TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT LAI HÓA GIỮA 11AZAARTEMISININ VÀ DẪN CHẤT CỦA ACRIDIN

Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, gần đây nhiều hoạt tính mới của artemisinin và dẫn chất đã được phát hiện, đặc biệt là tác dụng kháng ung thư, dựa trên nguyên lý tương tự tác dụng chống

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

người đã ở bên cạnh và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám

ơn chân thành đến TS Văn Thị Mỹ Huệ - Bộ môn Hóa Hữu cơ - Trường Đại học Dược Hà Nội và TS Lê Nguyễn Thành - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thầy cô đã không chỉ tạo những điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã luôn có những hướng dẫn chính xác và kịp thời những lúc tôi gặp khó khăn, luôn ở bên động viên tôi, tạo cho tôi động lực và niềm tin lớn

Tôi cũng xin bày tỏ những tình cảm thân thương đến các anh chị tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người

đã chia sẻ vui buồn, đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên tạo động lực cho tôi đi đến ngày hôm nay

Do thời gian làm thực nghiệm khá gấp rút cũng như kiến thức của bản thân còn nhiều hạn chế, khóa luận không tránh khỏi nhiều thiếu sót Rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Võ Nhật Thanh

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ARTEMISININ VÀ DẪN CHẤT 3

1.2.1 Tác dụng chống sốt rét của artemisinin và dẫn chất 3

1.2.2 Tác dụng kháng ung thư của artemisinin và dẫn chất 8

1.2 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT ACRIDIN 9

1.3 PHƯƠNG PHÁP LAI HÓA TRONG THIẾT KẾ THUỐC 12

1.4 LAI HÓA GIỮA DẪN CHẤT ARTEMISININ VÀ DẪN CHẤT ACRIDIN 13

1.5 PHẢN ỨNG AMID HÓA TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI HÓA CỦA 11-AZAARTEMISININ 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 19

2.1.1 Hóa chất 19

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 19

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Tổng hợp hóa học 21

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 21

2.3.3 Khẳng định cấu trúc 21

3.1.1 Tổng hợp các dẫn chất 9-amino-6-cloro-2-methoxyacridin (3a-c) 22

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 11-azaartemisinin (7) 23

3.1.3 Tổng hợp các dẫn chất lai hóa 8a-c 25

3.2 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 28

3.3 KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 29

3.3.1 Phổ hồng ngoại (IR) 29

3.3.2 Phổ khối lượng (MS) 30

3.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H ( 1 H-NMR) 31

3.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR) 35

3.4 BÀN LUẬN 38

3.4.1 Tổng hợp hóa học 38

3.4.2 Khẳng định cấu trúc 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

1 KẾT LUẬN 44

2 KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

13 C-NMR : Carbon-13 nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân 13C)

IV(a-o) 7

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng ung thư và chống sốt rét in vitro của các chất V(a-f) 11

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng ung thư và chống sốt rét in vitro của các chất VI(a-d) 14 Bảng 1.4 Hoạt tính kháng ung thư và chống sốt rét in vitro của các chất VII(a-e) 15 Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất sử dụng 19

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp các chất 3a-c, 5-7, 8a-c 26

Bảng 3.2 Giá trị Rf và t o nc các chất tổng hợp được 28

Bảng 3.3 Số liệu phổ IR của các chất 8a-c 30

Bảng 3.4 Số liệu phổ MS của các chất 8a-c 31

Bảng 3.5 Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 3a-c 32

Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H-NMR của chất 7 33

Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 8a-c 34

Bảng 3.8 Số liệu phổ 13C-NMR của các chất 8a-c 36

Hình 1.2 Các kiểu hợp chất lai hóa 13

Sơ đồ 1.2 Phản ứng amid hóa giữa 11-azaartemisinin và các dẫn chất

4-aminoquinolin dùng CDI làm tác nhân hoạt hóa 18

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quá trình tổng hợp các chất 8a-c 20

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp các chất 3a-c 22

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất 7 23

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tổng hợp các chất 8a-c 25

Sơ đồ 3.4 Cơ chế phản ứng thế ái nhân của 6,9-dicloro-2-methoxyacridin 38

Sơ đồ 3.5 Phản ứng tạo dẫn chất 11-azaartemisinin (5) 39

Sơ đồ 3.6 Cơ chế phản ứng amid hóa dùng CDI 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), tình hình một số bệnh trong đó có ung thư và sốt rét đang trở nên rất đáng quan ngại Năm 2012, có 8 triệu người tử vong do ung thư, cùng số ca mắc mới dự tính sẽ tăng 70% trong 2 thập kỉ tới Bên cạnh đó, bệnh sốt rét cũng có số bệnh nhân rất lớn với 214 triệu ca mắc dẫn đến 438 nghìn người tử vong do sốt rét trên toàn thế giới năm 2015 [33,34] Thực trạng này cho thấy, nhu cầu phát triển các thuốc điều trị ung thư và sốt rét là rất cấp thiết

