ứng ligase
Sau khi cắt mở vòng plasmid và đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng cùng một cặp enzym giới hạn để chuẩn bị cho phản ứng ligase. Phản ứng chèn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào plasmid pPIC9 đƣợc thực hiện nhờ đến enzym T4 DNA ligase, hỗn hợp phản ứng ligase đƣợc ủ qua đêm. Chúng tôi tiến hành biến nạp sốc nhiệt vector tái tổ hợp pPIC9 (sản phẩm ligase) chứa gen mã hóa protease HIV-1 vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α ngay sau khi phản ứng ligase kết thúc. Sản phẩm biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa LB đặc có Amp. Trên pPIC9 có gen kháng Amp nên chỉ có những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp chứa gen kháng Amp mới có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trƣờng LB có chứa Amp (50 µg/ml).
Kết quả biến nạp thu nhận đƣợc đĩa thạch có một số khuẩn lạc trắng. Chúng tôi chọn ngẫu nhiên hai khuẩn lạc và tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi Prot-F và AOX1-R (cặp mồi 2 - bảng 2). Mồi Prot sẽ xác định đƣợc sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1, còn mồi AOX1-R có thể xác định gen mã hóa protease HIV-1 đã đƣợc chèn đúng chiều vào pPIC9. Theo tính toán, nếu gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc chèn đúng chiều vào pPIC9, đoạn DNA đƣợc nhân lên sẽ có chiều dài khoảng 440 bp (bằng 44 bp trình tự mồi Prot-F+ 356 bp của gen Prot + 85 bp trình tự trên pPIC9). Ngƣợc lại, nếu đoạn gen này không đƣợc chèn đúng chiều, sản phẩm PCR sẽ không lên băng.
1 2 3
Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli DH5α
Giếng 1: Thang DNA 100bp;
Giếng 2, 3: Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc mang pPIC9-Prot
Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc (Hình 9) cho thấy các khuẩn lạc đều lên băng có kích thƣớc khoảng 440 tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn DNA chứa gen mã hóa protease HIV-1 nhƣ tính toán lý thuyết. Chứng tỏ, chúng tôi đã tạo thành công vector pPIC9 tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 (kí hiệu là pPIC9-Prot). Gen mã hóa protease HIV-1 đã đƣợc chèn đúng chiều và đƣợc nhân lên trong tế bào chủ E. coli DH5α. Để khẳng định này thêm chắc chắn, chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự đối với các khuẩn lạc thu đƣợc ở trên.
3.1.5. Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 trong vector biểu hiện pPIC9
Nhằm xác định chính xác việc cài đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào pPIC9 đúng vị trí và đúng chiều hay chƣa, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật giải trình tự. Trƣớc tiên, hai khuẩn lạc trắng bƣớc đầu đã đƣợc khẳng định mang pPIC9-
đã tinh sạch (kí hiệu là pPIC9-Prot 1 và pPIC9 - Prot 2) đƣợc pha loãng ở nồng độ
thích hợp (khoảng 50 - 100 ng/µl) và gửi đến Hàn Quốc để giải trình tự.
Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết
Kết quả giải trình tự đƣợc so sánh với cấu trúc thiết kế dự tính theo lý thuyết (trên hình 10) cho thấy cấu trúc Prot1 có trình tự trùng khớp với cấu trúc Prot lý thuyết. Khuẩn lạc mang cấu trúc Prot2 bị đột biến mất nucleotide ở vị trí bộ ba mã hóa cho axit amin thứ 6 và đột biến thay thế ở hai vị trí của hai bộ ba mã hóa axit amin thứ 44 và 58,trong 99 axit amin của protease HIV-1. Các đột biến mất và thay thế này đã dẫn đến sự biến đổi về trình tự chuỗi polypeptide, cụ thể đột biến mất ở codon 6 khiến cho axit amin này không đƣợc tổng hợp và làm dịch chuyển khung đọc dẫn đến sản phẩm protein đƣợc dịch mã sai, tức là chuỗi polypeptide đƣợc tổng hợp ra không phải là protease HIV-1. Khi đã bị đột biến mất nucleotide ở codon 6, có thể không cần xét đến đột biến ở codon 44 và 58 nữa. Tuy nhiên, nếu đột biến ở
codon 6 không xảy ra, sự biến đổi của codon 44 và 58 dẫn đến axit amin đƣợc hình thành lần lƣợt là Ser (Serin) và Arg (Arginin) khác với các axit amin trong protease HIV-1 là Prolin và glutamic. Theo cấu trúc của protease HIV-1, hai axit amin này nằm trong vùng mũ. Mặc dù chƣa xác định ảnh hƣởng cụ thể của đột biến này, nhƣng theo kết quả của một số nghiên cứu, đột biến xuất hiện ở vùng mũ có thể làm giảm mạnh hoạt tính của protease HIV-1 [47]. Những đột biến xảy ra ở trên có thể là đột biến ngẫu nhiên do sự sai sót của enzym DNA Taq polymerase.
