MUC LUC 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.6.1 1.6.2 1.7 1.7.1 1.7.2 2.1 2.2 2.3 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.2 Trang 2 5 8 ,^ Dõt Van De Phn I: l ong Quan ti Lieu Dõc rợiởm thuc võt -Nguụn goc v phõn bụ -Bụ phõn dựng - Trụng trot - Thnh phõn hoõ hoc - Tac dung cỹa Neem - - Tac dung Y hoc Ung dung Nụng nghiờp v mot so nghiờn cỷu diởn hợnh- - Chiột xuõt v cõc chộphõm tir Neem 14 Chiột xuõt 14 Cõc chộ phm tự Neem -15 Phnll: Nguyờn lieu, Nụi dung v phuong phõpnghiờn , CUU - Nguyờn lieu - 16 Trang thiột bi thf nghiờm - 16 16 Nụi dung v phuong phõp nghiờn cuu -Phn III: Thuc nghiờm, Kờt quõ v bn luõn 19 Thnh phõn hoõ hoc - -19 Dinh tfnh mot so nhụm chat tu nhiờn duoc lieubng ^ cõc phõn rợng hoõ hoc - - -Chiột tõch, phõn lõp v dinh tợnh bng SKLM Alcaloid 26 Dinh luong alcaloid bõng phuong phõp cõn -30 Chiột tõch, phõn lõp v dinh tmh bõng SKLM flavonoid -30 Dinh luong flavonoid bng phuong phõp cõn - 33 Chiột tõch v phõn lõp hoat chat Azadirachtin A lõ Neem - - - -Thỹ tõc dung khõng khuõn v khõng nam 37 Phõn IV: Kờt luõn v de xut 41 Ti lieu tham khõo Phu lue PHU LUC Phu lue : Pho tu ngoai chõ't A6 Phu lue 2: Pho hụng ngoai chat A6 Phu lue 3: Pho hụng ngoai chat A6 Phu lue 4: Pho tu ngoai chõ't XI Phu lue 5: Pho hụng ngoai chat XI DAT VAN DE Cõy Neem (Azadirachta indica A.Juss.) cụn goi l cõy Xoan An Dụ, thuục ho xoan (Meliaceae) c6 nguụn goc Assam v Burma thuục Nam Cõy phõn bụ moi noi tir vựng nhiờt dụi dởn cõn nhiờt dai, cụ khõ nng chiu han rat tụt, co thộ sụng ụ noi dõt dai khụ cn, soi dõ hoõc dõt acid Cõy Neem phõt triởn tụt nhõ't nhỹng vựng cụ luong mua hng nõm tir 400 dờ'n 1200mm [16,23] Neem duoc sir dung y hoc tir rat sụm Nõm 1922, cõc nh khõo co Anh dõ tim thõy cõc sõn phm cỷa Neem cõc di tich khõo co bang dõt sột cụ niờn dai A/ cõch dõy 5000 nõm phợa Bõc An Dụ Tõc dung y hoc cỷa Neem cỹng dõ duoc ghi cuụn kinh Veda cua An Dụ.[23-Neem Historical] Ngõy nay, cõc cụng trinh nghiờn curu khoa hoc dõ chiợng minh duoc tõc dung cỷa Neem dụi vụi sỹc khoố nguụi nhu: tõc dung khõng khun, khõng nõm, chụng virus, chụng kù sinh trựng, giõm dau v chụng viờm [23], Neem duoc sỹ dung de tri cõc bờnh vố da nhu: eczema, võy nờ'n, trựng cõ, chựng viờm da, herpes, phõt ban v nhiờu bờnh khõc[23] Neem cỹng cụ tõc dung dieu chợnh miờn dich, duụng huyờ't, sot v cụ tõc dung bo dụi vụi tim Trong nụng nghiờp, nụ cụ tõc dụng tụi trờn 200 loi cụn trựng [23] Hiờn nay, Neem dõ duoc di thuc v nuục ta (xõ Phuục Dinh, huyờn Ninh Phuục, tợnh Ninh Thuõn) giõo su Lõm Cụng Dinh dem vờ tự nõm 198 lv /v' dõ duoc ụng dõt tờn Viờt Nam l cõy "xoan chiu han" hay cụn goi l cõy Xoan An Trờn thộ giụi dõ cụ nhiờu cụng trinh nghiờn cựu vờ thnh phõn hụa hoc v tõc dung cua cõy Neem.Trong dụ, ụ nuục ta hõu nhu chua cụ nghiờn ciru khoa hoc no duoc tiởn hnh vờ tõc dung cỹng nhu cụng dung cỹa Neem VI võy, tự nhỹng dõc tfnh v cụng dung cỹa cõy Neem, chỷng tụi tiởn hnh dờ ti: " Nghiờn cỹu sa bụ thnh phõn hụa hoc la Neem " vụi cõc mue tiờu sau: Dinh tinh mot sohỗfp chat tu nhiờn hng cõc phõn ỷng hoõ hoc Chiột tõch, phõn lõp v dinh luỗ/ng mot sụnhụm chat hụa hoc Thỷ tõc dung khõng khuan v khõng nõm cỹa dich chiột lõ Neem PHAN 1: TONGQUAN l.l.D õ c diởm thuc võt: Cõy Neem (Azadirachta indica A.Juss) thuục ho Xoan (Meliaceae).Tờn dụng nghla: Antelaea azadirachta (L.) Adeldert; Melia azadirachta L hoõc Melia indica Brandish Tờn thuụng goi:-Tiộng Anh: Neem, Indian lilac -Tiộng Phõp: Azadira d'inde, margosier -Tiộng Duc: Niembaum -Tiộng Tõy Ban Nha: Margosa, nim [13,16,23] Cõy Neem l mot loai cõy nhụ dộn trung binh, thuụng xanh tụt quanh nõm Thõn cõy cụ thộ cao tụi 30m, ducmg kmh thõn cụ tụi 90cm,vụi tan la xoở rụng tụi 20m Thõn cõy duoc bao boc bụi mot lụp vụ dõy, khia rnh ụ phõn gục, vụ ngoi mu nõu sõm, lụp vụ mu dụ nhat, nhua cõy dmh v cụ mựi khụ chiu.