Gần đây, một xu hướng triển vọng trong hóa dược là phương pháp lai hóa đã được áp dụng rộng rãi nhằm phát triển các thuốc mới Phương pháp lai hóa tạo ra một phân tử duy nhất do sự kết hợp hai loại thuốc nhằm phát huy tác dụng hiệp đồng, giảm tính nhạy cảm với sự kháng thuốc [17] Trong hóa trị liệu ung thư, các hợp chất lai hóa đã chứng tỏ rất có tiềm năng, bên cạnh đó các thuốc lai hóa cũng được nhận định là thế hệ thuốc chống sốt rét tiếp theo với rất nhiều

ưu điểm [9,25]

Artemisinin là một sesquiterpen được phân lập từ cây thanh hao hoa vàng

Artemisia annua Artemisinin và các dẫn chất đã được sử dụng trên lâm sàng

điều trị sốt rét từ những năm 1970 với tác dụng mạnh trên kí sinh trùng sốt rét [4,7,22] Bên cạnh tác dụng chống sốt rét, gần đây nhiều hoạt tính mới của artemisinin và dẫn chất đã được phát hiện, đặc biệt là tác dụng kháng ung thư, dựa trên nguyên lý tương tự tác dụng chống sốt rét thông qua gốc tự do tạo ra

từ tương tác của artemisinin và dẫn chất với sắt

Khả năng kháng ung thư và chống sốt rét cũng được tìm thấy trên các dẫn chất acridin, một cấu trúc phẳng chứa 3 vòng thơm, với khá nhiều cơ chế đã được khám phá như “chèn vào ADN/ARN” (intercalation), alkyl hóa kiểu “mù tạc”, ức chế topoisomerase I, II [12,13,17,18,28,38]

Theo xu hướng phát triển thuốc nói trên, với những tác dụng đáng quan tâm

của các dẫn chất artemisinin và acridin, đề tài “Tổng hợp một số dẫn chất lai hóa giữa 11-azaartemisinin và dẫn chất của acridin” được tiến hành với mục

tiêu:

Tổng hợp được một số dẫn chất lai hóa giữa 11-azaartemisinin và dẫn chất của acridin

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA ARTEMISININ VÀ DẪN CHẤT

Artemisinin là một sesquiterpen lacton của amorphen, chứa cấu trúc

1,2,4-trioxan, được phân lập từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L (họ Cúc,

Asteraceae), vốn là một cây đã được sử dụng chữa trị sốt rét từ lâu đời.Việc khám phá ra artemisinin và khẳng định tác dụng chống rét của nó được xem là một trong những phát hiện thuốc vĩ đại nhất nửa sau thế kỉ 20 [7,22,32]

Mặc dù hoạt tính chống kí sinh trùng sốt rét rất tốt (ở nồng độ cỡ nM), nhưng artemisinin lại kém tan trong cả nước lẫn dầu, gây cản trở trong việc phát triển các dạng dược dụng Để khắc phục nhược điểm này, nhiều dẫn chất artemisinin đã được tổng hợp và được sử dụng trong lâm sàng như

dihydroartemisinin, artemether, arteether, natri arsesunat (các dẫn chất I)

[5,29]

R = H: Dihydroartemisinin (DHA)

R = Me: Artemether

R = Et: Arteether

Bênh cạnh tác dụng nổi bật là chống sốt rét, gần đây nhiều tiềm năng mới của artemisinin và dẫn chất đã được phát hiện, đặc biệt là tác dụng kháng ung thư [22]

1.2.1 Tác dụng chống sốt rét của artemisinin và dẫn chất

Artemisinin và dẫn chất tác động nhanh đối với thể phân liệt và làm sạch

kí sinh trùng sốt rét trong 24 giờ Artemisinin tác dụng trên giai đoạn hồng cầu của kí sinh trùng sốt rét nhưng lại không ảnh hưởng đến giai đoạn ngoài hồng

cầu, nên artemisinin không có tác dụng dự phòng sốt rét Ở nồng độ 10-7 M,

artemisinin và dẫn chất ức chế in vitro một cách rõ rệt sự phát triển và nhân lên của kí sinh trùng sốt rét P.falciparum [4]

Tuy nhiên, trên thực tế việc sử dụng artemisinin và dẫn chất cần lượng nhiều hơn do tính kém tan trong nước lẫn dầu, thời gian bán thải ngắn và tác dụng đường uống kém do sự kém hấp thu của các hoạt chất này [7]

