẩn bị cho phản ứng gắn. Theo qui trình của Bioneer, trƣớc tiên sản phẩm cắt enzym giới hạn đƣợc chạy trên gel agarose 1% để phân tách các băng. Sau đó bản gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng UV, phần gel chứa đoạn DNA với kích thƣớc phù hợp với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 (khoảng 360 bp) và vector biểu hiện dạng mạch hở đƣợc cắt và chuyển vào ống eppedorf 2 ml. Bổ sung năm lần thể tích của đệm GB (Gel Binding Buffer) vào một thể tích của miếng gel đã cắt. Hỗn
hợp đệm và gel đƣợc ủ ở 60oC trong bể ổn nhiệt khoảng 10 phút để tan hết gel.
Sau đó hỗn hợp đƣợc đƣa lên cột thôi gel, cột này sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ
13.000 vòng/phút trong 1 phút, 4oC. Phần dịch dƣới cột bị đổ bỏ và cột đƣợc rửa 2
lần bằng 500 µl đệm rửa WB (Washing buffer), kèm theo ly tâm mỗi lần với cùng điều kiện. DNA gắn trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 30-50 µl đệm EB (Elution Buffer). Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút, cột đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, nhiệt độ phòng. DNA trong dịch sau ly tâm đƣợc
giữ ở -20oC cho đến khi đƣợc dùng.
2.2.3.3. Gắn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện
Đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện sẽ đƣợc gắn với nhau sau khi đã tinh sạch, việc gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector nhờ sự hoạt động của enzym nối T4 DNA ligase. Phản ứng nối ghép đƣợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng là 10 µl, thành phần phản ứng nhƣ sau: 2 µl vector; 6 µl sản phẩm PCR; 1µl đệm T4 DNA ligase 10X; 1 µl T4 DNA ligase
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC qua đêm và đƣợc biến nạp vào tế bào khả
2.2.3.4. Biến nạp vector bằng phương pháp sốc nhiệt
Năm 1928, Griffith phát hiện hiện tƣợng biến nạp (transformation) ở vi
khuẩn Diplococus pneumoniae (nay gọi là Streptococus pneumoniae). Năm 1944,
T.Avery, Mc Leod và Mc Carty đã xác định rõ DNA là tác nhân chuyển thông tin di truyền trong quá trình biến nạp [2].
Nguyên lý:
Tế bào E. coli khi đƣợc xử lý bằng các cation nhƣ calcium, magnesium,
rubidium hay hexamine cobalt sẽ bị thay đổi tính thấm của màng, do đó sẽ cho phép DNA đi vào tế bào vi khuẩn E. coli. Việc xử lý các cation cho phép làm trung hòa điện tích âm của màng ngoài tế bào, cho phép DNA cũng tích điện tích âm đi xuyên qua lớp vỏ tế bào để đi vào bên trong. Tế bào sau khi bổ sung DNA đƣợc đặt trên đá
để làm ổn định sự tƣơng tác giữa ion Ca2+ và các cấu trúc tích điện âm của màng
DNA. Hỗn hợp này sau đó đƣợc đƣa vào bể ổn nhiệt 42oC trong khoảng thời gian
rất ngắn để làm thay đổi tính lƣu động của trạng thái bán tinh thể của màng tế bào, qua đó cho phép các phân tử DNA đi vào trong tế bào qua các kênh vận chuyển.
Các bước thực hiện:
Trƣớc tiên, cần chuẩn bị sẵn tế bào khả biến E. coli chủng DH5α và bảo
quản ở -800C. Các tế bào khả biến này đƣợc lấy ra để trên đá 10 phút cho tan dần.
Hỗn hợp phản ứng gắn DNA đƣợc bổ sung vào, trộn đều và để lại ngay trên đá trong 20 - 30 phút, tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó hỗn hợp
đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút để ổn định (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
tế bào. Bổ sung 300-500 µl môi trƣờng LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó
đƣợc giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37oC trong
50 phút. 100 µl hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa petri LB đặc có bổ sung
kháng sinh ampicllin nồng độ 100 µg/ml và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm.
2.2.4. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid
Trong nghiên cứu này, DNA plasmid đƣợc tinh sạch theo công thức của Birnboim & Doly (1979), sử dụng 3 loại đệm: đệm Bib-Do 1 (25 mM Tris pH 8, 10
mM EDTA, 50 mM Glucose); đệm Bib-Do 2 (0.2 N NaOH, 1 % SDS) và đệm Bib- Do 3 (3 M potassium acetate, 11.5 % axit acetic pH 5.2).
Quy trình thực hiện như sau:
Khuẩn lạc (E. coli) đƣợc cấy vào 4 ml LB lỏng có bổ sung Amp 100 g/ml
và đƣợc nuôi lắc ở 37oC khoảng 200 vòng/phút trong 14-16 giờ. Dịch nuôi cấy
đƣợc ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút, 4 oC để thu tế bào. Sau khi
loại bỏ hoàn toàn dịch nổi, cặn tế bào đƣợc hoà trở lại trong 200 l đệm Bib-Do 1
đã đƣợc làm lạnh, trộn đều bằng vortex, ủ ở nhiệt độ thƣờng 10 phút. Tiếp đó 400
l đệm Bib-Do 2 đƣợc bổ sung vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ 4 - 6 lần và đặt ở trên đá
5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp đƣợc trung hoà bằng 300 l
đệm Bib-Do 3 đã đƣợc làm lạnh, đảo nhẹ 4 - 6 lần, đặt trên đá 10 phút. Dịch nổi
đƣợc thu lại bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC và chuyển nhẹ nhàng
750 µl dịch nổi sang ống eppendorf mới. Bổ sung 12 ul dung dịch RNase (1 mg/ml) vào và ủ ở 37oC khoảng 30 phút. Bổ sung 750 µl dung dịch Phenol-Chloroform- Isoamy-alcohol (25:24:1). Hỗn hợp đƣợc vortex trong 15 giây và phân tách bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Chuyển nhẹ nhàng 750 µl dịch ở trên sang ống eppendorf mới, 750 µl thể tích isopropanol đƣợc thêm vào, ủ ở - 20oC.
Sau đó tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC để kết tủa DNA. Sau
đó, DNA đƣợc rửa bằng cồn 70% và làm khô bằng cách mở nắp ống qua đêm. Sau đó, DNA đƣợc hòa tan bằng 40-50 µl nƣớc cất khử ion hoặc đệm TE.
DNA plasmid sau tách và tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260nm (A260) bằng cách sử dụng Nanodrop. DNA plasmid đƣợc cho là sạch khi giá trị (A260/A280) nằm trong khoảng 1,8 – 2,0.