[16,23] Bụ rờ phõt triộn v an sõu vo long dõt, giỹp cõy dung vỹng v phõt triởn tụt dõc biờt l ụ nhỹng vựng khụ han, dõt dai cn cụi thõm chợ cõ thõn cõy bi do, bi cõt ngon hoõc gõy, nụ võn sụng v phõt triởn duoc nhụ vo bụ rờ ny [23] La moc xen kố, tõp trung ụ gõn cuụi cua cnh, la kộp long chim lố di 2040cm, mu xanh nhat vụi dụi gõn noi rụ ụ dõy lõ, la khụng cụ long Cuụng l di 2- 7cm, huụng lờn trờn v cụ ợt long Lõ chột 7- dụi, moc dụi, hinh trỷng hoõc hinh mỹi mõc, dụi cong hinh luụi liờm kich thuục 3,5- 10 x 1,2- cm, bụng , cụ rng cua, mỹi nhon Cuong lõ chột rat ngõn, dõy lõ khụng dờu nhau.[16,13,20,23] Hoa moc thnh chựm ụ nõch la, di 30cm, la bõe nhụ v rung sụm Hoa luong tmh v hoa dire moc trờn cựng mot cõy, hoa nhụ, dụi xirng, mõu 5, mu trng hoõc vng nhat, cụ mựi thom nhe Di hoa xờ thu xởp goi lờn nhau, mụng, gn hinh trimg dirac phỹ mot lụp long mõng bờn Cõnh hoa mộm mai, xởp lop lờn nhau, dang thợa, rụng, cụ mot lụp mng mụng phõn hoa bao phu Nhi hoa dmh thnh ong hùnh tru, phõn thu Bao phn 10, du'ục dõt ụng nhi dụi diờn vụi cõc rang cira Bu nhuy ụ.[ 13,16,20,23] Hợnh 1: Thõn dõ bục vụ, la v hoa cỷa Neem Quõ hach mot hat (tụi da hat), nhõn, hợnh elip, di l-2cm, mu xanh lue, vng lue dởn vng hoõc tia chm Vụ boc ngoi mụng, vụ qu giiợa mờm nhõo, vụ quõ ciùng; Hat hợnh trimg hoõc hợnh cu, dinh nhon Vụ ngoi cỷa hat (vụ hụt) mụng, chira mot nhõn (dụi hoõc nhõn), mụi nhõn bõng khong mot nira lirang hat.[16,23] Mot cõy Neem thụng thirụng bõt du quõ sau 3-5 nõm v nhiờu nhõt sau 10-12 nõm v dụ khụi luong quõ cụ thộ lờn tụi 50 kg hng nõm Neem cụ thộ sụng han thộ k.[ 16,23] Hinh 2: Hoa, quõ v hat cõy Neem 1.2 Nguụn gục v phõn bd: Neem duoc cM ng minh l co nguụn goc Assam v Burma (nhỹ'ng vựng dụi nui khụ han ụ Nam A) Tuy nhiờn, nguụn goc chrnh xõc thợ chua chõc A/ , chõn, cụ y kiộn cho rng Neem l cõy ban dia ụ An Dụ Y kiộn khõc cho rõng nụ phõn bụ ụ nhỷng vựng rựng khụ han xuyờn suot ton bụ vựng Nam v Dụng Nam bao gụm cõc quoc gia nhu: Pakistan, Srilanka, Thailand, Malaysia v Indonesia [23] 9, r/ v v O An Dụ, Neem l cõy dõ duoc trụng rụng rõi tự vựng Kerala o miờn Nam tụi dõy Himalaya, tự: nhỷng vựng nhiờt dụi dộn cõn nhiờt dụi, tự vựng nua khụ han dộn nhiờt dụi m uụt v moc ụ dụ cao 700m so vụi mue nuục bien.[23] Thộ k 19, Neem duoc du nhõp tự Nam dộn cõc dõo: Figi, Mauritius v Guyana, Anh dộn Aicõp, Dụng Phi v vựng giõp Sahelian cỷa Tõy Phi, nụi m no duoc phõt triởn mot cõch rụng rõi v duoc du nhõp hoõ, Neem tro thnh mot nguụn cung cap quan vờ gụ v nhiờn lieu cho nguụi.[ 16,23] Ngy nay, Neem duoc trụng ợt nhõt 30 nuục trờn thộ giụi, dõc biờt dõ duoc gidfi thiờu v di thuc vo vựng nhiờt dụi Trung v Nam M Neem l mot nhựng cõy cụ kh nng phõt triởn nhanh nhõt v tụt nhõt so nhựng cõy song nhựng vựng khụ han.[ 16,23] 1.3.Bễ phõn dựng: Tõt cõ cõc bụ phõn cỹa Neem dờu cụ tac dung dụi vụi strc khoờ nguụi Trong dụ, hat v la chựa nhiộu thnh phõn hoõ hoc khõc (Azadirachtin, Limonoid, terpenoid ) v l bụ phõn su dung chmh, duoc dựng chựa cõc bờnh ngoi da, bõo vờ võt nuụi, chụng cụn trựng - Hat lm thuục chụng cụn trựng, dựng y hoc Vụ v cnh non duoc dựng lm kem dõnh rang v cõc chat bõo vờ rang loi v lm m phõm - Quõ cụ thở an duoc v dựng y hoc Lõ dựng lm m pham, thuục sõt trựng bõo vờ cõy trụng - v võt nuụi Dõu Neem dựng dở lm x phụng, nguyờn