Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của thân cây chè vằng (jasminum subtriplinerve blume oleaceae)

Dira vào két quâ thu duoc bàng phuong phâp sàc kÿ dôi vôi tirng phân doan tac già dâ so bô két luân trong cây chè vàng cô câc dân xuât terpen, nhua lighin, glucosid dâng, flavonoid và al

BOY TE TRUÔNG DAI HOC DUOC HÀ NÔI

DINH PHÜONG LIÊN

NGHIÊN CtJU SO BÔ THÀNH PHAN HOÂ HOC CÜA THÂN CÂY CHÈ VANG (Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae)

KHOA LU AN TOT NGHTF.P DUOC Si KHOÂ 1998-2003

Nguài huâng ddn : PGS.TS Bê Thj Thuân

DS Nguyên Quÿnh Chi

N oi thuc hiên Bô mon Dirac lieu

Thôi gian thuc hiên: 5/3/03 -15/5/03

LƠI CÂM ON

W / l o i n / h iè t d u s it u &At±, f ơ i ỉ in e J u n i t h ù i i h e ü n t o u :

PGS.TS B eT hi Thuan

DS Nguyên Quÿnh Chi

J là n h u t u / u q t t ơ i f i n 11 / t e n e t i è p /tu ơ 'tiq d a n f ơ i f t o u q q u â fr ỵit /i t in t e Itiètt UltOii l u à n u t i l /

Ç Jèi x i u b ù q t ơ l o i n / b iè t Ou e u a n i i n h t o i t o à n t h è e u e t h a ï / q i â o , eơ

q i â o , e u e e ê Ut/ f / m û t o i ê u f t o m / Im rviơtt ^ D uoe l i e u e t u i q e u e p l t è i u j /u n i

t r o u q f r u ơ u q êtâ q i t i p êtơ o ù t u o m o i (t ie n U iên f l u t û i i l d i e h o t ơ i fio iu t

f h ù u h tơ t U lu )a h u n i Ç Jơ i ỉ in e h à n fl iiu ilt e d r n oit s u q i t t p êtơ (fin / h a u et'u t e u e fit a i/ e â ït ii q i ù n l i e h o t ơ i.

@ u êi e i t n q t ê i t i n êttû ïe e à i u o’n s u q iû p , êtơ Ó êtơ u q o i ê u U lu eli l i

et n i If u n h è , u q n ơ i t l i à u t r o u q sitơ t q u â fr i a i t f ơ i tlu i'e /t ie n êtê t ù i n ù t /

'Jùù Ql&i, tn/ùij 16 thit tu/ 5 tuint 2003

cS iu h o i ê u

Dinh Phircmg Liên

MUC LUC

DAT VAN DE 1

PHAN I - TÔNG QUAN 2

1.1 Mot sohiéu biet vê cây Chè vang 2

1.1.1 Dàc diëm thuc vât 2

1.1.2 Phân bo 3

1.1.3 Bô phân dùng, thu hâi và ché bien 3

1.1.4 Thành phân hoâ hoc 3

1.1.5 Tac dung, công dung 3

1.2 Tôm tât phuang phâp nghiên cûu thành phân hoâ hoc 6

1.2.1 Djnh tm h 6

1.2.2 Dinh luong 6

1.2.3 Chiét xuât 6

1.2.4 Phân lâp 7

1.2.5 Nhân dang 7

1.3 Phuong phâp nghiên cûu hop chat Flavonoid trong duoc lie u 8

1.3.1 Dinh tmh sa bô flavonoid trong duoc lieu 8

1.3.2 Dinh luong flavonoid 9

1.3.3 Chiét xuâ't 10

1.3.4 Phân lâp 11

1.3.5 Nhân dang 12

PHÂN II- THÜC NGHIÊM VÀ KET QUÂ 13

2.1 Nguyên lieu và phuong phâp thuc nghiêm 13

2.1.1 Nguyên lieu 13

2.1.2 Phuong phâp thuc nghiêm 13

2.2 Thuc nghiêm và kêtq u â 14

2.2.1 Dinh tmh câc nhôm chât tu nhiên trong thân cây Chè vàng 14

2.2.2 Chiét xuât, dinh tmh flavonoid bàng sâc kÿ côt 21

2.2.3 Phân lâp và nhân dang flavonoid 25

2.2.4 Phân lâp, phân tich và nhân dang chât M 27

2.3 Bàn luân 28

PHAN III- KÉT LUÂN VÀ DE NGHI 29

3.1 Kêt lu ân 29

3.2 De nghi 29

CÂC CHÜ VIÉT TÂT

SKLM : Sâc kÿ ldp môngSKG : Sâc kÿ giay

UV : Tûngoai

IR : Hong ngoai

DAT VAN DE

Viêt Nam nâm trong vùng khi hâu nhiêt dôi cô thâm thuc vât phong phü và

da dang Tir rat lâu dôi nhân dân ta dâ biét sir dung cây cô dé làm thuô'c phông

và chûa bênh Chè vàng là mot cây thuôc dâ dugc su dung tir lâu trong dân gian, tuy nhiên vé thành phàn hoâ hoc, chè vàng chua dugc nghiên cûu nhiêu.Théo kinh nghiêm dân gian, chè vàng thuông dugc dùng cho phu nù sau khi