Nhóm carbonyl của artemisinin dễ dàng bị khử để tạo ra DHA, là tiền đề cho một loạt dẫn chất bán tổng hợp của artemisinin như artemether, arteether tan trong dầu, natri artesunat và natri artelinat tan trong nước [4] Các thuốc này hấp thu nhanh, phân bố rộng, chuyển hóa ở gan thành dạng hoạt tính là DHA [30] Những hợp chất này có hiệu quả tốt trên cả chủng sốt rét kháng cloroquin [26] Artemether, artesunat nằm trong danh mục thuốc thiết yếu để điều trị sốt rét của WHO [35] Acid artelinic dễ tan trong nước, có cấu trúc bền vững, hiện nay đang được thử nghiệm trên động vật [4]

Cơ chế tác dụng chống sốt rét: Do có chứa nhóm peroxid trong cấu trúc, khi được hoạt hóa bởi sắt tự do hay sắt gắn với hem, artemisinin tạo thành gốc

tự do, có thể alkyl hóa nhiều protein Tác dụng của artemisinin có thể liên quan đến gốc tự do trong không bào tiêu hóa của kí sinh trùng, làm ức chế PfATP6,

là ATPase phụ thuộc Ca2+ của kí sinh trùng [11,21,22,30]

Hồng cầu người chứa 20 mM hem, ở dạng hemoglobin Kí sinh trùng sốt rét tiêu hóa khoảng 25% hemoglobin của hồng cầu nhưng không thoái hóa hem, dẫn đến tích lũy hem trong không bào tiêu hóa Điều này giải thích tại sao artemisinin gây độc chọn lọc đối với kí sinh trùng [4]

Hình 1.1 Cơ chế tác dụng chống sốt rét của artemisinin

Dạng uống của artemisinin và dẫn chất bị hạn chế bởi bản chất kém bền của peroxid, và đặc điểm dễ bị thủy phân của vòng lacton trong acid dịch vị

Do đó việc thay thế vòng lacton bởi lactam tạo dẫn chất 11-azaartemisinin là

một giải pháp hiệu quả, không làm giảm hoạt tính chống sốt rét in vitro và in

vivo [5,6,20,27] Nhiều dẫn chất 11-azaartemisinin đã được phát triển và chứng

tỏ có tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét rất tốt

Theo H Ziffer và cộng sự, dẫn chất

N-(2’-acetaldehydro)-11-azaartemisinin IIa có tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét mạnh hơn artemisinin

26 lần in vitro và 4 lần in vivo, và tương đương hoạt tính của arteether in vivo

[39]

Nghiên cứu của M.A Avery về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các

dẫn chất N-methyl-11-azaartemisinin, cho thấy chất IIb có tác dụng mạnh hơn

5 lần artemisinin trên chủng P.falciparum W-2 [19]

Trong 15 hợp chất 11-azaartemisinin được nhóm nghiên cứu của B

Mekonnen tổng hợp III(a-o), có 10 dẫn chất có tác dụng mạnh hơn artemisinin

trên chủng P falciparum D6 kháng cloroquin và 6 dẫn chất mạnh hơn trên chủng P falciparum W-2 kháng mefloquin [23]

Nhóm nghiên cứu của Lê Nguyễn Thành đã tổng hợp 15 dẫn chất 11-azaartemisinin dựa trên phản ứng đa cấu tử Ugi Các hợp chất được thử

nghiệm trên FcB1, một chủng P.falciparum kháng cloroquin Tất cả 15 chất

đều thể hiện sự ức chế chủng sốt rét này ở nồng độ 100 ng/mL Ở nồng độ

10 ng/mL, 10 hợp chất (IVb, IVc, IV(f-j), IVl, IVn, và IVo) ức chế trên 50% Với nồng độ 1 ng/mL, 3 chất (IVc, IVf, và IVl) vẫn thể hiện hoạt tính ức chế

mạnh (78 – 100%) với sự phát triển của chủng FcB1 Các hợp chất IVc, IVf,

và IVl tác dụng mạnh hơn cả artemether (IC50 = 19 nM) [27]

Bảng 1.1 Hoạt tính chống sốt rét trên chủng P.falciparum FcB1 của các chất IV(a-o)

1.2.2 Tác dụng kháng ung thư của artemisinin và dẫn chất

Tác dụng chống ung thư của artemisinin được phát hiện lần đầu từ những năm 1990 bởi H.J Woerdenbag và cộng sự [22] Trên dòng tế bào EAT (Ehrlich ascites tumour), giá trị IC50 của artemisinin là 23 μM, của artemether và arteether là 11 μM, và của natri artesunat là 20 μM [24] Sau đó, artemisinin và các dẫn chất thường gặp (DHA, artesunat, artemether) đã được thử trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau, kết quả cho thấy giá trị IC50 trong khoảng 10-

vú đã di căn [32]