lieu cho cõc sõn pham thuong mai nhu: m pham, thuục sõt trựng dựng nụng nghiờp, bõo vờ dụng thuc võt v dựng chõm soc sực khoộ nguụi [23] 1.4 Trụng trot : Cõy Neem rõt dờ trụng, cụ thở duoc trụng bng hat, cõy con, bng chụi hoõc bõng nuụi cõy mụ nhõn tao Tuy nhiờn, trụng bng hat l phuong phõp phụ bien v thụng dung nhõt, hat duoc gieo truc tiờp trờn cõc vựng gieo trụng hoõc trờn cõc cõnh dụng hoõc cụ thở duoc cõy ghộp tự cõc vu'ụn Uỹm Dở trụng bng hat nguụi ta thu hõi quõ dõ chfn hoõc luom nhõt nhỹng quõ chm tu rung xuụng Sau dụ, cho vo nuục co xõt dở rira sach lụp vụ quõ ngoi v cựi quõ thu duoc hat cỷng, chon lõy nhỷng hat trõng sach dở su dung hoõc bao quõn de eho vu sau Tuy nhiờn, hat Neem co thộ sở khụng mm duục nờ'u de lõu hon thõng.[23] 1.5 Thnh phõn hoa hoc Cõc hop chat chfnh Neem thuục dõn chat Triterpenoid m eu thộ l cõc hop chat goi l Limonoid Hoat chat hat Neem duoc chiởt tõch l mot hụn hop gụm chat cụ cõ'u truc khõc l: Azadirachtin A dởn G [27] Trong dụ, Azadirachtin A (Aza- A: C35H440 16) chiởm hm luong lụn (85%) v cụ hoat tfnh sinh hoc manh hon cõ [27,30] Azadirachtin A khụng bờn vụi khụng khi, õnh sõng v dụ am[21], cụ thở bi phõn hu bụi vi khuõn[16] song lai khụng dục dụi vụi dụng võt Mot sụ hoat chat chmh cõy dõ duoc cõc nh khoa hoc trờn thở giụi nghiờn ciru tợm ra: 1.5.1 Azadirachtin[22] 1.5.2 Salanin:[22] salartin 1.5.3 Meliantriol:[22] 1.5.4 Nimbin:[22] 1.5.5 Nimbidin:[22] Ngoi ra, cụn cụ mot so hoat chat khõc nhir: 29- oxymethylene - 11- demethoxy- carbonyl- la - hydroxyazadirachtin (azadirachtin M) v 22,23- dihydro- 23a- dihydroxy-3-tigloyl- 11deoxyazadirachtinin (azadirachtin N).[33] 22,23- dihydronimocinol v desfurano- 6a- hydroxyazadiradione thuục dõn chat cua meliacin 7a- seneciol-(7- deacetyl)- 23-O-methylnimocinolide [11] 11-epi-azadirachtin H v 11- epimer cỹa azadirachtin H [24] Azadironolide [24,25,26,27- tetranorapoeupha- 7a-acetoxy-23^- hydroxy-21,23-epoxy-1,14,20(22)-trien-3,21-dione] Isoazadironolide[24,25,26,27-tetranorapoeupha-7a-acetoxy-21^hydroxy- 1,23-epoxy-1,14,20(22)-trien-3,23-dione] Azadiradionolide[24,25,26,27-tetranorapoeupha-7a-acetoxy- 21,23epoxy l,14,20(22)-trien-3,16,21-trione] [10] - 11 -hydroxyazadirachtin B - 11- tigloyl-3-acetylazadirachtinin - 1,2- diacetyl- 7-tigloyl- 12- hydroxy vilasinin - 23-desmethyllimocin-B.[13] - 13,14-desepoxyazadirachtin-A [32] Nimonol, 6- Acetylnimonol [15] Salanal [29] 1.6 Tõc dung v cụng dung 1.6.1 Tõc dung y hoc: Tự xa xua, cõc bụ phõn cỹa Neem nhu: lõ, quõ, hat, du, rở v vụ dõ duoc nhõc dộn cõc võn ban chự Phan cỹa An Dụ vụi cõc tõc dung chựa bờnh Ngy nay, no duỗ/c rụng rõi nhụ vo cõc tõc dung cụ loi cỹa no nhu: mot chat khỹ trựng hiờu quõ v phụ bien, cụ thở chựa nhiờu bờnh vờ da nhu: nhiờm khuan da, bụng, loột da, eczema Du Neem cụ tõc dung chựa cõc bờnh nhu: trng nhac, vờt loột lõu lnh v bờnh herpes Sau dõy l mot sụ tõc dung diờu tri bờnh cỹa Neem: 1.6.1.1 Tõc dung khõng nõm: Nhiờm nõm ngy cng gia tõng v gõy nhựng hõu quõ nguy hai dụi vụi sực khoộ nguụi Viờc sỹ dung mot sụ thuục khõng nõm tong hop ngy cng khõng thuục cõc chỹng nõm nhụn thuục Neem dõ duoc chựng minh Vụi kột quõ ny, chỹng tụi sa bụ kột luõn vờt hiờn mu ny dộu l Alcaloid Kột quõ Rf cỷa sc k lụp mụng duoc xõc dinh bng 3.1.2.3 Phõn lõp v nhõn dang chõt phõn lõp duoc: Cõn cự vo kột quõ dinh tmh bng sc k lụp mụng (SKLM), tiộn hnh phõn lõp alcaloid bng sc k cụt vụi chõt hõp phu l Silicagel 60 Merck, cụ hat 0.062 - 0.2mm + Dung mụi: chloroform, aceton + Chuan bi cụt' Cụt duoc lõp dựng chõc chõn trờn giõ, lot mot lụp bụng mụng ụ dõy cụt Cõn khoõng 25g bụt Silicagel vo cục cụ mụ, thờm chloroform dộn ngõp bụt Khuõy dộu cho dộn hột bot khi, nhanh silicagel /v9 vo cụt cho nhụi xong cụt khụng duoc cụ bot On dinh cụt 12giụdụng hụ + Chuan bi chat nap cụt: Lõy khoõng 800mg cõn Alcaloid ho tan luong tụi thiởu Cloroform roi trụn vụi lg Silicagel, trụn dộu dộn thu duoc khụ toi dụng dộu Cụt sau ngõm xong duoc rut Chloroform dộn vach Silicagel, nap bụt hoat chõt dõ chuan bi ụ trờn vo cụt, dn dộu thnh mot lụp mụng Thờm mot lụp mụng Silicagel khụng trụn hoat chõt + Triởn khai cụt vụi hờ dung mụi Chloroform - Aceton (6: 4) cho dung mụi chay vụi toc dụ khoõng 20 giot/phỷt + Hựng dich vo cõc ong nghiờm, mụi ong khoõng 3ml + Kiộm tra dich ong nghiờm bng sc k lụp mụng vụi bõn mụng trõng san cỷa Merck, dõ duoc hoat hoõ 110C giụ Khai triởn vụi hờ dung mụi Chloroform - Aceton (6: 4) Soi duụi dốn tÊr ngoai v phun thuục thự hiờn mu, nhựng ong no cụ sụ vờt v Rf giụng thợ gụp chung lai s* + Kột quõ: Ong dộn ong cụ mot vờt vụi Rf = 0.66 - Tõp trung nghiờn cựu cõu truc cỷa chõt ny Dich rựa giõi cỹa chõt trờn duoc gụp lai vo mot cục nhụ, dở bay hoi tu nhiờn thu duoc tinh thở khụng mu hợnh da giõc 28 Bõng 2: Kột quõ Rf cỷa SKLM alcaloid Dụ dõm Al Rf 0.07 A2 0.29 ++ A3 0.44 ++ A4 0.48 ++ A5 0.54 +++ A6 0.66 +++ Vờt +++ Hinh 3: Sac k lụp mụng alcaloid 1: Sac k dụ lụp mụng mot chiờu alcaloid 2: Sac k dụ chat A6 - Dụ tinh khiột cỷa tinh thộ duoc kiởm tra bng SKLM hai chiờu vụi hai hờ dung mụi l CHC13: MeOH : NH4OH [9: 1: 0.05] v hờ Chloroform : aceton [6 :4 ] Hiờn mu bng thuục thỷ Dragendorff Kột quõ trờn sc k dụ chù cho mot vột Kột luõn : Chõ't ny l Alcaloid 3.1.2.4 Sỷbụ nhõn dang Alcaloid: - Chõ't phõn lõp duoc (A6) tan Chloroform, cụ mu hoi vng, phõn ỹng duong tmh vụi thuục thir Dragendorff - Pho tỷ ngoai (UV) ethanol cho cõc dinh hõ'p thu ,max = 204nm v 278nm (phu lue 1) - Pho hụng ngoai (IR) cỷa chõ't A6 (phu lue 2,3) cho cõc dao dụng : 29 + peak ,max = 3426 c6 thở l dao dụng cỹa nhom -OH hoõc amid cụ nhom -CONH + peak -max= 2914 cụ thở l dao dụng cỹa nhom -CH3 + peak Xmax = 1710cm'1l dao dụng dc trung cỹa nhom carbonyl (C=0) 3.1.3 Dinhlutfng Alcaloid lõ Neem: Tien hnh dinh luong bõng phuong phõp cõn Sau chiột xuõt, cụ dich chiột dộn khụ Sõy ụ 40- 45C dộn khụi luỗmg khụng doi Dem cõn ta duoc luong Alcaloid cụ duoc liờu : Vụi khụi luong duoc liờu : a = 20g Hm luong alcaloid duoc liờu duoc tmh theo cụng thỷc (1) Bõng 3: Kột quõ djnh luong Alcaloid ton phõn lõ NeemV Sụ lõn dl Lõn Lõn Lõn Lõn Lõn Lõn TB n (g) 0.111 0.129 0.125 0.123 0.1 0.115 a (g) 20 20 20 20 20 20 X sd c (g) 10.15 10.25 9.98 11.05 10.59 10.99 X% 0.62 0.72 0.69 0.69 0.56 0.65 0.66 0.059 Võy hm luong phõn trõm trung binh mõu duoc liờu : X% = 0.66% 3.1.4 Chiột tõch, djnh tinh flavonoid lõ Neem bng SKLM : 3.1.4.1 Quy trinh chiột xuõt Flavonoid tự lõ Neem: Cõn chfnh xõc khoõng 30g duoc liờu dem chiột nụng cụ sinh hn vụi Chloroform 30 phỹt dở loai chlorophyl Lõy duoc liờu dở bay hoi hột dung m ụ i, chiột tiộp bng bợnh Soxhlet vụi cụn 90 10-12 giụ Rut dich chiột dem cõt quay chõn khụng 70C thu duoc khoõng 40- 50ml dich chiột dõm dc Cho tỹa vụi nuục, loc bụ tựa thu duoc dich loc Lõc ba lõn vụi ether, lõn luỗft vụi 10, 10, 5ml dở loai tap, thu lõy dich chiột nuục Lõc tõm lõn vụi ethylacetat, mụi lõn 20- 25ml cho dộn hột phõn ỹng vụi flavonoid (dựng phõn 30 ỷng Cyanidin) Gụp dich chiột ethylacetat dem cõ't thu hoi dung mụi dộn khụ, thu duoc Flavonoid ton phõn Su dung cn flavonoid ny de dinh luong So dụ 2: Quy trinh chiột xuõt Flavonoid 31 3.1.4.2 Dinh tinh Flavonoid bng