dê dé phông và chông nhiêm trùng, thiéu n^âu, met moi, kém ân Ngoài ra chè vàng côn dugc dùng dé chüa kinh nguyêt không dèu, thây kinh dau bung, chüa tri câc vét thuang nhiêm trùng gây mü Trên thé giôi cô nhiêu loài khâc

cùng chi (Jasminum) cüng dugc sir dung làm thuôc, dâ cô nhiêu tài lieu

nghiên cüu vê thành phân hoâ hoc và tac dung sinh hoc cüa câc loài dô Tuy nhiên chüng tôi chua tïm thây tài lieu nào trong và ngoài nuôc nghiên cüu eu

thé vê câc chat cô hoat tînh sinh hoc trong cây chè vàng à nuôc ta Mot diêu

dang quan tâm nûa là mot sô tài lieu và ngay câ Dugc dién Viêt Nam in lân

thü nhâ't (tâp II) cüng dêu viêt bô phân dùng cüa chè vàng chî là la, nhung

trong thuc té nhân dân ta vân dùng câ thân và lâ cây chè vàng, phâi châng cô thé cô su khâc nhau vê thành phàn hoat chât giûa thân và lâ cüa cây?

Xuâ't phât tù thuc té trên, chüng tôi tiê'n hành làm khoâ luân tôt nghiêp vôi

dê tài "Nghiên cüu sa bô thành phàn hoâ hoc cüa thân cây chè vàng"

nhàm hai mue tiêu là:

• Xâc dinh mot sô hgp chât tu nhiên trong thân cây chè vâng

• Chiét tâch, phân lâp và du doân câu truc chât phân lâp dugc

PHAN I : TÔNG QUAN

1.1 MOT SÔ HIÉU BIÉT VE CÂY CHÈ VÀNG

1.1.1 Dde diem thuc vât:

Chè vâng cèn cô tên khâc nhtf: dâm trâng, lài ba gân [3], chè cuôc man, dây câm vân, chè vàn [9] Chè vâng cô tên khoa hoc là:

Jcisminum subtriplinerve Blume, thuôc ho Nhài (Oleaceae).

Chè vàng là mot cây nhô, moc thành bui à bô rào hay bui tre hoâc bâm

vào câc cây lôn Thân cây crïng chia thành tùng dot duông kmh 5-6mm và viron dài tôi 15-20m, thân và cành dêu nhân La moc dô'i hinh müi mâc, phîa cuô'ng tu hay hcri tron, dàu hai nhon, dài 4-7,5mm, rông 2-4,5mm; nhüng la phia trên nhô hon la phia duôi, mép nguyên trên cô chia 3 gân rô rêt Cuông la nhân, dài 3-12mm Hoa moc thành xim, nhiêu hoa ( chùng 7-9 hoa), cânh hoa màu trâng Quâ hinh càu, diràng kfnh 7-8mm Khi quâ chîn cô màu vàng, trong quâ cô mot hat rân châc Mùa quâ chîn vào thâng 7 dên thâng 10 trong nâm [8]

Ânh 1: Cây chè vâng

1.1.3 Bô phân dùng, thu h â i, chê bien:

Théo câc tài lieu [6,8,11] bô phân dùng cüa chè vàng là la Nhung trên thuc té nhân dân ta hay dùng câ lâ và thân chè vàng thu hâi quanh nàm, co thé dùng khô hoâc tuai

1.1.4 Thành phân hoâ hoc:

Mot so tài lieu môi chî de câp dén su cô mât cüa nhua, flavonoid, alcaloid trong lâ chè vàng [3,8] Tù cao côn 90° cüa cà lâ và thân cây chè vàng, Nguyên Thi Ninh Hâi [7] dâ tién hành tâch phân doan bàng câc dung môi cô dô phân eue khâc nhau Dira vào két quâ thu duoc bàng phuong phâp sàc kÿ dôi vôi tirng phân doan tac già dâ so bô két luân trong cây chè vàng cô câc dân xuât terpen, nhua lighin, glucosid dâng, flavonoid và alcaloid Tuy nhiên két quâ này duge dua ra hoàn toàn chî dira trên màu sàc cüa vêt chat trên sâc kÿ dô sau khi phun thuôc thü hiên màu, két hop vôi câc két quâ nghiên cüu dâ duoc công bô trên thé giôi vê mât hoâ hoc cüa mot sô loài thuôc chi Jasminum cô nghîa là tac giâ luân an môi chî dè câp râ't so bô vé câc nhôm châ't cô trong thân và lâ cây chè vàng