Artemisinin và dẫn chất thể hiện tác dụng kháng ung thư với tính chọn lọc cao, thể hiện là chỉ gây độc trên tế bào ung thư và ít gây độc với tế bào thường Năm 1995, nghiên cứu của H Lai và cộng sự thấy rằng DHA chọn lọc trên ung thư bạch cầu hơn tế bào lympho thường khoảng 100 lần Tính chọn lọc này cũng lặp lại trên tế bào ung thư vú [22]

Cơ chế gây độc tế bào ung thư của artemisinin và dẫn chất đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu Có nhiều cơ chế đã được đề cập đến như apoptosis,

“bắt giữ” tế bào trong chu trình (đặc biệt là pha Go/G1) Vì vậy, artemisinin và dẫn chất có thể ức chế sự phát triển tế bào và gây ra sự chết tế bào [22]

Các nghiên cứu tế bào mức độ phân tử chỉ ra rằng artemisinin và dẫn chất

ức chế yếu tố nhân NF-κB và giảm hoạt động yếu tố phát triển mạch VEGF, ngoài ra còn có NOXA, MAPK, HIFα, Wnt/β – catenin, survivin, COX, c-MYC oncoprotein, EGF, TNFα Tất cả các thay đổi này đều có thể xuất phát

từ sự tăng nồng độ gốc tự do trong tế bào ung thư do phản ứng của artemisinin

và dẫn chất với sắt Tác dụng chống ung thư dựa trên nguyên lí tế bào ung thư giống như kí sinh trùng sốt rét có chứa nồng độ cao sắt do tế bào ung thư tăng tái hấp thu sắt thông qua transferrin [22]

Chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng ung thư của các hợp chất 11-azaartemisinin, tuy nhiên, với tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét tốt và sự tương đồng trong cơ chế kháng ung thư và chống sốt rét của artemisinin và dẫn chất, có thể các hợp chất 11-azaartemisinin cũng có tiềm năng về kháng ung thư

1.2 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT ACRIDIN

Các dẫn chất acridin có tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét do ức chế kết

tinh của hem trong quá trình thoái hóa hemoglobin Các dẫn chất acridin có thể

“chèn vào ADN/ARN” (intercalation) nhờ cấu trúc vòng thơm phẳng, alkyl hóa kiểu “mù tạc”, ức chế topoisomerase I, II do đó có khả năng kháng ung thư [12,13,17,18,28,37]

Trừ một số ít hợp chất acridin có sẵn trong tự nhiên, nhiều dẫn chất acridin

đã được tổng hợp, một số dẫn chất đã được sử dụng như nitracrin, amsacrin (điều trị ung thư) và quinacrin (điều trị sốt rét) [8]

Nitracrin có tác dụng kháng ung thư mạnh trên nhiều dòng tế bào ung thư như KB, HeLa, bạch cầu lympho NK L1210 và Walker 256 Thuốc thể hiện độc tính chọn lọc với dòng tế bào AA8 buồng trứng chuột Trung Quốc (CHO) trong điều kiện kị khí, với tác dụng mạnh gấp 105 lần misonidazol [10]

Amsacrin thể hiện tác dụng lâm sàng kháng ung thư bạch cầu, là thuốc tổng

hợp hướng ADN được thử nghiệm lâm sàng đầu tiên [16,37]

Một thuốc khác là mepacrin (quinacrin), được phát triển dựa trên cấu trúc

của cloroquin là thuốc trị thể phân liệt trong máu đầu tiên, là lựa chọn hàng đầu

để điều trị sốt rét trong chiến tranh thế giới thứ II [17,36] Ngoài ra, mepacrin còn có tác dụng kháng ung thư tốt do hoạt hóa phiên mã protein ức chế ung thư p53 [8]

Dựa trên cấu trúc cuả mepacrin, nhiều dẫn chất

9-amino-6-cloro-2-methoxyacridin (V) đã được tổng hợp và thử tác dụng sinh học Hợp chất

V(a-b) có tác dụng tương đương cloroquin trên chủng P.falciparum 3D7 nhạy cảm

cloroquin, với giá trị IC50 cỡ μM (42 nM với chất Va và 67 nM với chất Vb)

V(a-c) mạnh hơn cloroquin trên 3 chủng P.falciparum kháng cloroquin W2,

FCR3, Bre1, hợp chất Vf mạnh hơn cloroquin trên chủng FCR3 và Bre1 Việc

thay thế 6-cloro và 2-methoxy bằng nguyên tử hydro làm giảm tác dụng 3 lần trên các chủng kháng cloroquin và 9 lần trên chủng nhạy cảm cloroquin 3D7

Do đó các nhóm thế 6-cloro và 2-methoxy trên vòng thơm của acridin có thể đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính sinh học của các dẫn chất này