SKLM: Ho tan cõn bng Ethylacetat dộ chõm sõc k Chỹng tụi su dung bõn mụng silicagel G60F254 trõng sõn Sõc k duoc triởn khai hờ dung mụi khõc nhau: Hờ 1: Cloroform - methanol (15:1) Hờ 2: Toluen - aceton (19:1) Hờ 3: Toluen - ethylacetat - acid formic (5:4:1) Hờ 4: Toluen - ethylacetat - acid formic (5:6:1) Hờ 5: Ethylacetat - butanol - acid formic - nuục (5:3:1:1) Hờ 6:Toluen- ethylacetat- aceton- acid formic (5:6:2:1) Sau triởn khai, cõc bõn sõc k duoc dở ngoi khụng khicho bay hoi hột dung mụi, quan sõt cõc vột trờn sõc k dụ duụi õnh sõng tỹ ngoai buụcsụng X = 254nm v X = 366nm, hiờn mu bng hoi amoniac Kột quõ cho thõy hờ dung mụi: Toluen - ethylacetat - acid formic (5:6:1) (4) v hờ: Toluen- ethylacetat- aceton- acid formic (5:6:2:1) (6) cho sõc k dụ tõch rụ nhõ't Kột quõ Rf sõc k lụp mụng flavonoid duoc trợnh by bõng Bõng 4: Kột quõ Rf sõc k lụp mụng flavonoid Hờ sụ' Hờ so Vờt Rf Dụ dõm Vờt Rf Dụ dõm FI 0.12 +++ FI 0.08 +++ F2 0.29 +++ F2 0.17 +++ F3 0.47 ++ F3 0.34 + F4 0.51 + F4 0.37 + F5 0.56 + F5 0.39 + F6 0.64 + F6 0.43 + F7 0.73 +++ F7 0.55 +++ 32 Hinh 3: Sõc k lụp mụng flavonoid : Sac k dụ lụp mụng mot chiờu flavonoid duụi õnh sang tỹ ngoai ụ buục sụng A= 366nm 2: Sac k dụ lụp mụng hờ: Toluen- ethylacetat- aceton- acidform ic (5:6:2:1) 3: Sac k dụ lụp mụng hờ: Toluen- ethylacetat- acidform ic (5:6:1 ) 3.1.5 Dinh lirong flavonoid lõ Neem bng phnong phõp cõn: Cõn thu duoc sau chiột dem sõy 40- 45C dộn khụi luỗmg khụng dụi Sau dụ cõn trờn cõn chfnh xõc thu duoc kột quõ: Vụi khụi luong duoc liờu dem cõn : a = 30g Khi dụ hm luong phõn trm Flavonoid mõu duoc liờu duoc tmh theo cụng thirc :( 1) Vụi: a Khụi luong duoc liờu dem dinh luong (g) n: khụi luong cõn (g) c: Dụ m cỹa duoc liờu (%) X: Hm luong flavonoid ton phõn (%) Tiộn hnh dinh luong sau mõu Kột quõ duoc ghi ụ bng 33 Bng 5: Kờt quõ dinh luong Flavonoid lõ Neem Sụ lõn dl Lan Lan Lõn Lõn Lõn Lõn TB Kờt luõn: n (g) 0.78 0.78 0.85 0.85 0.76 0.75 a (g) 30 30 30 30 30 30 x s ri c (g) 10.14 10.56 10.36 10.98 9.86 9.89 X% 2.89 2.91 3.16 3.18 2.81 2.77 2.950.18 Nhir võy ta duoc hm luong phõn trõm trung bợnh cỷa flavonoid mõu duoc lieu l: 2.95% 3.1.6 Chiột tõch, phõn lõp chõt Azadirachtin- A( Aza- A) tir lõ Neem: Theo ti lieu (27) cõc nh khoa hoc dõ tien hnh nghiờn cỹu v dua quy trinh chiờt tõch Aza- A nhu sau: Cõn khoõng 30g lõ Neem dõ duoc lm nhụ Chiột Soxlet vụi 300 - 350ml n- hexan 8- 12giụ Cõt thu hoi dung mụi ụ 45- 50C dởn khụ, thu duoc cõn B dõ loai dõu bộo v phõn dung mụi thu hoi cụn chỹa dõu bộo A Cõn B duoc chiột lõn vụi methanol, loc qua giõy loc duoc bụt D v dich loc C (methanol) Dich loc C (chỷa Aza- A) duoc chiột vụi Ethylacetat lõn, mụi lõn 10-15ml thu duoc E Dich chiột E (ethylacetat) cho loc vụi Natrisulfat khan dộ loai nuục, cõt thu hoi dung mụi thu duoc cõn F Tiộp tue rira (F) bon lõn vụi n- hexan (mụi lõn 15ml), de bay hoi tu nhiờn thu duoc cõn mu vng nhat G Ho tan G methanol, dinh tmh bng sc k lụp mụng chiờu vụi hai hờ dung mụi khõc nhau: - Chloroform- methanol- nuục (65:35:10) - Ethylacetat- aid acetic- nuục (8:2:1) Hiờn mu bng thuục thu Liebermann- Burchardt Kột quõ cho mot vột trờn sc k dụ Tiộn hnh phõn tợch trờn phụ tỹ ngoai v phụ hụng n g o Quy trinh chiột tõch Aza- A tỹ lõ Neem duoc trinh by ụ So dụ 34 Kột qu phõn tich tu ngoai (UV) v hụng ngoai (IR) cỹa chõ't XI (Phu lue v phu lue 5) Tự kột quõ trờn, dieu kiờn gidfi han cỹa de ti chỹng tụi chua thộ xõc dinh duoc cõ'u truc v tờn chõ't Vợ võy, de xõc dinh duoc tờn v cõ'u truc cỷa chõ't trờn cõn phõi cụ nhỷng nghiờn cỷu sõu han v k han 35 Sa 3: Quy trợnh chiột- tõch Azadirachin A 36 3.2 Thu tõc dung khõng khun v tõc dung khõng nam: 3.2.1 Chờ pham thỹ: Lõ Neem khụng lõn tap, duac bo chộ thnh dang dich chiột nuục: duac lieu khụ duac chiột bng phuong phõp ngõm lanh vụi methanol lõn 12gid, mụi lõn 200ml Loai chat mu bng cõch dun vụi than hoat cụ sinh hn lanh 30phỹt Loc lõy dich loc, cõt thu hụi dung mụi, thu duac cõn, thờm nuục vo dộ tao tua, loc lõy dich chiột nuục Dem cụ cõch thu thnh dang cao dc cụ nụng dụ vụi t le 1:1 (lg duac liờu chiột duac 1ml dich chiột) 3.2.2 Khõng sinh chuõn: Dựng khõng sinh Gentamycin 5UI/ml, Tetracyclin 5UI/ml 3.2.3 Chỹng vi sinh võt v mụi trung: - Cõc chựng dựng thi nghiờm l cõc chung chun v cõc chựng nuụi cõy phụng Vi sinh - Viờn Kiộm nghiờm v phụng Vi sinh- Viờn Vờ sinh Dich tờ cung cõp gụm: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa v Candida albicans - Mụi truOng nuụi cõy : Mụi truụng Muller Hintan: Cao thit 2g Pepton Tinh bot 1.5g Thach 17g Nuục cõt vựa dỷ Mụi truụng NaCl 0.9%: 17.5g NaCl Nuục cõt vd 1000ml 9g 1000ml Cõc chựng vi khuõn duac chộ thnh hụn dich nuục muụi 0.9% dở dat 106 - 108 tộ bo/ml, dựng dở thự tõc dung khõng vi sinh võt 37 Dựng phuong phõp khuộch tan trờn mụi truụng Muller Hinton de dõnh giõ hiờu qu cỹa chộ phm thỹ Tõc dung khõng khuõn cỷa chộ phõm thỹ duoc dõnh giõ qua duụng kmh cỹa vụng vụ khuõn duac tao nờn hoat chõt khuộch tõn v ỹc chộ khõ nng moc cỷa vi sinh vt Thf nghiờm duoc tiộn hnh so sõnh dụng thụi cựng diờu kiờn vụi khõng sinh chuan - Tiộn hnh thi nghiờm : Mụi truụng duoc dun soi cõch thu cho dộn mụi truụng dụng nhõt, de nguụi dộn 45C, dụ vo cõc dùa pộtri, mụi dùa 25ml, cõy cõc chỷng vi sinh vt va dõt cõc dùa pộtri vo tỹ õm 30phỹt Dựng khoan tao cõc lụ thach cụ duụng kmh 0.8cm Dựng micropipet nhụ vo mụi lụ thach 80- lOOjal chộ phõm thỹ hoõc dung dich khõng sinh chuõn Cõc mõu thf nghiờm duoc ỹ tỹ õm 37C vụi thụi gian tự 18-24h Duụng kmh vụng vụ khuõn duoc trờn mõy Synbiosis ProtoZONE 4.05 (Europe Continents) Kột qu thf nghiờm duoc ghi bng v bng Bng 6: Kột quõ vụng vụ nõm cỹa nõm Candida albicans Chỹng VSV Candida albicans TB Duụng kmh vụng vụ nõm (mm) KS Gentamycin Dich chiột nirục Sụ Sụ Nụng dụ 1/200 Nụng dụ 1/100 21.73 21.73 21.73 18.93 18.93 21.73 21.72 19.62 17.52 21.37 21.72 21.37 20.13 20.48 19.44 19.09 17.7 17.7 17.27 21.15 21.86 21.5 20.45 17.63 21.10+1.1 20.66+1.17 18.470.97 17.86+0.74 21.18+0.75 21.36+0.62 Nhõn xột: Qua quõ trinh thuc nghiờm chỹng tụi thu duoc kột quõ nhu bng v bõng Tiộn hnh xỷ l sụ lieu bng phuong phõp thụng kờ toõn hoc, so sõnh vụi khõng sinh chuan chỹng tụi thõy kột qu thu duoc rõt khõ quan vụi nụng dụ khõc dộu cụ tõc dung khõng cõc chỹng vi sinh vt trờn 38 Dirụng krnh vụng vụ khuõn(mm) Chung E.coli TB Pseu aeruginosa TB Sta aureus TB Sal typhi TB KS chuõn Dich chiột nirục VSV Nụng dụ Genta Tetra 1/20 1/40 1/80 1/160 1/240 5UI/ml 5UI/ml 30 26.8 18.8 17.06 17.75 17.06 24 31.68 25.76 19.84 17.41 17.41 18.45 24 30.28 25.06 20.19 17.41 17.41 19.15 24 29.24 25.06 17.06 18.84 17.06 18.1 24 29.59 24.72 17.06 20.54 16.36 18.45 24 30.160.94 25.48+0.83 17.2010.53 18.2410.76 2410.00 29.33 24.38 20.14 17.69 15.9 0 28.97 22.97 19.79 16.61 15.9 0 30.74 24.03 19.43 16.96 16.25 0 30.03 23.67 20.14 17.13 16.25 0 30.6 23.92 20.05 16.88 16.53 0 16.17+0.27 0 29.930.77 23.79+0.53 18.59+1.49 18.2511.45 19.91+0.30 17.0510.40 43.74 38.23 25.14 18.6 18.26 24.11 22.04 42.71 37.2 26.52 18.6 19.29 17.22 24.11 42.37 37.54 25.83 19.29 18.26 22.39 24.46 48.22 38 31 19.98 18.6 19.98 22.39 43.4 37.89 26.18 19.63 18.94 23.08 23.77 44.082.37 37.77+0.41 