1.1.5 Tac dung, công dung :

1.1.5.1 T a c dung duac ly

□ Tâc dung khâng khuln:

Bàng phuong phâp • khuêch tan, dùng khoanh giây trên môi truông thach, câc dang ché phâm cüa thân và lâ chè vàng (cao nuôc, cao côn 90°, 40°)

cô tâc dung khâng khuân manh vôi câc chüng vi khuln Staphylococcus

aureits, Streptococcus haemolyticus, Shigella shigea, Samonella typhy, tâc

dung yéu vai Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella sonnai [7],

Bênh viên Thâi Binh dâ làm khâng sinh do so sânh chè vàng vai câc khâng sinh peniciline, streptomycin, clorocid và sulfamid thi thây chè vàng cô tâc dung khâng sinh manh hon câc thuôc trên doi vôi tu càu khuàn và liên câu tan huyê't [8]

□ Tâc dung chông viêm:

Chè vàng cô tâc dùng Chông viêm cap trong mô hïnh gây phù vai

carragenin, kaolin và serotonin Dôi vôi viêm man chè vàng cô tâc dung à mire dô vira Chè vàng gây thu teo tuyên ûc cüa chuôt công non [7].

□ Tâc dung làm lành vêt thuang và bào vê niêm mac:

Dang thuôc mô chè vàng cô tâc dung thuc day quâ trïnh hàn gân vêt thuang trên da dông vât thi nghiêm Ngoài ra dang cao côn 90° cüa thân và lâ côn cô khâ nâng bào vê niêm mac da dày, chông lai câc yéu to gây loét do u trê dich vi, do thành mach bi hu hai, thiéu mâu [7]

□ Tâc dung dô'i vôi hoat dông cüa tü cung:

Cao nuôc chè vàng 1:1 lieu 0.1g nhô vào 30ml dich nuôi làm giâm co bôp tü cung cô lâp chuôt công tuang tu papaverin Chè vàng không làm co bôp

tü cung nhu ich mâu, chàm mèo, nhung chè vàng không khâng lai tâc dung cüa oxytoxin trên tü cung cô lâp chuôt công Dây là ca sô dê gôp phàn xâc minh giâ tri khoa hoc cüa kinh nghiêm nhân dân dùng chè vàng cho chi em phu nü sau khi sinh dé, dông thôi dùng dé chüa bé kinh hoâc thây kinh dau bung [7]

□ Mot sô'tâc dung khâc:

Chè vàng cô khâ nâng tâng tiét dich mât và cân mât Cô thé coi chè vàng là mot thuôc lai mât

Chè vàng làm mât tâc dung kîch thich co bôp ruôt cüa hai chât acetylcholin

và Bari clorua trên ruôt cô lâp cüa chuôt công trâng

Két quà nghiên cûu vé dôc tînh cap và dôc tmh mân cho thây chè vâng ît dôc [7], Nhung không dùng chè vâng cho phu nû co thai.

1.1.5.2 Cô.ng dung theo kinh nghiêm dân gian

□ Theo Y hoc co truyên:

Nhu chüng tôi dâ dê câp à trên, bô phân dùng cüa chè vâng theo da sô câc

tài lieu là la La chè vàng cô vi dâng, hoi chât, tînh âm, qui kinh tâm, tÿ vôi công nâng khu phong, hoat huyêt, dièu kinh, tiêu viêm, trù mü [8]; thuông duoc dùng sâc uông cho phu nû sau khi sinh nhât là sau khi sinh bi nhiêm trùng, sot cao, viêm hach bach huyêt, viêm tu cung và viêm tuyén sua Ngoài

ra, chè vàng côn duoc dùng cho phu nû kinh nguyêt không dêu, bé kinh hoâc thây kinh dau bung; chûa phong thâ'p, dau nhrïc câc dâu chi và khôp xuong Bên canh do chè vàng côn duoc dùng dun nuôc tâm de chûa ghè lô, chôc dâu,

câc bênh ngoài da [8] Ngoài công dung làm thuôc, thuc té à mot sô nüi hiên

nay chüng tôi thây nglrôi dân su dung câ thân và lâ chè vàng de hâm uông thay chè hàng ngày

□ Mot sô bài thuôc:

1 Bài thuôc chûa kinh nguyêt không dêu, bé kinh dau bung [7],

Sâc côn 300ml, chia ba lân uông trong ngày

2 Dùng lâ chè vâng chûa âp xe vu:

Dùng lâ chè vâng giâ nât roi trôn vôi côn 50° dâp vào noi sung dau ngày 3 lân, dêm 2 lân Thôi gian diêu tri thucmg là 1 ngày - 1 tuân tuÿ theobênh nâng, nhe và duac chûa bàng lâ chè vàng sôm hay muôn Trung bînh tù

1 , 5 - 2 ngày Bênh nhân diéu tri bàng chè vâng thuông hét sot sau 2 già dùng thuô'c Sau khi khôi, công thü’c và sô luong bach càu trô lai bïnh thuông, sua cüng trô lai binh thuông [5].