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng ung thư và chống sốt rét in vitro của các chất V(a-f)

Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy một dẫn chất tổng hợp khác của

acridin, là pyronaridin (PNA) có tác dụng tốt trên P.falciparum (trên in vitro

với cả chủng kháng cloroquin), ít tác dụng phụ WHO cho phép dùng

pyronaridin điều trị nhiễm P.falciparum lâm sàng ở một số vùng nguy cơ cao

Phối hợp artesunat - pyronaridin (Pyramax) là một trong những ACT (liệu pháp kết hợp dựa trên artemisinin – phối hợp dẫn chất artemisinin với một thuốc điều trị sốt rét khác có thời gian bán thải dài) mới nhất đang trong giai đoạn phát triển, đã hoàn thành pha III lâm sàng trên người [37].

1.3 PHƯƠNG PHÁP LAI HÓA TRONG THIẾT KẾ THUỐC

Có thể định nghĩa, lai hóa là kết hợp 2 hợp chất có cấu trúc và cơ chế hoạt động sinh học khác nhau bằng liên kết cộng hóa trị với mục đích phối hợp điều trị chúng, mong muốn tăng tác dụng sinh học và giảm tính nhạy cảm với kháng thuốc [17]

Liệu pháp phối hợp thuốc được dùng để tránh tình trạng kháng thuốc trong điều trị nhiều bệnh như ung thư, sốt rét Tuy nhiên, việc lựa chọn thuốc và liều cho liệu pháp phối hợp gặp nhiều khó khăn do sự khác biệt giữa các thuốc về tính tan, tính bền và dược động học Việc phối hợp còn có thể dẫn đến tương tác thuốc - thuốc Phối hợp hai hoạt chất trong một phân tử không những có thể khắc phục những nhược điểm trên của liệu pháp phối hợp thuốc, mà còn có thể hiệp đồng tác dụng các thuốc được phối hợp Lai hóa hai thuốc khác nhau tạo thành một phân tử duy nhất sẽ thuận tiện hơn và rẻ hơn việc dùng các thuốc này riêng lẻ [31]

Hợp chất lai hóa có thể chứa toàn bộ cấu trúc hay chỉ một phần của các thuốc hợp phần Có thể phân loại hợp chất lai hóa thành 3 nhóm: hợp chất lai

hóa phân cắt (các hợp phần liên kết qua liên kết dễ bị cắt bởi enzym như các liên kết amid, ester hoặc carbamat); hợp chất lai hóa không phân cắt (các hợp phần liên kết qua liên kết không bị cắt bởi enzym) và hợp chất lai hóa kiểu chồng lên nhau (các hợp phần chồng lên nhau) (hình 1.2) [31]

Hình 1.2 Các kiểu hợp chất lai hóa

1.4 LAI HÓA GIỮA DẪN CHẤT ARTEMISININ VÀ DẪN CHẤT ACRIDIN

Do đều có tác dụng kháng ung thư và chống sốt rét nên artemisinin (cùng các dẫn chất) và acridin (cùng các dẫn chất) có thể kết hợp với nhau theo phương pháp lai hóa Việc phối hợp các dẫn chất này để tạo thành một phân tử hứa hẹn mang lại tác nhân mới, triển vọng trong điều trị ung thư và sốt rét Một số nhóm nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành tổng hợp và thử hoạt tính một số hợp chất lai hóa giữa các dẫn chất artemisinin và các dẫn chất acridin, kết quả cho thấy tác dụng kháng ung thư và chống sốt rét của những hợp chất lai hóa này rất có triển vọng

Năm 2009, Michael Jones và cộng sự đã tổng hợp và thử hoạt tính các hợp

chất lai hóa VI(a-d) giữa 10-deoxoartemisinin và các hợp chất

9-amino-6-cloro-2-methoxyacridin Các hợp chất lai hóa này có tác dụng kháng ung thư

mạnh hơn 2 - 4 lần trên các dòng tế bào ung thư bạch cầu HL60, ung thư vú MDA-MB-231 và MCF-7 so với DHA, trong đó hoạt tính mạnh nhất thể hiện trên dòng tế bào HL60 với giá trị IC50 từ 0,56 – 3,08 μM Các dẫn chất này

cũng có hoạt tính chống sốt rét trung bình trên chủng P falciparum 3D7 nhạy

với DHA, hoạt tính chống sốt rét của các hợp chất lai hóa này có phần giảm đi,

do khả năng “chèn vào ADN/ARN” của các hợp chất lai hóa giảm bởi sự “xếp chồng” nội phân tử giữa hai hợp phần artemisinin và acridin Kéo dài cầu nối giữa 2 hợp phần này có thể khắc phục được tương tác nói trên [17]