Vì lý do trên, để nâng cao hiệu quả biểu hiện chúng tôi chỉ chọn CT-Prot1 của khuẩn lạc mang cấu trúc Prot để tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protease
HIV-1 ở P. pastoris. Nhƣ vậy, chúng tôi đã nhân dòng đƣợc gen mã hóa protease
HIV-1 vào vector pPIC9.
3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN
P. PASTORIS
3.2.1. Tạo dòng nấm men P. pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 hóa protease HIV-1
Trên plasmid pPIC9 có chứa gen HIS4 mã hóa protein histidinol
dehydrogenase, HIS4 ORF ở vị trí base 4514 - 1980, trong khoảng này lại có một vị trí nhận biết duy nhất của enzym giới hạn SalI tại base 3177. Chính vì vậy, vector tái tổ hợp pPIC9 mang gen mã hóa protease HIV-1 đã qua kiểm tra đƣợc xử lý bằng
enzym cắt giới hạn SalI để tăng khả năng trao đổi chéo giữa plasmid và vùng HIS4-
trên hệ gen của tế bào nấm men, cũng nhƣ để tạo đƣợc chủng P. pastoris tái tổ hợp
dạng Mut+. Vector pPIC9-Prot đã đƣợc cắt mở vòng thành dạng thẳng đƣợc định
hƣớng trao đổi chéo và cài toàn bộ cấu trúc biểu hiện gen ngoại lai vào vùng gen
HIS4 trong hệ gen tế bào P. pastoris SMD1168 bằng phƣơng pháp điện biến nạp. Vì thế, cấu trúc gen AOX1 trong hệ gen đƣợc bảo toàn để sản xuất enzym alcohol oxidase chuyển hóa nguồn methanol nhƣ nguồn carbon cho nấm men sinh trƣởng. Nhờ vậy, gen mã hóa protease HIV-1 từ plasmid đƣợc chuyển vào và tồn tại ổn định trong bộ gen của tế bào. Song song với việc chuyển vector tái tổ hợp pPIC9- Prot vào chủng nấm men SMD1168, chúng tôi cũng tiến hành cài plasmid pPIC9
nhằm xác định xem sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 ảnh hƣởng thế nào đến sinh trƣởng của chủng nấm men SMD1168.
Sản phẩm biến nạp sau đó đƣợc cấy trải trên môi trƣờng MD (khuyết dƣỡng histidin) trong 3 ngày. Nhiệt độ tăng sinh cho nấm men là 30oC. Kết quả là các khuẩn lạc nấm men đã mọc đều, có màu trắng và tách biệt với nhau (Hình 11).
Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris SMD1168
(11A) Sản phẩm biến nạp pPIC9 vào nấm men P. pastoris SMD1168; (11B) Sản phẩm biến nạp pPIC9-Prot vào nấm men P. pastoris SMD1168
Với sự có mặt của gen HIS4 trên pPIC9 thì chỉ những tế bào nấm men có
mang vector này mới có khả năng mọc trên môi trƣờng khuyết dƣỡng histidine. Những khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng MD chứng tỏ chúng có chứa plasmid pPIC9 nên mới có khả năng tổng hợp histidine. Cả hai đĩa nuôi cấy đều xuất hiện các khuẩn lạc trắng vì cùng có mặt pPIC9 trong tế bào. Nhƣ vậy chúng tôi đã biến nạp thành công pPIC9 và vector pPIC9-Prot vào tế bào chủng nấm men P. pastoris
SMD1168.
Về lý thuyết khi plasmid đƣợc chuyển vào tế bào có thể xảy ra sự sát nhập vào bộ gen của tế bào theo hai phƣơng thức là chèn gen hoặc thay thế gen. Để kiểm tra phƣơng thức sát nhập của vector tái tổ hợp vào hệ gen của nấm men, chiều và vị trí chèn gen, chúng tôi đã chọn ngẫu nhiên mỗi đĩa nuôi cấy một khuẩn lạc và tiến
hành kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi số 3 (bảng 2). Theo Kit biểu hiện trên P. pastoris của hãng Invitrogen, sản phẩm PCR của vector pPIC9 khi sử dụng cặp mồi 5’AOX1 sẽ cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 500 bp [29]. Nhƣ vậy, với các khuẩn lạc mang vector pPIC9-Prot, sản phẩm PCR sẽ cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 850 bp (500 bp trình tự trên vector + 356 bp trình tự gen mã hóa
protease HIV-1). Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 12).
Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men
Giếng 1: Thang DNA 1kb; Giếng 2: Đối chứng âm với khuôn là H20 Giếng 3: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9 ; Giếng 4: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9-Prot
Kết quả ở hình 12 cho thấy, sản phẩm PCR từ khuẩn lạc nấm men P. pastoris SMD1168 chứa vector tái tổ hợp pPIC9-Prot ở giếng số 4 cho hai băng, trong đó một băng là gen AOX1 trong hệ gen nấm men kích thƣớc khoảng 2,2 kb và một
băng là cấu trúc pPIC9-Prot có kích thƣớc khoảng 850 bp nhƣ dự tính lý thuyết. Trên giếng số 3 là sản phẩm PCR khuẩn lạc chứa plasmid pPIC9 không mang gen mã hóa protease HIV-1, xuất hiện hai băng với kích thƣớc tƣơng ứng là 2,2 kb ( gen
AOX1 của genome nấm men) và 0,5 kb (trình tự promoter AOX1 bắt cặp với mồi
AOX1 nằm trên plasmid pPIC9). Trong khi đó, đối chứng âm với khuôn là H2O không cho băng DNA nào (giếng 2). Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo thành công dòng
SMD1168 tái tổ hợp có kiểu hình Mus+ và có thể tiến hành bƣớc cảm ứng biểu hiện
protease HIV-1 tiếp theo.
3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P. pastoris
Các chủng nấm men P. pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9 và pPIC9- Prot đƣợc nuôi cấy song song trong môi trƣờng BMGY đến OD600 đạt khoảng 6 -7. Sau đó, các chủng SMD1168 này đƣợc chuyển sang môi trƣờng cảm ứng biểu hiện MM có methanol 0,5%, methanol đƣợc thêm vào sau mỗi 24 giờ. Điều kiện nuôi lắc
là nhiệt độ 30oC, trong 100 giờ ở tốc độ lắc 200 vòng/phút. Để theo dõi quá trình
sinh trƣởng của các chủng nấm men tái tổ hợp và xem việc chứa gen mã hóa protease HIV-1 trong bộ gen có làm ảnh hƣởng tới sức sống của các thể biến nạp hay không, chúng tôi tiến hành thu dịch môi trƣờng trƣớc mỗi lần thêm methanol và đo phổ hấp phụ của dịch nuôi cấy theo thời gian, ở bƣớc sóng 600 nm (Bảng 6). Kết quả thu đƣợc thể hiện trên đƣờng cong sinh trƣởng (Hình 13).
Bảng 6. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3 lần
Lặp lại pPIC9 pPIC9-Prot
0 h Lần 1 1,02 1,02 Lần 2 1,01 1,09 Lần 3 0.92 0,97 Trung bình 0,98 1,02 24 h Lần 1 2,12 2,14 Lần 2 3,59 3,60 Lần 3 3,20 2,55 Trung bình 2.97 2,76 48 h Lần 1 5,81 6,12 Lần 2 6,84 6,84 Lần 3 5,20 4,66 Trung bình 5,95 5.87 72 h Lần 1 6.92 7,25 Lần 2 8,75 8,75 Lần 3 6,52 6,48 Trung bình 7,40 7,49 96 h Lần 1 7,50 7,80 Lần 2 8,98 8,96 Lần 3 8,50 8,32 Trung bình 8,33 8.37
Theo kết quả thu đƣợc (trên bảng 7 và hình 13), cả chủng đối chứng mang plasmid pPIC9 và các chủng có mang cấu trúc pPIC9-Prot có đƣờng cong sinh trƣởng tƣơng đối giống nhau. Chứng tỏ, sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 cũng nhƣ plasmid pPIC9 không ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng của chủng P.
Hình 13. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng P. pastoris SMD1168sau khi biểu hiện ở môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian
Đƣờng màu xanh là sinh trƣởng của P. pastoris SMD1168 mang pPIC9 (pPIC9). Đƣờng màu đỏ là sinh trƣởng của P. pastoris SMD1168 mang pPIC9-Prot (pPIC9-prot)
Trong quá trình biểu hiện, protease HIV-1 sẽ đƣợc tiết ra môi trƣờng. Nếu protease HIV-1 có hoạt tính tự cắt tại đầu N để giải phóng ra protein có axit amin mở đầu là Prolin thì sẽ có kích thƣớc là 108 axit amin (99 axit amin của protease HIV-1 + 9 axit amin trình tự của HA ở đầu C) và có KLPT khoảng 12 kDa. Nhƣ vậy, băng protein của pPIC9-Prot (giếng 3 - hình 14) ghi nhận trong kết quả điện di SDS-PAGE rất có thể là protease HIV-1. Tuy nhiên, mẫu pPIC9 cũng xuất hiện băng có kích thƣớc gần giống với pPIC9-Prot (giếng 2- hình 14).