1.2 TÔM TÂT PHUÜNG PHÂP NGHIÊN CÜU THÀNH PHAN HOÂ HOC

CÂY THUOC

1.2.1 Dinh tmh :

De dinh tînh câc nhôm chât tu nhiên trong cây thuôc truôc hét tién hành bâng câc phân üng hoâ hoc dé xâc dinh duoc bô phân nào cüa cây cô nhüng nhôm chât gï Sau dô ta dinh tmh bàng SKLM hoâc SKG de xâc dinh trong nhôm chât dô cô bao nhiêu vêt chât và vêt chât nào cô dô dâm cao (nông dô

cô thé cao) de tù dô cô dinh huông trong viêc chiét xuât và phân lâp

1.2.2 Dinh luong :

Dinh luong nhôm chât chînh là vân dê quan trong, nô giüp xâc dinh bô phân nào cüa cây cô hàm luong chât dô cao nhât và hàm luong chât dô cao nhât vào thôi diëm nào trong nâm de tù dô cô ké hoach thu hai phù hop

1.2.3 Chiét xuât :

Phuong phâp chiét xuât bao gôm câ viêc chon dung môi, dung eu chiét và câch chiét Câc hop chât tu nhiên cô tînh chât dâc trung khâc nhau và tînh chât càn quan tâm nhât trong chiét xuât là tînh phân eue Tuy theo dô phân eue cüa nhôm chât de chon dung môi chiét thîch hop nhât

Phuong phâp chiét xuât co diën mot duoc lieu de nghiên cüu thâm dô là dùng mot dây dung môi bât dâu tù không phân eue dén phân eue manh ( Vî du dây dung môi : ether dau, ether, cloroform, côn và cuôi cùng là nuôc) dé chiét phân doan câc chât ra khôi duoc lieu

Câch chiét thông dung là chiét nông bàng mây chiét liên tue (Soxhlet) hoâc chiét hôi luu Câch chiét don gian nhât là ngâm phân doan hay côn goi là chiét nguôi Ngoài ra côn chiét bàng dung eu ngâm kiêt, chiét nguoc dông

Dira vào tïnh phân eue cüa dung môi và cûa câc hop chat dé cô thë dur doân su cô mât cüa câc chat trong môi phân doan chiét Vf du : trong dich chiét cloroform së cô mât coumarin, quinon, câc aglycon do glycosid thuÿ phân tao ra, mot sô alcaloid base yéu hoâc trong dich chiét côn së cô mât glycosid, alcaloid, flavonoid, câc hop chât phénol khâc, acid hüu co, tanin Khi cân chiét lây toàn bô thành phân trong duoc lieu thï dùng dung môi thich hop nhât là côn (methanol, ethanol) 80% Côn, nhât là methanol duoc xem là dung môi van nâng, no hoà tan duoc câc chât không phân eue dông thôi cüng cô khâ nâng tao dây nôi hidro vôi câc nhôm phân eue khâc Dich chiét côn dem bôc hoi dung môi së duoc cao toàn phân chira hâu hét hop chât cûa duoc lieu.

Khi cân tâch phân doan câc hop chât trong cao thî sü dung mot dây dung môi không hoà lân vôi nuôc và cô dô phân eue tù yéu dén manh Vf du dây dung môi : ether dâu, ether, cloroform, ethyl acetat, butanol

1.2.4 Phân lâp :

Phuong phâp pho bién nhât de phân lâp chât là dùng sàc kÿ côt Sâc kÿ là mot phuong phâp vât lÿ dùng de tâch riêng câc thành phân ra khôi hôn hop bàng câch phân bô chüng ra hai pha : mot pha cô bê mât rông goi là pha cô dinh và pha kia là mot chât long hoâc khi goi là pha di dông, di chuyën di qua pha cô dinh Trong sâc kÿ côt pha tïnh là chât rân duoc nhôi thành côt, nhô dô

mà cô thë khai triën dung môi liên tue vôi nhiêu hê dung môi khâc nhau tù phân eue yéu dén phân eue manh