Năm 2014, Juan P Joubert và cộng sự tổng hợp và thử hoạt tính các hợp

chất lai hóa VII(a-e) giữa artemisinin và các hợp chất

9-amino-6-cloro-2-methoxyacridin Các hợp chất lai hóa có hoạt tính tương đương hoặc hơn

cloroquin trên 2 chủng P falciparum NF54 nhạy cảm với cloroquin và

P falciparum Dd2 kháng với cloroquin Tác dụng kháng ung thư trên tế bào

Hela của các hợp chất lai hóa này mạnh hơn melphalan từ 8–50 lần với giá trị

cường

Các hợp chất lai hóa trong các nghiên cứu trên đây đều liên kết khung artemisinin và khung acridin thông qua liên kết amid trong đó cầu nối diamin của hợp phần acridin có khoảng cách từ 2–4 carbon, thêm 2 carbon trên cầu nối của hợp phần artemisinin, vị trí gắn cầu nối trên khung artemisinin là carbon số

10 Dẫn chất acridin được sử dụng trong các nghiên cứu này đều là các dẫn chất 9-amino-6-cloro-2-methoxyacridin

Nhiều dẫn chất 11-azaartemisinin đã được phát triển và thể hiện tác dụng chống kí sinh trùng sốt rét rất tốt Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng ung thư của các hợp chất 11-azaartemisinin Với tác dụng chống

kí sinh trùng sốt rét tốt và sự tương đồng trong cơ chế kháng ung thư và chống sốt rét của artemisinin và dẫn chất, nhiều khả năng các hợp chất 11-azaartemisinin cũng có tác dụng kháng ung thư Trong nghiên cứu này, một số

hợp chất lai hóa giữa dẫn chất 11-azaartemisinin (7) và các dẫn chất

9-amino-6-cloro-2-methoxyacridin được thiết kế và tổng hợp với định hướng kháng ung thư và chống sốt rét

1.5 PHẢN ỨNG AMID HÓA TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT LAI HÓA CỦA 11-AZAARTEMISININ

Acid carboxylic là tác nhân acyl hóa yếu, do đó cần được hoạt hóa trước khi phản ứng với amin Có thể dùng clorid acid vô cơ như thionyl clorid hay oxalyl clorid chuyển acid sang clorid acid tương ứng nhằm hoạt hóa nhóm carboxylic

Tuy nhiên các tác nhân kể trên có thể ảnh hưởng đến các cấu trúc kém bền như 11-azaartemisinin [2]

Có một số tác nhân hoạt hóa nhẹ nhàng hơn như N,N’-dicyclohexyldiimid (DCC) hay 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) Hợp chất CDI là tác nhân hoạt hóa tốt được sử dụng phổ biến cho các phản ứng tạo amid [2]

Sơ đồ 1.1 Phản ứng amid hóa dùng CDI

Trong nghiên cứu tổng hợp các hợp chất lai hóa giữa 11-azaartemisinin và các dẫn chất 4-aminoquinolin của Văn Thị Mỹ Huệ và cộng sự, CDI đã được

sử dụng làm tác nhân hoạt hóa nhóm carboxylic cho phản ứng tạo liên kết amid

với hiệu suất khả quan và điều kiện phản ứng khá dễ dàng Trong khi đó, phản ứng lại không xảy ra với tác nhân DCC [2]

Sơ đồ 1.2 Phản ứng amid hóa giữa 11-azaartemisinin

và các dẫn chất 4-aminoquinolin dùng CDI làm tác nhân hoạt hóa

Vì vậy, tác nhân CDI đã được sử dụng trong phản ứng tổng hợp các dẫn

chất lai hóa 8a-c trong nghiên cứu này

2 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG,

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Các hóa chất được dùng trong quá trình thực nghiệm là loại được dùng trong tổng hợp của các hãng Merck, Sigma-Aldrich, Trung Quốc Các hóa chất được sử dụng trực tiếp, không qua tinh chế

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất sử dụng

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 2 cổ dung tích 25 mL, bình cầu dung tích

50 mL và 100 mL có nút mài, sinh hàn hồi lưu, bình nón, pipet, phễu thủy tinh,

phễu Buchner, bình lọc hút, bình chiết, bình chạy sắc kí lớp mỏng, cột chạy sắc

kí

- Nhiệt kế, tủ lạnh

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Cân kỹ thuật điện tử Ohaus

- Bơm hút chân không DIVAC.1,21

- Máy cất quay Buchi R – 210

- Bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck) để chạy sắc kí lớp mỏng

- Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer

- Máy đo phổ khối lượng LC-MSD-Trap-SL Agilent 1260

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1-H-NMR, 13C-NMR) Bruker

Avance

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Các dẫn chất lai hóa giữa 11-azaartemisinin và acridin 8a-c được tổng hợp

theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ quá trình tổng hợp các chất 8a-c