26.9312.32 19.2210.62 18.6710.45 21.36+2.76 23.3511.08 41.48 34.28 27.77 19.88 19.2 20.23 46.63 41.14 29.83 21.26 17.4 20.57 45.6 40.45 28.11 21.94 18.51 20.57 47.31 39.43 30.17 22.97 18.51 20.91 45.262.61 38.83+3.11 28.971.21 21.5111.30 18.41+0.74 20.5710.14 39 1/100 Hlnh 5: Vụng vụ khuan cỹa vi sinh võt 1: Chỹng nam Candida albicans 2: Chỹng Escherichia coli 3: Chỹng Staphylococcus aureus 4: Chỹng Pseudomonas aeruginosa 5: Chỹng Salmonella typhi 40 PHAN 4: KẫT LUN V DE XUT Kột luõn Qua thụi gian tiộn hnh nghiờn cu'u dộ ti, chỹng tụi dõ thu duac cõc kột qu sau: Vờ hoa hoc: - Thnh phõn hoõ hoc lõ Neem cụ : Alcaloid, flavonoid, coumarin, caroten, duụng khỹ v chõt bộo Khụng cụ Glycosid tim, saponin, phytosterol, acid hựu co v anthranoid - Dõ chiột tõch, phõn lõp v dinh tmh bng sc k lụp mụng nhụm Alcaloid - Phõn lõp chõt A6 - Chiột tõch v dinh tmh bõng sc k lụp mụng nhụm flavonoid - Dinh luong Alcaloid vụi hm luong: X = 0.66% - Dinh luong flavonoid vụi hm luong: X = 2.95% - Chiột tõch v tinh chộ chõt Aza A (XI) Vờ tõc dung khõng khuõn: - Dich chiột lõ Neem cụ tõc dung khõng cõc chung vi sinh võt: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa v Candida albicans Kột qu thm dụ tõc dung khõng khun cỹa dich chiột lõ Neem: ễ nụng dụ 1/80, Neem cụ tõc dung dụi vụi vi khun E.coli tuong duong vụi Gentamycin5UI/ml v cụ duụng kmh vụng vụ khun trung binh l 18,59mm ễ nụng dụ 1/40 Neem cụ tõc dung trờn E.coli tuong duong vụi Tetracyclin 5UI/ml v cụ duụng kmh vụng vụ khuõn l 27,72mm ễ nụng dụl/20, Neem cụ tõc dung trờn Sal.typhi manh hon Gentamycin rõt nhiờu v cụ vụng vụ khun l 45,26mm Tetracyclin khụng thõy cụ tõc dung trờn Salmonella typhi 41 + Trong khoõng nụng dụ 1/80 dộn 1/160, Neem cụ tõc dung dụi vụi vi khuan Sta.aureus tuong duong vụi Gentamycin v Tetracyclin v cụ duụng kmh vụng vụ khuan ln luot l 26,93mm v 19,22mm Dụi vụi chỹng Pseu.aeruginosa, Neem cụ tõc dung khõ tụt m hai khõng sinh chun Gentamycin v Tetracyclin khụng cụ tõc dung lờn ễ nụng dụ 1/100, Neem cụ tõc dung dụi vụi nõm Candida albicans cụ duụng kfnh vụng vụ khuan l 21,10mm v 20,66mm De nghi: Trờn dõy mụi chi l nhỷng nghiờn cỷu so bụ vờ thnh phan hoõ hoc v tõc dung khõng khuan trờn mot sụ chỷng vi khuõn v vi nõm Chỹng tụi thõy rng cõn nghiờn cỷu sõu thờm vờ cõc hop chõt lõ Neem cỹng nhu thnh phõn v cụng dung cỹa cõc bụ phõn khõc cỹa Neem nhu tõc dung khõng khun, chụng sot rột v cõc tõc dung khõc 42 [...]... (Neem toothpaste) X phụng Neem dựng cho nguụi v diờt cụn trựng (Neem body soapNeem soap for pests) Neem dang kem (Neem cream) 1.7.2.3 Sõn phdm dựng trong nụng nghiờp:[23] Neem EC (Emulsifiable concentrate) Neem UCA (Urea coating Agent) EXONA conditioner 15 PHAN 2 : NGUYấN LIấU- NễI DUNG- PHlTONG PHP NGHIấN CĩXJ 2.1 Nguyờn liờu: Lõ Neem (Azadirachta indica A Juss Meliaceae) duoc thu hõi tai xõ Phuục... ra rõng: " Triterpenoid tự cõy Neem ỹc chộ quõ trinh cung cõp chõt dinh duụng, phõ vụ nang õu trựng buụm Meduca Terpenoid, Azadirachtin l mot chõt diờu chợnh sinh truụng manh mở ụ cụn trựng v l mot cụng eu l tuụng de ngn chõn su phõt triởn v tõi sinh c a cụn trựng" _ Dr H.Rambold v H.Farster viờn Planck Max thuục Dỷc dõ tõch duoc Azadirachtin tự Neem (Azadirachta indica) Chõt ny duoc phõt hiờn l cụ... da giõc 28 Bõng 2: Kột quõ Rf c a SKLM alcaloid Dụ dõm Al Rf 0.07 A2 0.29 ++ A3 0.44 ++ A4 0.48 ++ A5 0.54 +++ A6 0.66 +++ Vờt +++ 1 2 Hinh 3: Sac k lụp mụng alcaloid 1: Sac k dụ lụp mụng mot chiờu alcaloid 2: Sac k dụ chat A6 - Dụ tinh khiột c a tinh thộ duoc kiởm tra bng SKLM hai chiờu vụi hai hờ dung mụi l CHC13: MeOH : NH4OH [9: 1: 0.05] v hờ Chloroform : aceton [6 :4 ] Hiờn mu bng thuục thỷ Dragendorff... ny l Alcaloid 3.1.2.4 Sỷbụ nhõn dang Alcaloid: - Chõ't phõn lõp duoc (A6 ) tan trong Chloroform, cụ mu hoi vng, phõn ỹng duong tmh vụi thuục thir Dragendorff - Pho tỷ ngoai (UV) trong ethanol cho cõc dinh hõ'p thu ,max = 204nm v 278nm (phu lue 1) - Pho hụng ngoai (IR) c a chõ't A6 (phu lue 2,3) cho cõc dao dụng : 29 + peak ,max = 3426 c6 thở l dao dụng c a nhom -OH hoõc amid cụ nhom -CONH + peak -max=... dựng Neem duụi dang tr uụng dở chụng sụt rột v cõc bờnh vờ gan.[23] 10 Neem cỹng dõ duoc nghiờn cỷu l co tõc dung giõm dau, ha sot v chụng viờm [22] 1.6.1.6 Neem han chờ su sinh de: A7 Cõc nh khoa hoc An Dụ (India's Defence of Physiology and Allied Scienes- DIPAS) dõ tõch duoc mot dich chiột dau Neem (goi l Nim 76) co tõc dung han chộ su sinh sn Cõc thỹ nghiờm c a ho dõ phõt hiờn ra rõng dõu Neem l... dich chiột hat Neem cỹng cụ tõc dung ngõn cn quõ trợnh dộ trựng c a loi ruụi xanh (nhõng) Lucilia sericata gia suc nhu: cựu , dờ > Azadirachtin õnh huụng dộn su dộ trựng c a cõc loi ruụi hỷt mõu nhu: loi Stomoxys calcitrans - Hoat chat Azadirachtin cụn cụ tõc dung tiờu diờt cõc loi cụn trựng nhu: moi, buụm (lepidotera) Bo cõnh cỹng Coleoptera, loi Hymenptera (ong, kiộn ), loi Homoptera (ve sõu, rờp... nhat de chiột ra cõc dang hoat chõ't co bn nhõ't cụ tõc dung chụng cụn trựng Hat duoc nghiờn nhụ v ngõm trong Ethanol hoõc Methanol cụ thộ chiột duoc 0,2-0,6% cõc hoat chõ't chrnh 1.7.2 Cõc chờ phdm tự Neem: [23] 1.7.2.1 Dang bõn thnh phdm: Hat Neem (Neem seed) Dich chiột dõu lõ Neem khụ (Oil Neem Leaf dry extract) Dich chiột hat (Neem seed extract) 1.7.2.2 Thnh phdm:[23] Kem dõnh rõng Neem (Neem. .. dung bõn mụng silicagel G60F254 trõng sõn Sõc k duoc triởn khai trong 6 hờ dung mụi khõc nhau: Hờ 1: Cloroform - methanol (15:1) Hờ 2: Toluen - aceton (19:1) Hờ 3: Toluen - ethylacetat - acid formic (5:4:1) Hờ 4: Toluen - ethylacetat - acid formic (5:6:1) Hờ 5: Ethylacetat - butanol - acid formic - nuục (5:3:1:1) Hờ 6:Toluen- ethylacetat- aceton- acid formic (5:6:2:1) Sau khi triởn khai, cõc bõn sõc k... 300 - 350ml n- hexan trong 8- 12giụ Cõt thu hoi dung mụi ụ 45- 50C dởn khụ, thu duoc cõn B dõ loai dõu bộo v phõn dung mụi thu hoi cụn ch a dõu bộo A Cõn B duoc chiột 6 lõn vụi methanol, loc qua giõy loc duoc bụt D v dich loc C (methanol) Dich loc C (ch a Aza- A) duoc chiột vụi Ethylacetat 3 lõn, mụi lõn 10-15ml thu duoc E Dich chiột E (ethylacetat) cho loc vụi Natrisulfat khan dộ loai nuục, cõt thu... ring õm tmh) Sa bụ kột luõn trong duac liờu khụng cụ Anthranoid Nhõn xột v sa bụ kột luõn: Nhu võy, qua kột quõ thỹ cõc phõn ỹng h a hoc trờn, so bụ kột luõn trong mõu lõ duoc liờu nghiờn cỹu cụ: Alcaloid, dudng khỷ, chõt bộo, Caroten, Coumarin v Flavonoid trong dụ cõc phõn img dinh tmh Alcaloid v Flavonoid l rụ hon cõ Khụng cụ glycosid tim, saponin, phytosterol, acid hỹ'u co v anthranoid Kột quõ ... nghla: Antelaea azadirachta (L.) Adeldert; Melia azadirachta L hoõc Melia indica Brandish Tờn thuụng goi:-Tiộng Anh: Neem, Indian lilac -Tiộng Phõp: Azadira d'inde, margosier -Tiộng Duc: Niembaum... chat h a hoc Thỷ tõc dung khõng khuan v khõng nõm c a dich chiột lõ Neem PHAN 1: TONGQUAN l.l.D õ c diởm thuc võt: Cõy Neem (Azadirachta indica A. Juss) thuục ho Xoan (Meliaceae). Tờn dụng nghla:... ngoai chõ't A6 Phu lue 2: Pho hụng ngoai chat A6 Phu lue 3: Pho hụng ngoai chat A6 Phu lue 4: Pho tu ngoai chõ't XI Phu lue 5: Pho hụng ngoai chat XI DAT VAN DE Cõy Neem (Azadirachta indica A. Juss. )