Hình 14. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng tái tổ hợp SMD1168 (72h)
Giếng 1: Thang protein;
Giếng 2: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168 mang pPIC9; Giếng 3: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168 mang pPIC9+Prot.
Vì vậy, để kiểm tra và khẳng định chắc chắn băng protein có kích thƣớc khoảng 12 kDa của chủng nấm men tái tổ hợp trong hình 14 là protease HIV-1, chúng tôi tiến hành kiểm tra tiếp bằng kỹ thuật thẩm tách miễn dịch Western blotting. Các mẫu cũng đƣợc lấy với thể tích tƣơng đƣơng, tiến hành điện di, sau đó đƣợc lai với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1. Kết quả hiện màu (hình 15) cho thấy mẫu protein của pPIC9-Prot (giếng số 3) xuất hiện tín hiệu dƣơng tính tại vị trí tƣơng ứng với băng protein có KLPT khoảng 12 kDa nhƣ đã ghi nhận trên SDS-PAGE (Hình 14). Băng protein dƣơng tính này chƣa đậm, chứng tỏ hàm lƣợng protease HIV-1 trong mẫu chƣa cao. Điều này có thể là do trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi chƣa cô đặc dịch môi trƣờng để làm tăng nồng độ protein. Trong khi đó, protein từ nấm men mang pPIC9 đối chứng không cho băng protein nào (giếng số 2 - hình 15). Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi có thể khẳng định đã biểu hiện
Hình 15. Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western Blot
Giếng 1: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn
Giếng 2: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168 mang pPIC9 Giếng 3: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168mang pPIC9-Prot
Mặc dù kết quả phân tích bằng SDS-PAGE cho thấy hàm lƣợng protease HIV-1 đƣợc biểu hiện từ chủng SMD1168 chƣa cao và dịch môi trƣờng sau cảm ứng còn có một số protein tạp. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng
cho thấy rằng chủng P. pastoris SMD1168 tái tổ hợp có khả năng biểu hiện
protease HIV-1 ở dạng tan tiết vào môi trƣờng. Kết quả này đã phần nào khắc phục đƣợc một số hạn chế của các nghiên cứu trƣớc về tính tan của protease HIV-1. Phần lớn các nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trƣớc đây đều cho kết quả là protease HIV-1 thƣờng khó tan và thu đƣợc ở phân đoạn tủa tế bào, cụ thể trên thế giới có thể kể tới nhƣ: Cheng và tập thể (1990) [15], Leuthardt và tập thể (1993) [31], và gần đây là Yanchunas và tập thể (2005) [50] đều cho kết quả, protease HIV-1 đƣợc biểu hiện dạng không tan và thu đƣợc ở phân đoạn tủa tế bào.
Ở Việt Nam, năm 2012 Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể cũng đã công bố kết quả biểu hiện protease HIV-1 trên E. coli, thu đƣợc ở phân đoạn tủa tế bào dạng không tan.
Kết quả này, phù hợp với nghiên cứu của Rangwala và tập thể công bố năm 1992 [41] rằng protease HIV-1 biểu hiện với lƣợng thấp mới dễ tan và thu đƣợc trong dịch chiết của tế bào.
Với kết quả thu đƣợc, đã bƣớc đầu khẳng địnhrằng chúng tôi đã nghiên cứu
biểu hiện thành công protease HIV-1 trên chủng nấm men P. pastoris SMD1168 ở
dạng tan tiết vào dịch môi trƣờng. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên biểu hiện protease HIV-1 trong nấm men P. pastoris ở Việt Nam.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Với những kết quả thu đƣợc trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1/ Đã nhân dòng thành công gen mã hóa protease HIV-1 vào vector pPIC9. 2/ Bƣớc đầu biểu hiện đƣợc gen mã hóa protease HIV-1 bằng vector pPIC9-Prot trên nấm men P. pastoris SMD1168, protease HIV-1 tiết ra môi trƣờng nuôi cấy ở dạng tan cho băng protein 12 kDa trên SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch.
KIẾN NGHỊ
Đề tài của chúng tôi có thể tiếp tục phát triển theo hƣớng:
1/ Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện protease HIV-1 trên P. pastoris