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

- Dựa trên các nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất theo thiết kế

- Theo dõi phản ứng bằng sắc kí lớp mỏng

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột hoặc kết tinh

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các chất được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc kí lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.3 Khẳng định cấu trúc

Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại để khẳng định cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR)

- Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer, tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), với kĩ thuật viên nén KBr

- Phổ khối lượng được ghi trên máy khối phổ LC-MSD-Trap-SL Agilent

1260, tại Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Bruker Avance, tại Viện Hoá học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Độ chuyển dịch hóa học được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million, ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội trimethylsilan (TMS)

3 CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

Kết thúc phản ứng, thêm 30 mL nước vào hỗn hợp phản ứng; lọc, rửa bằng nước lạnh thu được phần rắn Làm khô phần rắn thu được dưới áp suất giảm thu được sản phẩm thô Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột với hệ dung môi DCM : MeOH : NH4OH (dung dịch NH4OH 25% trong nước) = 18 : 2 : 1,5 thu

được 0,52 g sản phẩm 3a là chất rắn màu vàng, hiệu suất 87,70 %

3.1.1.2 Tổng hợp chất 3b

Chất 3b được tổng hợp theo quy trình tương tự chất 3a, từ 0,50 g 6,9-dicloro-2-methoxyacridin (1) (1,8 mmol), 4,18 g hexan-1,6-diamin (2b)

(36,0 mmol, 20 eq.) và 0,50 g K2CO3 (3,6 mmol), thu được 0,47 g sản phẩm 3b

là chất rắn màu vàng, hiệu suất 73,04%

3.1.1.3 Tổng hợp chất 3c

Chất 3c được tổng hợp theo quy trình tương tự chất 3a, từ 0,50 g 6,9-dicloro-2-methoxyacridin (1) (1,8 mmol), 2,8 mL piperazin (2c)

(36,0 mmol, 20 eq.) và 0,50 g K2CO3 (3,6 mmol), thu được 0,40 g sản phẩm 3c

là chất rắn màu vàng, hiệu suất 67,87%

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 11-azaartemisinin (7)

Theo phương pháp của Lê Nguyễn Thành, quy trình tổng hợp dẫn chất

11-azaartemisinin (7) được trình bày ở sơ đồ 3.2 [1,3,27]

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất 7

3.1.2.1 Tổng hợp chất 5

Dung dịch chứa 2,00g artemisinin (4) (7,1 mmol) trong 40 mL THF và

12 ml MeOH được làm lạnh xuống -15oC, thêm vào đó 10,0 mL dung dịch

NH4OH 25% trong nước (71,0 mmol, 10 eq.) Hỗn hợp phản ứng được khuấy

ở nhiệt độ -15oC trong 12 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM Sau khi kết thúc phản ứng, loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ phòng để thu được chất keo màu vàng nhạt

Hòa tan chất keo thu được trong 40 mL DCM và thêm vào 1,22 g acid

p-toluensulfonic (7,1 mmol) và tiếp tục khuấy hỗn hợp phản ứng trong vòng

3 giờ ở nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng bằng SKLM

Kết thúc phản ứng, rửa hỗn hợp phản ứng bằng 80 mL dung dịch NaHCO3 5% trong nước Dịch hữu cơ được làm khan với natri sulphat, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế cắn thu được bằng cách kết tinh lại với

EtOAc/n-hexan, thu được 1,21 g sản phẩm 5 là tinh thể hình kim màu trắng,

hiệu suất 60,69%

3.1.2.2 Tổng hợp chất 6

Hỗn hợp gồm 1,21 g chất 5 (4,3 mmol), 40 ml THF, 1,2 ml methyl acrylat

(13,0 mmol, 3eq.) và 0,52 g NaOH (13,0 mmol) được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Theo dõi phản ứng bằng SKLM

Kết thúc phản ứng, cho thêm 30 mL nước vào hỗn hợp phản ứng và chiết bằng 30 mL ethylacetat x 3 lần Dịch chiết hữu cơ được làm khan với natri sulphat, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế cắn chiết bằng

sắc ký cột với hệ dung môi là n-hexan : ethyl acetat (7:3), thu được 1,17 g sản

phẩm 6 là tinh thể hình kim màu trắng, hiệu suất 74,06%

được 0,84 g sản phẩm 7 là chất rắn màu trắng, hiệu suất 87,33%

3.1.3 Tổng hợp các dẫn chất lai hóa 8a-c

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tổng hợp các chất 8a-c

3.1.3.1 Tổng hợp chất 8a

Hỗn hợp gồm 70 mg chất 7 (0,2 mmol), 40 mg 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) (0,24 mmol), 5 mL acetonitril trong môi trường khí N2 được đun nóng ở