1.2.5 Nhân dang

Dâu tiên ta phâi dinh tmh bàng câc phân irng hoâ hoc, SKLM hoâc SKG 1 chiêu khai triën ît nhât vôi 3 hê dung môi khâc nhau hoâc sàc kÿ 2 chiêu vôi 2

hê dung môi khâc nhau de xem chât dô dâ thuc su tinh khiét chua

Sau dô sàc kÿ so sânh vôi chât chuân du* kién Nêu dung nhu du kién, chât

dô së cô cùng giâ tri Rf vôi chât chuan trên câ ba hê dung môi khâc nhau

Dé khàng dinh thêm, tien hành do dô chây chât thir hoâc hôn hop chât thir

và chât dir kién trong cùng diéu kiên dira trên nguyên tâc : 2 chât ràn néu là cùng mot loai hop chât thi diëm chây cûa hôn hop vân không thay doi so vôi diëm chây cüa tùng hop chât riêng rë Su hiêu chînh nhiêt dô trong khoâng

± 2°C Néu hai chât dô là mot thi nhiêt dô cûa hôn hop bàng nhiêt dô cûa chât

1.3 PHUONG PHÂP NGHIÊN CÛU HOP CHAT FLAVONOID TRONG

DUOC LIEU:

Cüng nhu câc hop chât tu nhiên khâc trong duoc lieu, khi nghiên cüu hop chât flavonoid dêu phâi tién hành theo câc buôc sau : dinh tmh, dinh luçmg, chiét xuât, phân lâp và nhân dang

1.3.1 Dinh tmh sa bô flavonoid trong duoc liêu:

Truôc hét bàng phân üng hoâ hoc, vî du: phân ûng Cyanidin, phân üng vôi dung dich NaOH 10%, vôi dung dich FeCl3 5% de xâc dinh bô phân nào cüa cây cô flavonoid Sau dô tién hành dinh tmh bàng SKLM hoâc SKG nhàm xâc dinh xem cô bao nhiêu vét chât và vét chât nào co dô dâm cao nhât, tù do

cô huông di trong viêc chiét xuât và phân lâp

Dô'i vôi flavonoid : SKG hiên nay vân là phuang phâp thông dung trong phân tich Thuông dùng giâ'y Whatman sô 1,3 là thich hop cho hâu hét câc flavonoid Mot sô hê dung môi thông dung vôi flavonoid hay dùng khai trién trong SKG là:

• Acid acetic: nuôc [15:85]

• n-Butanol: acid acetic: nuôc [4:1:5, pha trên]

-8-• Cloroform: acid acetic: nuôc [13:6:1]

• Phénol: nuôc [3:1]

• Acid acetic: acid clohydric : nuôc [30:3:10]

Thuông su dung SKG mot chiêu và hai chiêu trong hai hê dung môi khai trién khâc nhau

SKLM: Mac dù SKG hay duoc su dung trong phân tîch flavonoid nhung SKG không thuân tien do ton nhiêu thôi gian, dô nhay không cao, cho nên ngày nay song song vôi viêc su dung SKG thi viêc âp dung SKLM ngày càng nhiêu vï nô khâc phuc duoc nhûng han ché cüa SKG Thuông sü dung bân mông vôi chat hâp phu là silicagel, cellulose và polyamid SK duoc trién khai trong câc hê dung môi cô dô phân eue khâc nhau Viêc lira chon hê dung môi phu thuôc vào câu truc cüa câc flavonoid và chât hâp phu cüa bân mông

1.3.2 Dinh luong flavonoid:

Câc flavonoid thuông duoc dinh luong bàng mot sô phuong phâp sau:

□ Phuong phâp cân:

Dùng trong truông hop chiêt flavonoid bàng dung môi thîch hop, loai tap chât, dem sây khô tôi khôi luong không ddi roi cân Cüng cô truông hop nguôi

ta thuÿ phân (dinh luong Rutin trong hoa hoè) nuôc duoc loc và lâc vôi dung môi hüu co, bôc hoi dung môi, sây roi dem cân Phuong phâp chî ùng dung cho nhüng nguyên lieu giâu flavonoid và dich chiêt ît tap

□ Phuong phâp do quang:

Tiên hành tao màu flavonoid bàng mot sô phân üng (phân ùng Cyanidin, phân ùng kêt hop vôi muôi diazo ) rôi do mât dô quang ô buôc song thîch hop, dô'i chiêu vôi duông cong chuân cüa mot chât tinh khiét

Phuong phâp do pho tü ngoai: Dua vào dô hâp thu phân tü s hoâc dô hâp thu

E un, à mot buôc song và dung môi qui dinh cho tùng loai flavonoid.

Nhu vây, câc phuong phâp dinh luong flavonoid cho ta biét hàm luong flavonoid trong duoc lieu, xâc dinh duoc bô phân nào cüa cây cô hàm luong

cao nhât và hàm luong cao nhât vào thôi gian nào trong nâm dé tù dô xâc dinh duoc thôi gian thu hâi duoc lieu cho phù hop.

