Tổng hợp một số dẫn chất thế của acid salicylicvà sơ bộ thăm dò tác dụng sinh học

MỤC LỤC PHẦN I ĐẶT VẤN Đ Ể PHẦN II TỔNG Q U A N 2.1 S LƯỢC VỂ LỊCH s NGHIÊN c ứ u VÀ ÚNG DỤNG ACID SALICYLIC 2.2 ĐẠI CƯƠNG VỂ CẮC PHẢN ÚNG THẾ ÁI ĐIỆN TỬ 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu phản ứng điện tử 2.2.2 Phản ứng điện tử (Electrophilic Substitution Reaction) 2.2.3 Phản ứng điện tử lưỡng phân tử 5^2 2.2.4 Các yếu lố liên quan tới phản ứng SE2 ỉ PHẨN III THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 16 3.1 NGUYÊN LIỆU VẢ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 16 3.1.1 Phương pháp thực nghiệm .16 3.1.2 Hoá chất, dụng cụ, máy m óc 18 3.2 PHẢN ỨNG THẾ VẢO NHẢN BENZEN CỦA ACID SALICYLIC 18 3.2.1 Nguyên tắc 18 3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng Ihế điện tử 19 3.3 TỔNG HỢP CÁC DẤN CHẤT THẾ CỦA ACID SALICYLIC 20 3.3.1 Tổng hợp acid - nitro salicylic 20 3.3.2 Tổng hợp acid 3,5 - dicloro salicylic 21 3.3.3 Tổng hợp acid - iodo salicylic 22 3.3.4 Tổng hợp acid 3,5 - dibromo salicylic .: 24 3.3.5 Tổng hợp acid 5- sulfon salicylic acid 5- natrisulfonatsalicylic 25 3.3.6 Tổng hợp acid 5- azobenzen salicylic 27 3.4 KIỂM I RA CẨU TRIJC CỦA CẮC CHẤT TổN G HỢP ĐƯỢC 33 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.4.5 Tính chất vật lý 33 Sắc ký lớp mỏng (SK.LM) 34 Đo phổ hồng ngoại (IR ) 34 Đo phổ tử ngoại (Ư V ) 35 Đo khối phổ (MS) xác định cấu trúc .35 3.5 Sơ Bộ THĂM DÒ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT TổNG HỢP Được 35 3.5.1 Nguyên tắc 35 3.5.2 Thực nghiệm : 35 3.6 NHẬN XÉT VÀ ĐẢNH GIÁ 39 PHẨN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN I: ĐẶT VÂN ĐỂ Hiện nay, nhu cầu thuốc phòng chữa bệnh lớn Bên cạnh thể bệnh đa dạng tính chất bệnh ngày phức tạp nên việc nghiên cưú, lổng hợp để tìm thuốc cần thiết Acid salicylic đưực đưa vào điều trị hạ sốt, giảm đau từ kỷ XIX Do tính chất gây kích ứng da niêm mạc nên người la điều chế dẫn xuất sử dụng dẫn xuất điều trị hạ sốt, giảm đau, kháng viêm Điển hình : aspirin (acid acetyl salicylic) ; natrisalicyỉat; salicylamid; muối calci acelyl - salicylic (Kalmopyrin) Đây dÃn xuất vào nhóm chức (- OH - COOH) acid salicylic Vây dẫn xuất Ihế vào nhân thơm nào? Chúng ta biết phản ứng điện tử phản ứng đặc tiling nhân thơm, lợi dụng tính chất tiến thành điều chế số dẫn xuất acid salicylic dẫn xuất halogen, nitro, sulfon,azo sơ thăm dò khả kháng khuẩn, kháng nấm chúng Với định hướng nlnr vậy, điều kiện thời gian cho phép, chúng lôi tiến hành tổng hợp chất từ nguyên liệu ban đầu acid salicylic Và thăm dò tác dụng sinh học chúng Hy vọng lằng hợp chất với tác dụng sinh học định nghiên cứu tiếp sâu để có ứng dụng y học PIIẦN II: TỔNG QUAN 2.1 S LƯỢC LỊCH s NGHIÊN c ứ u VẢ ÚNG DỤNG CỦA ACID SALICYLIC A dd salicylic lần phân lập từ salix alba (cây liễu trắng) vào năm 1838 Trong vỏ chứa glycosid salycin, thuỷ phân thu alcolphenol saligenin C6H4(OH)CH2OH Khi oxy hoá saligenin thu acid salicylic CH2OH c o o ii cho O il [Ol Ẳ J )IĨ [O] _o h o salicylaldehyd Sau vài năm acid salicylic đưa vào sử dụngvà đến năm 1858 Kolbe tổng hợp đường hoá học Ngày việc điều chế acid salicylic tiến hành phản ứng Kolbe - Schmidt từ natri phenolat khí C áp suất nhiệt độ cao Quá trình thấy rõ dãy phản írng sau: ,OII -ONa + NaOH + h 2o 011 I25°c 6-7 atm - COONa + h 2s o COOH Từ acid salicylic người ta điều chế số dẫn xuất đưa vào sử dụng có hiệu điều trị với tác dụng : hạ sốt, giảm đau, chống viêm Bản thân acid salicylic có tác đụng kháng khuẩn nên sử dụng điều chế số chế phẩm dùng Hiện có nhiều thuốc mà đỏ thành phần dãn xuất acid salicylic Điển hình aspirin (xem thêm phần phụ lục) Chủ yếu dẫn xuất acid salicyliclà dãn xuất nhóm chức phenol (- OH) carboxyl (-COOH) phân tử acid salicylic Trong khuôn khổ khoá luận này, tiến hành lổng hợp dẫn xuấl Ihế acid salicylic vào vị trí nhân Ihơm phân tử acid salicylic Cơ chế phản ứng chế phản ứng điện tử 2.2 ĐẠI CƯƠNG VỂ CÁC PHẢN ÚNG THẾ ÁI ĐIỆN TỬ 2.2.1 Lịch sử nghiên cứu phản ứng điện tử.