70oC trong 1 giờ, theo dõi phản ứng bằng SKLM Sau đó để nguội hỗn hợp

phản ứng về nhiệt độ phòng Thêm vào hỗn hợp phản ứng 66 mg chất 3a

(0,2 mmol, 1 eq.) và 0,09 mL triethylamin rồi đun hồi lưu trong 5 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM

Kết thúc phản ứng, cho thêm 30 mL nước vào hỗn hợp phản ứng Chiết bằng 30 mL ethyl acetat x 3 lần Dịch chiết hữu cơ được làm khan bằng natri sulfat, lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm Tinh chế cắn chiết bằng sắc

kí cột với hệ dung môi DCM : MeOH (20:1), thu được 65 mg sản phẩm 8a là

chất keo màu vàng, hiệu suất 48,86%

3.1.3.2 Tổng hợp chất 8b

Chất 8b được tổng hợp theo quy trình tương tự chất 8a, từ 70 mg chất 7 (0,2 mmol), 40 mg 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) (0,24 mmol), 72 mg chất 3b

(0,2 mmol, 1eq.) và 0,09 mL triethylamin, thu được 62 mg sản phẩm 8b là chất

keo màu vàng, hiệu suất 44,71%

3.1.3.3 Tổng hợp chất 8c

Chất 8c được tổng hợp theo quy trình tương tự chất 8a, từ 70 mg chất 7

(0,2 mmol) và 40 mg 1,1’-carbonyldiimidazol (CDI) (0,24 mmol), 66 mg chất

3c (0,2 mmol, 1eq.) và 0,09 mL triethylamin, thu được 56 mg sản phẩm 8c là

chất keo màu vàng, hiệu suất 42,22%

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp các chất 3a-c, 5-7, 8a-c

(đvC)

Hiệu suất %

Tính chất sản phầm

Chất Công thức cấu tạo M

(đvC)

Hiệu suất %

Tính chất sản phầm

3.2 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT

Độ tinh khiết của các chất 3a-c, 5-7, 8a-c được kiểm tra bằng sắc kí lớp

mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy

- Sắc kí lớp mỏng được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 Các chất được hòa tan trong dung môi ethylacetat Khảo sát với hệ dung môi khai triển Bản mỏng được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc với thuốc thử hiện màu Ce (IV) Kết quả các sắc kí đồ được chạy với 2 hệ dung môi khác nhau đều là một vết rõ, gọn Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

- Đo nhiệt độ nóng chảy: các chất có dạng rắn 3a-c, 5-7 được đo nhiệt độ

nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Nhiệt độ nóng chảy các chất dao động trong khoảng 1-2oC Kết quả được trình bày trong bảng 3.2

3.3 KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC

Nhằm khẳng định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được, tiến hành ghi phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) của các chất Kết quả phổ của các chất được trình bày cụ thể ở phần phân tích phổ và phụ lục

3.3.1 Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer, tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), với kĩ thuật màng lỏng giữa 2 tấm NaCl phẳng Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Số liệu phổ IR của các chất 8a-c

Chất Công thức cấu tạo

Số sóng (cm -1 ) ứng với các dao động

ν N-H ν C-H

aromatic

ν C=O amid

ν C=C aromatic ν C-O

3298,95 3075,72 1650,19

1554,28 1458,38 1237,79

3272,21 3129,21 1636,88

1565,63 1439,21 1246,14

1465,73 1217,70

Phổ IR của các chất 8a-c thấy tín hiệu ở vùng 3000 cm-1 của nhóm C-H trong vòng thơm, tín hiệu ở vùng 1570-1440 cm-1 của nhóm C=C trong nhân thơm Tín hiệu đặc trưng cho nhóm C=O amid ở vùng 1640 cm-1 và tín hiệu đặc trưng cho nhóm C-O ở vùng 1250-1200 cm-1 cũng xuất hiện ở cả 3 chất

8a-c Hai chất 8a, 8b có tín hiệu ở vùng 3500-3250 cm-1 đặc trưng cho nhóm

N-H, trong khi 8c không có tín hiệu đặc trưng cho vùng này

3.3.2 Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối lượng được ghi trên máy khối phổ LC-MSD-Trap-SL, tại Viện Hóa sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), dung môi methanol Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.4

Bảng 3.4 Số liệu phổ MS của các chất 8a-c

667,3 (34)

693,3 (100); 695,3 (35)

663,3 (100); 665,1 (35)

Kết quả phân tích phổ cho thấy giá trị m/z của các pic ion giả phân tử

[M+H]+ của các chất 8a-c lần lượt là 665,3 và 667,3; 693,3 và 695,3; 663,3 và 665,1 theo tỉ lệ 3:1, phù hợp với khối lượng phân tử của các chất 8a-c, đồng thời chứng tỏ các hợp chất 8a-c có một nguyên tử Cl trong phân tử