1.3.3 Chiét xuât:

Nguyên lieu: dé nghiên cüu thành phân hoâ hoc cây thuôc trong diëu kiên

cho phép thî nên dùng duoc lieu tuoi Duoc lieu thu hâi xong on dinh bàng câch nhüng vào côn hoâc nuôc dun soi trong vài phüt Sau dô dé râo nuôc và làm khô tu nhiên Trânh su dung nhiêt dô cao dé làm khô duoc lieu Khi thu hâi nguyên lieu phâi loai bô phân bi sâu bênh, vât kÿ sinh ânh huong tôi két quâ nghiên cüxi Xâc dinh tên khoa hoc cüa cây là môt công viêc quan trong phâi làm

Dung môi: Không cô nguyên tâc chung cho viêc chon dung môi chiét xuât

flavonoid vi chung cô dô tan râ't khâc nhau trong nü'oc và câc dung môi hùu

co Nôi chung câc glycosid cô dô phân eue manh hon câc aglycon tuong üng Dôi vôi câc aglycon thï isoflavon, isoflavanon và câc flavon, flavonol cô nhièu nhôm metoxy và ît nhôm hydroxy dêu là nhüng chât phân eue yéu De chiét chung thuông dùng câc dung môi phân eue yéu nhu benzen, cloroform, ethyl acetat Mot sô cô thë tan mot phân trong ether dâu

Câc flavon và flavonol cô nhiêu nhôm hydroxy, câc biflavon, chalcon và glycosid là nhùng chât phân eue manh Chiét chung bàng côn, nuôc hoâc hôn hop côn- nuôc Dung môi cô thë âp dung cho hâu hét câc flavonoid là dung dich côn 80% hoâc 60% (ethanol, methanol) Chiét bàng nuôc nông âp dung tôt vôi câc polyglycosid

Flavonoid do cô câc nhôm OH phénol nên chung tan trong kiêm, loi dung dàc tmh này cô thë chiét chüng bàng dung dich kiêm loâng, nuôc vôi Sau dô acid hoâ dich chiét dë két tüa flavonoid hoâc tâch ra bàng dung môi hüu co ô môi truông acid

Phuong phâp chiét xuât: Thuông dë chiét xuât flavonoid nguôi ta phâi loai

câc tap chât thân dâu bàng ether dâu hoâ hay cloroform truôc hoâc sau khi

-10-chiét flavonoid bàng dung môi thich hop Câch -10-chiét thông dung là -10-chiét nông bàng mây soxhlet hoâc chiét hôi liru Câch chiét don gian nhât là ngâm phân doan hay côn goi là chiét nguôi Ngoài ra côn chiét bàng dung eu ngâm kiêt, chiét ngugc dông.

Môi phuong phâp chiét xuât dêu cô uu diëm và nhuoc diëm riêng Tuÿ vào tînh chât duoc lieu và dung môi dem chiét xuât mà ta chon ra phuong phâp tien loi và hiêu quâ nhât

1.3.4 Phân lâp:

Dé phân lâp tùng chât flavonoid ra khôi hôn hop câc chât, nguôi ta hay âp dung câc phuong phâp sau dây:

Sac ky côt: Câc chât hâp phu thuông dùng là bot polyamid, cellulose,

silicagel, sephadex LH20 và G25 Trong dô polyamid và sephadex LH20 cô thé dùng dé tâch tât câ câc loai flavonoid

Trong sâc kÿ côt, chât hâp phu hoâc chât làm nên cho pha cô dinh duoc nhôi trong câc ong hinh tru Nhô vây mà cô thé khai triën dung môi liên tue vôi nhiêu hê dung môi khâc nhau tù' phân eue yéu dén phân eue manh Tuÿ theo tînh chât cüa chât duoc sü dung làm côt mà su tâch trong côt sê xây ra theo co ché hâp phu (côt hâp phu) hoâc theo co ché phân bô (côt phân bô)

Côt hâp phu thuông sü dung chât nhôi côt là silicagel cô hat 0.063 - 0.200

mm Khi cho dich chiét di qua, do tînh hâp phu khâc nhau mà trong dich chiét câc chât tâch thành câc lôp riêng biêt Câc chât hâp phu manh cô khâ nâng day câc chât hâp phu yêu xuông duôi Khi cho mot dung môi nguyên chât di qua côt, câc lôp chât lân luot duoc kéo ra khôi côt hâp phu và su tâch riêng duoc hoàn chînh

Côt phân bô thuông dùng châ't nhôi côt là sephadex LH20 Khi cho dich chiét

di qua do câc chât cô trong luong phân tü khâc nhau mà trong dich chiét chay qua côt câc chat cô khâ nâng tâch thành câc lôp riêng biêt Khi dùng dung môi

nguyên chât di qua côt, câc chât co trong lirong phân tü lôn sê bi dây xuông truôc, tiê'p theo là câc chât cô trong luong phân tü nhô hon ra sau.