[ 101 Lịch sử nghiên cứu phản ứng điện tử gắn liổn với việc tìm benzen hợp chất ihơm Năm 1825 Michel Faraday (Anh) lách riêng chấl đặt tên benzen Năm 1834 Benzen giới thiệu có thành phần C,H với công thức phân lử C6H6 Năm 1865 Kekule đã'tìm cấu trúc benzen cấu trúc vòng kín cổ nối đôi xen kẽ có cấu trúc chặt chẽ Sau công trình cấu trúc Kekule - Butlerop - Couper nửa sau kỷ XIX nghiên cứu phản ứng ứng dụng benzen hợp chất thơm, phát phản ứng đặc trưng ben zen phản ứng điện tử 2.2.2 Phản ứng điện tử (Electrophilic Substitution Reaction).[2] Phản ứng điện lử xảy tác nhân mang điện tích dương công vào trung tâm có mật độ điện tử lớn Có hai loại phản ứng điện tử: * Phản ứng điện tử đơn phân lử Sp l Phản ứng gồm hai giai đoạn, giai đoạn đầu tạo thành sản phẩm trung gian carbanion R (anion có nguyên tử c tích điện âm) Chậm R-X R-+ X + X Giai đoạn hai tác nhân điện tử nhanh chóng phản ứng với carbanion tạo thành sản phẩm phản ứng: R + x+ — i R- E Thế điện lử Sgl, Sp2 thường xảy nguyên tử Carbon bão hoà, thí dụ phản ứng retroaldol hoá, decarboxyl hoá, phản ứng tạo haloform, halogen vào ceton Phản ứng SE1 ta nói qua, chủ yếu xem xét kỹ phản ứng Sj;2 aromatic * Phản ứng điện tử lưỡng phân tử SE2 [2] [10] - Phản ứng xảy hợp chất thơm đặc trưng cho hợp chất thơm Ta xem xét kỹ loại phản ứng - Trước hết phải tìm hiểu cấu tao vòng benzen : Phản ứng điện tử nhân thơm nghiên cứu kỹ qua thực nghiệm với vào benzen + 111ực nghiộm chứng minh benzen có cấu tạo vòng kín với cacbon Sáu liôn kết c - c nhân có độ dài nhau: 1,397A° giá trị trung gian liên kết đơn (1,54 A°) liên kết đôi (1,32A°) ' + Benzen có cấu tạo phẳng + Mỗi nguyên tử Carbon trạng thái lai hoá sp2 lạo liên kết với nguyên tử hyđro Sáu điện tử p lại có trục vuông góc với mặt phẳng plìân tử Sự xen phủ orbital p nhân thơm biểu diễn: Vòng tròn biểu thị hệ điện tử liên hợp Sự có mặl mật độ điện tích âm cao hai phía vòng phẳng tạo nguyên lử carbon tính chất đặc biệt phân tử benzen Nó dễ dàng bị công cation E+tức tác nhân điện lử benzen chịu phản ứng nhiều phản ứng cộng hợp - Cơ chế phản ứng điện tử hợp chất thơm Như vậy, tác nhân mang điện tích đương dễ dàng vào benzen phản ứng điện tử Sp xảy qua bước: E+ + E+ ■'s- -H + -Ì* nhanh Phírcơ + Bước 1: E+ +E+ V A Phức Ơ Trong bước này, E+ sử dụng điện tử 71 hệ điện tử thơm tạo liên kết carbon vòng Sự phá vỡ hệ thống điện tử 7t tạo phức ơ, carbon lai sp3 liên kết với E+, điện tử n lại phân bổ khắp carbon có lai hoá sp2 Cấu trúc thơm bị phá vỡ, phức carbocation không bền vững Phức biểu diễn theo công thức đây: © A © V © H A H H Phức Bước 2: + H+ H E Phức protor^hệ thống orbital Tí không định chỗ phục hồi sản phẩm tạo thành có tính bền vững cao Vậy E thay cho hydro nhân benzen hydro tách dạng proton Phức giai đoạn chuyển tiếp, tồn ngắn ngủi Ý nghĩa phức chỗ lượng giải phóng đo tạo liên kết C-E sử đụng để phá vỡ liên kết đơn C-H, phá vỡ Hên kết không kèm theo tạo thành đồng thời liên kết C-E thực khó khăn Sự tăng tính bền vững phân tử chuyển từ phức đến sản phẩm đền bù cho tiêu hao lượng cần thiết để bẻ gãy liên kết C-H loại H+ (trong trường hợp hợp chất không thắng tương tự mặt lượng tăng tính bền vững sản phẩm phản ứng cộng hợp xảy Ví dụ phản ứng alken acid clohydric) Điều có nghĩa phức nằm vùng lượng hai giai đoạn ciiuyển tiếp biểu diễn qua biểu đồ hiệu lượng Năng lượng hoạt hoá phản ứng tạo từ benzen E+ (Eact 1) nhận thấy lớn nhiều lượng hoạt hoá để đưa phức đến sản phẩm (Eact 2) Tiến trình phản ứng Tại điểm 1, liên kết E+ carbon benzen tạo điểm liên kết C-H bị phá vỡ Trong phản ứng nitro 1ioá,Eact lớn nhiều Eact nlnrng phản ứng sulfon hoá Eact xấp xỉ Eact 2.2.3 Phản ứng điện tử lưỡng phân tử Sp2 [2] [5] [10] [14] * Phản ứng nitro hoá Nitro hoá phản ứng hệ thống thơm nghiên cứu rộng rãi Phản ứng làm sáng tỏ chi tiết chế phản ứng điện tử Tiến hành nitro hoá hỗn hợp H2S H N 03 gọi hỗn hợp nitro hoá Ta giải thích có mặt H2S sau: H N + 2H2S H3ỏ + 2HS04~~ + +N ion nitroni Sự có mặt N 2+ dung dịch xác định phương pháp quang phổ N 2+ tạo thành từ H N trở thành tác nhân điện tỉr có hiệu lực Cơ chê phản ứng: + H N + H2S 50-60°C + H3()+ + H S0 \ Bước 1: H - O - N + HOSO^H * H - o - N + HSO, H + Bước 2: H - o - N + H2S 04 N 2+ + H S04~+ H30 + H Trong bước 1, H N 03 bazo nhận proton từ H2S 04 acid mạnh, bước tạo ion nitroni Bước 3: lon nitroni cồng orbital ĨI benzen N 02 4_J Châm - :— ► Phức Bước 4: Phức mấl proton tạo nitro benzen NO, + liso; NO, Nhanh + II2SO„ Phức Những aciđ mạnh khác (ví dụ HC104) làm nhanh phản ứng nitro hoá Thực nghiệm khẳng định giả thiết này, HF BF3 chất xúc lác có hiệu * Phản ứng Sulfon hoá: Các chi tiết tinh vi phản ứng sulíon hoá không nghiên cứu đầy đủ phản ứng nitro hoá Hiện tranh luân là: ion bisulfoni +H S03 phân tử S O thực hiên lấn công điện tử? Phần lớn kiên hiên có chứng tỏ điều kiện thường sulfon hoá phân tử SO3 tạo phản ứng tác nhân điện tử s o 3h + H2so< Bước 1: 2H2SO/4 ^ + h 2o H ,0 + + H S04- + SO3 Bước 2: chậm _ ^ phức Bước 3: nhanh I i s o r — —► + n2so4 Bước 4: + HX> SO,H nhanh \ + H?0 Phân tử SO3 biểu diễn: S3(+) s — o o ô(.} ô(-) Nguyên tử s đặc trưng tính thiếu điện tử mạnh nguyên tử liên kết với c vòng thơm Phản ứng sulfon hoá khác biệt với phản ứng nitro hoá tính chất: + Phản ứng sulfon hoá thuận nghịch + Phản ứng sulfon hoá bị chậm thay nguyên tử hydro vòng thơm đồng vị phóng xạ triti (3H) Sự tách proton từ phức (được tạo benzen SO3) giai đoạn xác định tốc độ sulfon hoá *Phản ứng halogen hoá: Halogen hoá tiến hành có mặt chất xúc tác acid lewis ZnCl2, FeBr3, A I C I , FeCl3 acid lewis gây phân cực phân tử halogen, làm tăng tính điện tử Sau phân tử bị phân cực công điện tử 71 vòng thơm nhờ phần mang điện tích dương + HX X halogen X=F, Cl, Br, I Tuy nhiên Flo công liên kết C- c thái biến hợp chất thơm Do ta điều chế dẫn xuất Flo xác định hợp chất thơm H o hoá trực tiếp Clo, Brom, Iod phản ứng chậm dung môi không phân cực Do tác dụng dung môi phân cực mạnh xúc tác acid lewis mà halogen bị phân cực mạnh giúp cho phản b) Copul hoá: COOH OH cr+ (+ NaC!) C6H,N=N C13H9 N2NaO? - Lượng hoá chất: Anilin: M=264 9,3(g) (0,1 moi) Acid clohydric 22,5ml (d=l ,18) Natri nitrit 7(g) Natri carbonat 3(g) Acid salicylic 13,8(g) 0,lmol đd NaOH (36%) 16,5ml - Tiến hành + Trong cốc có dung tích l50-200ml Hoà tan Anilin hỗn hợp gồm 22,5ml adid clohyđric đậm đặc 22,5ml nước Làm lạnh dung dịch đến 0°c Vừa khuấy vừa rót vào dung dịch làm lạnh gồm 7(g) natri nitrit 20m! nước (ở nhiệt độ không 2°C) (Kiểm tra kết thúc phản ứng diazo hoá giấy kali iod tinh bột) + 10 phút sau kết thúc phản ứng diazo loại acid clohydric thừa cách cho natri carbonat, sau dung địch phải cho phản ứng acid yếu với thị Congo (A) + Làm lạnh đến 0°c dung dịch gồm 13,8(g) acid salicylictrongI6,5ml đci xút 36% 35ml nước Sau cho thêm 1(g) natri carbonat (chú ýnhiệt độ phải giữ không (5°C) (B) + Rót từ từ dung dịch A vào dung dịch B + Sau Đem lọc kết tủa phễu Buchner + Tinh chế cồn 70°c 28 + Sấy tủa 5Ơ-60°C tủ sấy - Kết quả: Thu tủa màu vàng sẫm Khối lượng tủa sau sấy khô 16(g) Hiệu suất phản ứng 60,6% T° * nc*: 290°c SKLM hệ dung môi triển khai cloroform: methanol (8:2) có xuất vết riêng sản phẩm Phổ từ ngoại UV: ^™ (nm ): 355;256,*224^203 * Kết tổng hợp tóm tắt bảng I (trang sau) 29 Bảng : STT CÔNG THÚC BẢNG TÓM TẮT CÁC CHẤT Tổb M (KLPT) TÊN GỌI THỜIG1AN DUNG MÔI PHẢNŨNG KẾTTINHLẠ1 COOH QjN^ỏ r 183 acid - nitro salicylic 20’ ethanol 207 acid 3,5 - dicloro salicylic 20’ ethanol 264,03 acid - iodo salicylic 1h ethanol 295,91 acid 3,5 - dibromo salicylic 1h ethanol acid - sulfon salicylic 5h nước cất lạnh 240 acid - natri sulfonat salicylic 6h nước cất lạnh 264 acid - azobenzen salicylic 2h ethanol COOH o iố c COOH ,JGỐr0B COOH *JỈ5 c COOH HO^ ị r 254,22 COOH r COOH - ỉ Bảng : KẾT QUẢ SẮC KÝ LÓP MỎNG DẪN CHẤT THẾ Rj=-H DƯNG MÔI TRIỂN KHAI TỈLỆ Rf sàn pHám Rf Nguyen liCu Cloroform : methanol :2 0, 63 0,70 Ethyl acetat: methanol :2 0,81 0,76 Ethyl acetat: methanol :2 0,69 0, Ethyl acetat: methanol :2 0,79 0,76 R2= -N02 R,= R2= - d R,= -H R2=-I COOH iỐr0H R ị = R — ■B ỉ R1=-H R2= -SỌjH Ethyl acetat: methanol 7,5 : 2,5 0, 71 0, 83 R,= -H R2= -SOjNa Ethyl acetat: methanol : 0, 83 0,76 R2= C ^ =N- Qoroform : methanol :2 0,65 0,70 R,= -H Bảng : KÊT QUẢ ĐO PHỔ TỬNGOẠI V V Eton max DẪN CHẤTTHẾ ^ NGUYỀN LIỆU ĐẦU Rị= -H R j = COOH J R,= -H R2= -N 303 ; 234 ; 211 ti 306 ; 220 ; 203 318 ; 230 ; 217 R2= - I R,= -H R2= -SOjH Rt = - H R-2= - SOjNa Rj =- H H, r 2= -Cl Rị —R 2= - Bĩ k (, nm), R2= CyạjN = N- 31 tị 316 ; 223 ; 216 lị 320 ; 213 rị 305 ; 234 ; 215 304 ; 234 ; 210 tị 355 ; 256 ; 224 ; 203 Bảng Kết phân tích khối phổ (MS) chất acitl 5- nỉtro salicylic acỉd 3, 5- dibronio salỉcylic Cấu trúc dự kiến COOI1 o,N© m/z Nguồn gốc 183 M+ (ion phân tử) 165 [M-H2o ] + 79 [C6H7]+ nhân benzen Thông tin cho biết Khối lượng phân tử Nhóm hydroxyl: -OH Nhân benzen (C ] gắn thêm H+ r 46 [N 02r 30 [NO]+ ion mảnh từ Nhóm nitro: -N nhóm -N 02 296 M+ (ion phãn tử) Khối lượng phân tử 278 [M-H2o r Nhóm hydroxyl -OH 294 M 296 M+2 298 M+4 (Tính the đồ ng vị nhẹ COOH bron1, tỷ lệ cường Br độ c:ác đ Inh trên: Phân tử có nguyên tử Bi M+2 M M+4 45 [COOH]+ 32 Nhóm carboxyl: - c o o n 3.4 KIỂM TRA CẢU TRÚC CÁC CHẤT TổNG HỢP Được 4.3.1 Tính chất vật lý: - Trạng thái, màu sắc: Các dẫn chất acid salicylic tổng hợp dạng rắn kết tinh, tinh thể hình kim bột mịn có màu trắng vàng nhạt đến màu vàng sâm mô tả bảng - Độ tan 4- Hổu hết chất tổng hợp tan tốt ethanol duvig môi hữu khác + Gần không tan nước lạnh 4- Độ tan cloroform benzen tuỳ thuộc vào chất Glii chú: (-) Không tan; (+) tan; (++) tan; (+++) dễ tan - Nhiệt độ nóng chảy Chúng khảo sát sơ nhiệt độ nóng chảy chất tổng hợp phương pháp mao quản Sau xác định lại rtiáy đo nhiệt độ nóng chảy máy Gallen Kamp Kết thu glii chi tiết Bảng 3.4.2 SKLM Chííng dùng mỏng với chất hấp phụ Silicagel (Bản mỏng Kieselgel 60F254 - Merck) với hệ dung môi tích hợp, với tỷ lệ thích hợp Phát soi đèn tử ngoại bước sóng 254nm màu lod bão hoà Kết thu sau (bảng 3) 3.4.3 Phổ hổng ngoại IR Phân tích quang phổ hồng ngoại chất tổng hợp máy Perkin Elmer với kỹ thuật làm viên nén KBr, đo vùng 4000-400 cm' trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm Hà Nội với giúp đỡ TS Đỗ Ngọc Thanh Do điều kiện hạn chế, nên tiến hành đo phổ IR chất (II, V, VII) Đó chất trình bày bảng sau (bảng 4) Qua nhân thấy chất tổng hợp có giải hấp thụ đặc trưng vùng tương ứng với nhóm chức cấu trúc dự kiến tổng hợp Hảng 4: Kết phân tích phổ hồng ngoại (IR) v“ (cm ’) Sản phẩm II COOII Nhóm chức V COOH VII COOH J jO l 3200 ĩìr X ^ X -ĩir 3250 O-H (-COOH) 3100-2500 3100-2500 3100-2800 c = (-COOH) 1674 1660 1671 1622; 1580 1544; 1570 1608; 1600; O-H (OH phenol) c ~ ~ c aromatic (nhân benzen) 3508 1580 C-O (phenol) 1193 1177 s = (trong SOr OH) 1225 C-Br (Bromo) NO? aromatic (nitro thơm) 1163 709; 680 1513;1338 34 3.4.4 Phổ tử ngoại v Các dẫn chất acid salicylic tổng hợp tiến hành phân tích phổ tử ngoại máy Gary 1E UV-Visible spectrophotometer vùng 200-400nm, thực phòng thí nghiệm trung târp trường Đại học Dược Hà Nội Kết ghi chi tiết bảng 3.4.5 Đo phối phổ (MS) Do điều kiện kinh phí hạn chế thời gian cho phép tiến hành đo khối phổ cho chất: acid 5-nitro saỉicylic, acid 3,5 dibromo salicylic Đo phòng cấu trúc - Viện hoá học - Trung tâm Khoa học Tự nhiên Công nghệ Quốc gia Kết ghi lại bảng 35 Sơ B ộ THẢM IX) TẢC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT TổNG HỢP ĐƯỢC: Với giúp đỡ tổ môn vi nấm, kháng sinh trường Đại học Dược - Hà Nội với điều kiện thực tế cho phép, tiến hành thử số tác dụng sinh học: lác dụng kháng nấm, kháng khuẩn chất lổng hựp đưực, qua mong muốn sơ tìm mối liên quan cấu trứchoá học lác dụng sinh học chúng Phương pháp thử áp dụng theo DDVN II / tập III 3.5.1 Nguyên tắc Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chất lổng hợp xác định phương pháp khuếch tán thạch (với khoang giấy chất thử) đục lỗ thạch Khả ức chế đánh giá đường kính vòng vô khuẩn vô nấm 3.5.2 Thực nghiệm * Chủng vi sinh vật sử dụng - chủng vi khuẩn Gr(+) + Bacillus pumilus NCTC 8241 (Bp) + Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc) + Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs) 35 + Sarcina lulea ATCC 9341 (SL) + Staphylococcus aureus ATCC 12228 (Sta) - chủng vi khuẩn Gr(-) + Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Bre,u) + Escherichia coli ATCC 25922 (Ec) + Salmonella typhi DT 220 (Typh) + Proteus mirabilis BV 108 (Pro) + Shigella ĩlexneri DT 112 (Shi) -1 chủng nấm +Candida albicans ATCC 10231 (Can) * Môi trường dinh dưỡng: - Môi trường canh thang cao thịt - pepton (MT1) - Môi trường Muller - Hinton (M - H) - Môi trường Sabouraud (MT3) * Nuôi cấy vi sinh vật kiểm định Các vi sinh vật kiểm định nhận từ Viện kiểm nghiệm, Viện vệ sinh dịch tễ, Viện mắt, Bộ y tế, Viền 108 trước thử nuôi cấy nhân giống cách cấy vào ống thạch nghiêng với môi trường MTt (áp đụng cho vi khuẩn) môi trường Sabouraud (áp dụng cho vi nấm) nhiệt độ Ihích hợp thời gian 24h Sau làm thành nhũ dịch vi sinh vật với nồng độ 107-108 tế hào /ml với tỷ lệ 1% so với môi trường * Chuẩn bị chất thử: Các chất đem Ihử bao gồm chất (II, III, IV, V VII, VIII) pha thành nồng độ 4mg/ml 2mg/ml Irong dung môi DMF tiến hành thử lần - Lần 1: Tiến hành thử với nồng độ 4mg/ml theo phương pháp giấy tẩm chất thử Thấm địch thử vào khoanh giấy lọc No 5, đường kính 7mm (đã tiệt trùng ) với lượng nhau, để bay dưng môi - Lần 2: Tiến hành thử với nồng độ 2mg/ml theo phương pháp đục lỗ thạch Đục lỗ thạch thành ỉỗ có đường kính 7mm 36 * Tiến hành: Các môi trường hấp tiệt Irùng lat, 120°C/20' Trên hộp Petri đổ tờ 9-10ml MT1 để làm phẳng, để khô Sau cho vào hộp Petri 8-10ml môi trường M - H (đối với vi khuẩn) MT3 (đối với vi nấm) trộn nhũ dịch vi sinh vật kiểm định (nồng độ 1% so với môi trường) láng đợi thạch nguội - Đối với lần 1: Đặt khoanh giấy tẩm dung dịch chất thử lên bề mặt Ihạch phân bố cân đối theo sơ đồ định - Đối với lần 2: Dùng dụng cụ đục lỗ(d = 7mm) đục lỗ thạch Sau dùng pipét nhỏ mộl giọt dung dịch chất thử vào lỗ thạch (20 giọt/ml) theo sơ đồ định - Để đĩa Petri nhiệt độ phòng khoảng 2h hoạt chất khuyếch tán vào môi trường Đọc kết sau 18-20Ỉ1 nuôi cấy ỏ nhiệt độ Ihích hợp: 3537°c (đối với vi khuẩn) 25-30°C (đối với vi nấm) Đo đường kính vòng vô khuẩn xác đến 0,imm - Song song điều kiện tiến hành ih mẫu trắng DMF mẫu đối chiếu acid salicylic (I) * Kết quả: - Kết thử nghiệm ghi lại bảng bảng 37 Bảng : KẾT QUẢ KHÁNG KI IUẨn , K1 IÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT THỬ NồNG ĐỘ mg / mi ( Kết đo đường kính vòng v ô khuẩn xun ) VI KHƯẨN Gr( + ) s lutea B subtilis Sta aureus Pseu E coli s typhi - - - - - - - - - Ỷ ACID SALICYLIC - - - - - - - - + 10 - - - 10 - - - + - 20 - - - - - + - - 23 - - - - - + - - 23 - - ■- - - + R2= qjIỊjN -N 13 11,2 12 20.1 26.3 - - - - Ỷ R2=-SO^Na + - - R2=*-N02 Rj - R 2= - C1 R|= - H R2= -I * ~ NJ 73 o ĩ ?■ Can B cereus - Rị - -H & NẤM MẲƯ TRẮNG DẪN CHẤT THẾ COOH VIKHƯẦN Gr ( - ) B pumilus VI SINH VÂT KIỂM ĐỊNH R] = R ị * • Br R,»-H Rt = - H Bảng : + Ỷ + KẾT QUẢ KHÁNG KHUẨN , KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT THỬ Ở NồNG ĐỘ mg / xnl ( Kết đo dường kính vòng vô khuẩn nm ) ĩ Can s typhi E coli Pseu Sta aureus B subtilis s lutea o NẤM - - - \CID SALĨCYLIC 10.65 9 9.65 t - i - 11.8 11 16 10.7 8.5 9.65 t - t - - 9.65 - 10 8.5 9.65 t - Ỷ - 11.25 il.2 - 10 13.45 t - + - 11.65 10 25 - 10.5 t - + - 12 11 17 11 12 8.5 26.5 t - + - 8.2 20 - 8.5 11.75 t - + - r2= -N02 Rj= R2= - Cl Rt= -H R2=-I R] = R2 = R|= -H R,= VI KHIJẲN Gr ( - ) MẰƯTRẮNG Rị = - h COOH B cereus DẪN CHẤT THẾ VIKHUAN Gr ( + ) B pumilus VI SINH VÂT KIỂM ĐỊNH -H - Bt R2=C^N = NR2= SỌ?Na 38 11.25 9.35 16.5 - Nhận xét chung: - Nhìn chung dãn chất acid salicylic có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm mạnh chất ban đầu acid salicylic - Các dẫn chất acid salicylic cho tậc dụng tương đối tốt với chủng Bacillus pumilus Bacilus subtilis, với chủng vi khuẩn Gr(+) khác, chúng có lác dụng yếu không rõ ràng Riêng với Staphylococcus aureus, mộl số đẫn chất ihế cổ tác dụng ức chế mạnh - Với vi khuẩn Gr(-), nồng độ 4mg/ml, chất có tác dụng tốt liên chủng Shigella flexneri, với chủng Gr(-) khác tác dụng yếu - Trong chất tổng hợp có chất (4/7) có tác dụng kháng nấm Candida albicans, acid 5- azobenzen salicylic có tác dụng kháng nấm tốt - Ở nồng độ 4mg/ml, nhìn chung, tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn rõ rệt 3.6 NHẬN XÉT VẢ ĐÁNH GIÁ: 3.6.1 Tổng hợp hoá học: - Từ acid salicylic (nguyên liệu sẵn có) thực phản ứng điôn tử vào nhân Ihơm acid salicylic điều kiên nhiệl độ xúc lác thích hợp, tổng hợp chất Tiến hành kiểm tra cấu trúc qua phổ UV, IR, MS nhận thấy dẫn chất có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến lổng hợp - Phản ứng tiến hành Irong dung môi khan nước (acid acetic đặc, ethanol tuyệt đối ) - Hiệu suất phán ứng không phụ thuộc vào cấu trúc hoá học mà phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng Hệ dung môi kết tinh lại yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất Một vài phản ứng dễ xảy hiệu suất chưa cao 39 - Các dẫn chất tổng hợp chất rắn kết tinh không màu vàng nhạt tới vàng sẫm, tan tốt ethanol, methanol, DMF, aceton tan nước lạnh, benzen 3.6.2 Tác dụng sinh học: * Tác dụng kháng khuẩn: - Các dẫn chất tổng hợp tác dụng hay tác dụng chủng vi khuẩn Gĩ(-) Các vi khuẩn Gr(-) thường vi khuẩn hay gây bệnh thuốc kháng khuẩn khó tác dụng Với chủng vi khuẩn Gr(-) Shigella ílexnerri Proteus mirabilis, chất có tác dụng song yếu (với nồng độ 4mg/ml đường kính vòng vô khuẩn nhỏ) - Với vi khuẩn Gr(+), chất cho tác đụng tốt Hầu hết chất tổng hợp có tác đụng tốt chủng Bacillus subtilis Staphylococcus aureus + Acid 5- azobenzen salicylic có tác dụng tốt chủng Gr(+) + Các dãn chất cho tác dụng Bacillus subtilis Sarcina lutea yếu (đường kính vòng vô khuẩn nhổ) + Với chủng Staphylococcus atireus đẫn chất có tác dụng tốt là: dẫn chất thê Clo, Iod, Brom Azobenzen Trong (lẫn chất azobenzen có tác dụng ức chế mạnh (đường kính vòng vô kluiẩn lớn) + Các chất tổng hợp có tác dụng Bacillus pumilus Bacillus cereus nhimg tác dụng yếu (đường kính vòng vô khuẩn nhỏ) + Khả kháng khuẩn chất tổng hợp nói chung mạnh khả kháng khuẩn aciđ salicylic * Tác đụng kháng nấm: + Các dẫn chất tổng hợp cho tác dụng kháng nấm tốt nấm gảy bệnh Canđida albicans (trừ chất II VII) Khả tăng so với chất ban đầu acid salicylic + Riêng chất I, VII tác dụng nấm Candida albicans 40 + Chất VI (dẫn chất azobenzen) có tác dụng ức chế mạnh (vòng vô khuẩn có đường kính rõ rệt) * Từ kết thực nghiệm thu sơ nhận xét mối liên quan cấu trúc hoá học tác đụng kháng khuẩn, kháng nấm: + Sự có mặt nhóm nitro phân tử acid salicylic không làm tăng tác dụng kháng khuẩn, làm giảm khả kháng nấm + Việc gắn nhóm halogen (-C1, -Br, -I) vào nhân thơm làm tăng khả kháng khuẩn, kháng nấm rõ rệt Trong Iod nhân thơm làm tăng khả kháng nấrn so với chất ban đầu + Nhóm sulfonic (-SO?H) làm giảm khả kháng nấm tác dụng kháng nấm + Nhóm azobenzen (C6H5-N=N-) mở tông phổ kháng khuẩn Gr(+) tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tăng lên rõ rệt * Tuy nhiên tất nhận xét thăm dò sơ Chúng tiến hành thử lần nồng độ khác nhau, để đưa kết luận xác cần phải lặp lại thử nghiệm nhiều lần mang tính chất định lượng Song điều kiện thời gian không cho phép nên thực mức độ định tính Hy vọng rằng, việc nghiên cứu tổng hợp xác định tác dụng sinh học dẫn chất acid alicylic tiếp tục mức độ nghiên cứu chuyên sâu 41 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT - Qua kết thực nghiệm trình bày, rút số kết luận sau: Đi từ acid salicylic (nguyên liệu sẩn có) tổng hợp dẫn chất nhân thơm Các dẫn chất tổng hợp có số chất đề cập tài liệu (có ghi phần phụ lục) Tất chất tổng hợp được xác định độ tinh khiết SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc hoá học phân tích phổ ƯV, IR, MS Kêt thu cho thấy chất tổng hợp có cấu trúc dự kiến ban đầu Chúng tiến hành thử sơ tác dụng sinh học chất tổng hợp 10 chủng vi khuẩn chủng nấm Kết cho thấy 4- Các chất tổng hợp có tác dụng tốt chủng Gr(+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus Các chủng Gr(+) lại có tác dụng, không mạnh acid salicylic + Trên chủng Gr(-) chất tổng hợp có tác dụng tác dụng không mạnh ácid salicylic Trên chủng: Shigella flexneri, Proteus mirabilis, chủng Gr(-) khác tác dụng + Các dẫn chất halogen, azobenzen có tác đụng tốt nấm Candida albicans mạnh tác đụng aciđ salicylic Các chất lại tác dụng nấm Candida albicans Qua trình thực khoá luận tốt nghiệp, thu nhận số kiến thức phương pháp tổng hợp hữu cơ, xác định cấu trúc hữu tổng hợp Bước đầu làm quen vói nghiên cứu khoa học, rút học tính kiên trì, cẩn thận, trung thực sáng tạo - Đề xuất: Trong điều kiện cho phép mong muốn nghiên cứu tiếp dẫn xuất khác acid salicylic với nhóm chức khác gắn nhân thơm thăm dò tác đụng sinh học Qua giúp cho việc tìm chát có tác đụng kháng khuẩn, kháng nấm mạnh có ý nghĩa việc điều trị lâm sàng 42 [...]... 5-nitro saỉicylic, acid 3,5 dibromo salicylic Đo tại phòng cấu trúc - Viện hoá học - Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia Kết quả ghi lại ở bảng 6 35 Sơ B ộ THẢM IX) TẢC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT TổNG HỢP ĐƯỢC: Với sự giúp đỡ của tổ môn vi nấm, kháng sinh trường Đại học Dược - Hà Nội và với điều kiện thực tế cho phép, chúng tôi đã tiến hành thử một số tác dụng sinh học: lác dụng kháng nấm,... salicylic - Tác nhân tấn công E+ - Nhỏm thế có sẵn trên nhân thơm * Tác nhân tấn cồng - Các halogen như clo, brom, iođ: đây là các tác nhân ái điện tử rất dễ tấn công vào nhân thơm khi có xúc tác acid lewis - Ion nilroni +N 0 2 là tác nhân tấn cổng của phản ứng nitro hoá nhân thơm Tác dụng nitro hoá của một hỗn hợp acid nitric và acid sulfuric mạnh hơn tác dụng của mộl mình acid nitric - Tác nhân sulfonic... Phức K 3.3 TỔNG HỢP CÁC DAN Sản phẩm thế 1 lần Sản phẩm thế 2 lần c h ấ t t h ế c ủ a a c id s a l i c y l i c 3.3.1 1’ổng hợp (lẫn chất thế acid 5 - nỉtro salicylic o 2n c 7h 6o 3 c 7h 5n o 5 M=138,12 M=183 - Tiến hành trong tủ hốt s - Lượng hoá chất: Acid salicylic 2,8(g) 0,02mol Acid nitric đặc 20 - Tiến hành: 4- Trong một bình cầu đung tích 250ml, hoà tan 2,8g acid salicylic vào 15ml acid nitric... 296 M+2 298 M+4 (Tính the 0 đồ ng vị nhẹ COOH của bron1, tỷ lệ cường Br độ của c:ác đ Inh trên: Phân tử có 2 nguyên tử Bi M+2 M M+4 45 [COOH]+ 32 Nhóm carboxyl: - c o o n 3.4 KIỂM TRA CẢU TRÚC CÁC CHẤT TổNG HỢP Được 4.3.1 Tính chất vật lý: - Trạng thái, màu sắc: Các dẫn chất thế của acid salicylic tổng hợp được đều ở dạng rắn kết tinh, tinh thể hình kim hoặc bột mịn có màu trắng hoặc vàng nhạt đến màu... hoá thông dụng nhất là acid sulfuric hoặc oleum với hàm lượng SO3 khác nhau, cả lưu huỳnh trioxid tự do lẫn cation HSO+3 đều được coi là tác nhân sulfonic hoá thực thụ Khi thực hiện phản ứng sulfonic hoá, hoạt độ của các tác nhân sulfonic hoá phải được lựa chọn phù hợp với khả năng phản ứng của hợp chất thơm * Ảnh hưởng của các nhóm thế trên nhân Ihơm Theo Holleman, bản chất của các nhóm thế có sẵn... sinh học: lác dụng kháng nấm, kháng khuẩn của các chất lổng hựp đưực, qua đó mong muốn sơ bộ tìm ra mối liên quan giữa cấu trứchoá học và lác dụng sinh học của chúng Phương pháp thử áp dụng theo DDVN II / tập III 3.5.1 Nguyên tắc Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất lổng hợp được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch (với các khoang giấy tấm chất thử) hoặc đục lỗ thạch Khả năng ức... tử của vòng tăng lên Ảnh hưởng ngược lại có thể xảy ra khi ở nguyên tử có nhóm thế liên kết trực tiếp với vòng lại được nối với liên kết bội hoặc một nguyên lử có độ âm điện cao hơn, khi đó do liên hợp xuấl hiện tương tác giữa nguyên lử đó với orbital K không định chỗ của vòng 11 - Hiệu ứng tổng cộng: Xét trường hợp vòng thơm gắn với nhóm -N 02: Hiệu ứng cảm ứng và hiệu ứng liên hợp tác dụng cùng một. .. Hiệu ứng tổng cộng là hiệu ứng nhận điện tử tổng cộng Ngược lại với trường hợp nhân thơm gắn với nhóm am in -NH2 thì hiệu ứng này tác dụng ngược chiều nhau Bất kỳ nhóm nào ở vòng thơm có tác dụng như chất cho điện tử đều làm tăng tốc độ phản ứng thế và ngược lại * Quy tắc Holleman [2] Holleman là người đầu tiến phát hiện ra ảnh hưởng của nhóm thế có sẵn trong nhân thơm đối với các phản ứng thế tiếp... tắc: Nó giúp đoán trước hướng thế của phản ứng thế ái điện tử và nhờ đó chúng ta sẽ chọn được con đường đúng trong quá trình tổng hợp những chất mong muốn Tuy nhiên quy tắc này không đúng tuyệt đối vì trong thực tế ta thu được một hỗn hợp gồm 3 đồng phân: VD: CHj HNO, 1 62% 33% * Định hướng sự thế: [2] [14] Có 2 cách giải thích quy tắc Holleman về định hướng của các nhóm thế tiếp theo - Thứ nhất: Nhóm... phản ứng 'thế tiếp (heo vào nlifln (liơm của acid salicylic đối với nhóm thế loại ĩ (nhóm phenol: OM) và nhóm Ihế loại II (nhóm Cnrboxyl-COOH) Sơ đổ phản ứng: coot Ị COOIÍ c ợ ó ti + E4 tlkl" Dỉin cliíít thế 2 lítn Acid Salicylic Dãn cliíít thế 1 lổn - Các phản ứng lliế: 16 COOH COOỈỈ (VII) C6H5-N=N * Điều kiện phản ứng - Dung môi sử dụng là Ethanol khan nước hoặc acid acetic đặc - Nhiệt độ của phản ... 3.6.2 Tác dụng sinh học: * Tác dụng kháng khuẩn: - Các dẫn chất tổng hợp tác dụng hay tác dụng chủng vi khuẩn Gĩ(-) Các vi khuẩn Gr(-) thường vi khuẩn hay gây bệnh thuốc kháng khuẩn khó tác dụng. .. tác dụng sinh học chúng Hy vọng lằng hợp chất với tác dụng sinh học định nghiên cứu tiếp sâu để có ứng dụng y học PIIẦN II: TỔNG QUAN 2.1 S LƯỢC LỊCH s NGHIÊN c ứ u VẢ ÚNG DỤNG CỦA ACID SALICYLIC... Các chất tổng hợp có tác dụng tốt chủng Gr(+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus Các chủng Gr(+) lại có tác dụng, không mạnh acid salicylic + Trên chủng Gr(-) chất tổng hợp có tác dụng tác