dâ dat dô tinh khiêt chua

Viêc phân tich câc hop chât flavonoid hiên nay tuong dôi nhanh chông

và cô hê thông nhô üng dung và phôi hop câc phuong phâp phân tîch quang pho nhât là pho tü ngoai, công huông tù hat nhân, khôi pho

Pho tü ngoai cüa hàu hét câc flavonoid gôm hai bàng hâp thu eue dai chù yêii:

■ Bàng 1: 300-400nm

■ Bàng 2: 240-285nmKhôi pho rat cô giâ tri xâc dinh câu truc flavonoid nhât là khi luong chât thu chî cô duoc rât ît (<lm g) Hâu hêt câc aglyconflavonoid cho pic ion phân

tü cuông dô manh và thuông dông thôi là pic gôc Ngoài ion phân tü, thuông

cô pic chü yéu (M-H)+ và nêu là dân chât metoxy thi thêm pic (M-CH3)+

PHAN II THUC NGHIÊM VÀ KET QUÂ

2.1 NGUYÊN LIÊU VÀ PHUONG PHÂP THUC NGHIÊM

2.1.2 Phuong phâp nghiên cuu:

2.1.2.1 Dinh tïnh câc nhôm chât tu nhiên theo phuong phâp ghi trong tài lieu thuc tâp duoc lieu[2], bài giâng duoc lieu[ 1 ] và phuong phâp nghiên cuu hoâ hoc cây thuôc [4]

2.1.2.2 Dinh tmh flavonoid bàng sâc kÿ giây và sâc kÿ lôp mông

a giây mot chiêu tù duôi lên và sâc kÿ giây hai chiêu vôi giây Whatman

sô 1 Su dung hai hê dung

môi:-Hê I: Acid acetic: nuôc [ 15 : 85 ]

Hê II: nButanol: acid acetic: nuôc [ 4 : 1 : 5 , pha trên]

Thuôc thü hiên màu: hoi NH3 và dung dich A1C13 3% trong côn

b.Dinh tmh flavonoid bàng sàc kÿ lôp mông: Dùng bàn silicagen chê' sàn phât quang cüa hâng Merck kÿ hiêu 60 F254 Merck Hê dung môi khai triën: Ethylacetat: acid formic: nuôc [6:1:1]

2.1.2.3 Phân lâp flavonoid bàng sâc kÿ côt:

Chat nhôi côt: Sephadex LH20

Côt sàc kÿ bàng thuÿ tinh,.duông kmh d = 2cm, chiêu cao h = 40cm

Dung môi rüa giâi là dung dich methanol 80%

2.1.2.4 Nhân dang flavonoid:

Bàng câc phân üng hôa hoc và phuong phâp quang pho.

Phuong phâp quang pho:

+ Do pho tir ngoai trên mây UV - VIS Spectrophotometer carry IE - varian(Autralia) tai phông Thi nghiêm trung tâm - trucmg dai hoc Duoc Hà Nôi.+ Do pho hông ngoai trên mây FT - IE Spectrophotometer 1650 - Penkin Elmer (USA) tai phong Thi nghiêm trung tâm - trucmg dai hoc Duoc

Hà Nôi

+ Do khôi pho (MS ) trên mây 5989 - B - MS tai phong câ'u truc, Viên hoâ hoc

2.2 THUC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ

2.2.1 Dinh tinh câc nhôm chât tu nhiên trong thân cây chè vàng bàng câc phân ung hoâ hoc:

2.2.1.1 Dinh tinh flavonoid

Cho 2 gam duoc lieu vào mot ông nghiêm to Thêm 5ml côn 90° Dun câch thuÿ trong vài phüt, loc Dich loc thu duoc tiên hành làm câc phân üng:

□ Phân ûng vôi kiêm:

Nhô 1 giot dich chiêt lên tô giây loc, de khô, ho lên miêng lo dung amoniac dàc thây màu vàng tàng lên

□ Phân ûng vôi sàt (III) clorid 5%:

Cho 1ml dich chiét vào ông nghiêm, thêm vài giot dung dich sàt (III) clorid Thây xuât hiên màu xanh rêu

□ Phân trng Cyanidin:

Cho 1ml dich chiét vào ông nghiêm, thêm vài giot dung dich acid HC1 dàc và bot magiê kim loai, dun câch thuÿ vài phüt thây dung dich chuyén màu hông

Scf bô ket luân trong duçfc lieu cô flavonoid.

2.2.1.2 Dinh tînh coumarin:

Cho vào mot binh non cô nüt mài 3g bot duoc lieu, thêm 20ml côn 90°, thînh thoàng lâc De yên qua dêm, loc qua giây loc Dich loc tiê'n hành làm câc phân îîng dinh tînh:

□ Phân ung mà và dông vông lacton:

Cho vào 2 ong nghiêm, môi ong 1ml dich chiét Thêm vào ong thir nhât0,5ml dung dich NaOH 10%, ong thir 2 de nguyên Dun câch thuÿ câ hai ong nghiêm dén soi, dé nguôi, roi quan sât:

- ong 1 : cô tüa duc màu vàng

- ong 2: trong suôt

Thêm vào câ 2 ong nghiêm môi ong 2ml nuôc cât, lâc dêu, quan sât:

- ong 1 : trong suôt

- ong 2: cô vân duc

Acid hoâ ôngl bàng vài giot HCL dâm dâc ôngl së trô lai duc nhuong 2

□ Phân irng vôi thuôc thir Diazo:

Cho vào ong nghiêm 1ml dung dich loc, thêm vài giot dung dich NaOH 10% Sau dô cho vào ông nghiêm 2 giot thuôc thir diazo thây xuât hiên màu

Set bô két luân trong dicçc lieu cô coumarin.

2.2.1.3 Dinh tinh Saponin:

Cho vào ong nghiêm to 5 gam duoc lieu, thêm 10ml côn 70°, dun câch thuÿ 5 phût, loc nông qua giây loc Dich loc dë làm câc phân irng dinh tmh:

□ Phân üng Salkovki:

Lây lm l dich loc cho vào ong nghiêm, thêm 1ml acid sulfuric dâc tir tir theo thành ong nghiêm, thây xuât hiên mot vông nâu dô ô giîra hai lôp chât long

□ Hiên tuong tao bot:

Lây 1ml dich loc cho vào mot ông nghiêm, thêm 5ml nirôc cât Làc kÿ trong 5 phût thây cô côt bot bên

So bô két luân trong duoc lieu cô Saponin.

2.2.1.4 Dinh tinh tanin, duàng khüvà acid hiïu co:

Cho vào ông nghiêm to 2g duoc lieu, thêm 15ml nuôc cât, dun soi truc tiép trên bêp diên trong 5 phüt, loc nông qua giây loc gâp nêp Dich loc dë làm câc phân üng dinh tmh:

□ Dinh tmh tanin:

Phân un g vôi thuôc thü sàt (III) clorid 5%:

Cho vào ông nghiêm 1ml dich loc, thêm vài giot thuôc thü thây xuât hiên màu xanh rêu

Phân üng vôi dung dich gelatin 2%:

Cho vào ông nghiêm 1ml dich loc, thêm vài giot thuôc thü không thây xuât hiên tüa bông tràng

So bô két luân trong duoc lieu không cô tanin.

□ Dinh tmh acid hüu co:

Lây 2ml dich loc cho vào ông nghiêm, thêm ft bot Na2C 0 3 không thây xuât hiên bot khi

So bô két luân trong duçfc lieu không cô acid hïcu co.

-16-□ Dinh tmh duông khü tir do:

Lây 2ml dich loc cho vào ong nghiêm, thêm 2 giot thuôc thu Fehling A

2 giot Fehling B, dun câch thuÿ thây xuât hiên màu dô gach

Sa bô két luân trong ditcfc lieu cô dtiàng khü tic do.

2.2.1.5 Dinh tinh chât béo:

Cho vào mot binh eau 2g duoc lieu, thêm 10ml ether dâu hoâ, dun hôi luu câch thuÿ trong 15 phüt Loc qua giây loc gâp nép Bay hoi dung môi thu duoc cân Hoà tan cân bàng 2ml cloroform, nhô 1 giot lên tô giây bông mô, ho nông nhe dên khô không thây vêt dâu mô

Sô bô két luân trong duoc lieu không cô chât béo.

2.2.1.6 Dinh tinh acid amin:

Cho vào mot ông nghiêm to 3g duoc lieu, thêm 10ml côn 50°, dun câch thuÿ trong vài phüt Loc qua giây loc gâp nép Lây 1ml dich loc cho vào ông nghiêm, thêm vài giot thuôc thü Ninhydrin 2% trong aceton, dun nông, thây xuât hiên màu tîm sâm

Scf bô két luân trong duoc lieu cô acid amin.

2.2.1.7 Dinh tînh alcaloid:

Cân 10g dugc lieu cho vào mot binh non dung tfch 100ml, thêm 50ml

dung dich acid sulfuric 1N Dé yên à nhiêt dô phông trong 30 phüt Dun soi

truc tiép trong 10 phüt Dich chiêt loc qua giây loc vào mot binh gan Kiém hoâ bàng dung dich amoniac dàc Làc kÿ 3 làn vôi cloroform, môi làn 15ml Gôp dich chiêt cloroform, acid hoâ bàng dung dich acid sulfuric 1N Gan lây lôp nuôc acid dé làm câc phân üng dinh tmh: