* Chủng vi sinh vật sử dụng. - 5 chủng vi khuẩn Gr(+)
+ Bacillus pumilus NCTC 8241 (Bp) + Bacillus cereus ATCC 9946 (Bc) + Bacillus subtilis ATCC 6633 (Bs)
+ Sarcina lulea ATCC 9341 (SL) + Staphylococcus aureus ATCC 12228 (Sta) - 5 chủng vi khuẩn Gr(-)
+ Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Bre,u) + Escherichia coli ATCC 25922 (Ec) + Salmonella typhi DT 220 (Typh) + Proteus mirabilis BV 108 (Pro) + Shigella ĩlexneri DT 112 (Shi) -1 chủng nấm.
+Candida albicans ATCC 10231 (Can) * Môi trường dinh dưỡng:
- Môi trường canh thang cao thịt - pepton (MT1) - Môi trường Muller - Hinton (M - H)
- Môi trường Sabouraud (MT3) * Nuôi cấy vi sinh vật kiểm định.
Các vi sinh vật kiểm định nhận từ Viện kiểm nghiệm, Viện vệ sinh dịch tễ, Viện mắt, Bộ y tế, Viền 108 trước khi thử được nuôi cấy và nhân giống bằng cách cấy vào các ống thạch nghiêng với môi trường MTt (áp đụng cho vi khuẩn) và môi trường Sabouraud (áp dụng cho vi nấm) tại nhiệt độ Ihích hợp trong thời gian 24h. Sau đó được làm thành các nhũ dịch vi sinh vật với nồng độ 107-108 tế hào /ml với tỷ lệ 1% so với môi trường.
* Chuẩn bị chất thử:
Các chất đem Ihử bao gồm 6 chất (II, III, IV, V VII, VIII) được pha thành các nồng độ 4mg/ml và 2mg/ml Irong dung môi DMF tiến hành thử 2 lần.
- Lần 1: Tiến hành thử với nồng độ 4mg/ml theo phương pháp giấy tẩm chất thử. Thấm địch thử vào các khoanh giấy lọc No 5, đường kính 7mm (đã tiệt trùng ) với một lượng bằng nhau, để bay hơi dưng môi. 4
- Lần 2: Tiến hành thử với nồng độ 2mg/ml theo phương pháp đục lỗ thạch. Đục lỗ thạch thành các ỉỗ có đường kính 7mm.
* Tiến hành:
Các môi trường được hấp tiệt Irùng ở lat, 120°C/20'. Trên các hộp Petri đổ tờ 9-10ml MT1 để làm nền phẳng, để khô. Sau đó cho vào mỗi hộp Petri 8-10ml môi trường M - H (đối với vi khuẩn) hoặc MT3 (đối với vi nấm) đã trộn nhũ dịch vi sinh vật kiểm định (nồng độ 1% so với môi trường) láng đều và đợi thạch nguội.
- Đối với lần 1: Đặt các khoanh giấy đã tẩm dung dịch chất thử lên trên bề mặt Ihạch phân bố cân đối theo sơ đồ đã định.
- Đối với lần 2: Dùng dụng cụ đục lỗ(d = 7mm) đục lỗ thạch. Sau đó dùng pipét nhỏ mộl giọt dung dịch các chất thử vào mỗi lỗ thạch (20 giọt/ml) theo đúng sơ đồ đã định.
- Để các đĩa Petri tại nhiệt độ phòng khoảng 2h để cho hoạt chất khuyếch tán vào môi trường. Đọc kết quả sau 18-20Ỉ1 nuôi cấy ỏ nhiệt độ Ihích hợp: 35- 37°c (đối với vi khuẩn) và 25-30°C (đối với vi nấm). Đo đường kính vòng vô khuẩn chính xác đến 0,imm.
- Song song trong cùng điều kiện chúng tôi tiến hành ihử mẫu trắng DMF và mẫu đối chiếu là acid salicylic (I).
* Kết quả:
Bảng 7 : KẾT QUẢ KHÁNG KI IU Ẩn , K1IÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT THỬ ở NồNG ĐỘ 2 mg / mi
( Kết quả đo đường kính vòng v ô khuẩn xun )
VI SINH VÂT VI KHƯẨN Gr( + ) VIKHƯẦN Gr (-) NẤM
KIỂM ĐỊNH DẪN CHẤT THẾ B . p um ilu s B . ce reu s s . lut ea B . su bti lis St a. au reu s P se u. E . coli s. ty ph i ?■ Can . MẲƯ TRẮNG - - - - - - - - - - Ỷ ACID SALICYLIC - 8 - 8 - - - - - - + Rị- -H R2=*-N02 10 8 - 8 - - 10 - - - + COOH Rj- R2= - C1 9 8 - 8 20 - - - - - + 73 NJ & * o ~ ĩ R|= - H R2= -I - 8 - 8 23 - - - - - + R] = Rị* • Br - 8 - 8 23 - - ■ - - - + R , » - H R2= qjIỊjN-N. 13 11,2 12 20.1 26.3 - 9 - - - Ỷ Rt = - H R2=-SO^Na + - - + + Ỷ Bảng 8 : KẾT QUẢ KHÁNG KHUẨN , KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT THỬ Ở NồNG ĐỘ 4 mg / xnl ( Kết quả đo dường kính vòng vô khuẩn nm )
VI SINH VÂT VIKHUAN Gr ( + ) VI KHIJẲN Gr ( -) NẤM KIỂM ĐỊNH DẪN CHẤT THẾ B . p um ilu s B . ce reu s s . lu tea B . su bti lis St a. au reu s Pse u E . co li s . ty ph i 7o ĩ Can . MẰƯ TRẮNG - - - \CID SALĨCYLIC 10.65 9 9 9.65 t - i - 11.8 11 16 Rị= -h r2= -N02 10.7 9 8.5 9.65 t - t - - 9.65 - COOH1 Rj= R2 = - Cl 10 9 8.5 9.65 t - Ỷ - 11.25 il.25 16.5 Rt= -H R2=-I - 9 10 13.45 t - + - 11.65 10 25 R] = R 2 = - Bt - 9 10.5 9 t - + - 12 11 17 R|= -H R2=C^N = N- 11 12 8.5 26.5 t - + - 9 8.2 20 R,= -H R2= SỌ?Na 8 - 8.5 11.75 t - + - 11.25 9.35 - 38
Nhận xét chung:
- Nhìn chung các dãn chất thế của acid salicylic có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm mạnh hơn chất ban đầu là acid salicylic.
- Các dẫn chất và acid salicylic đều cho tậc dụng tương đối tốt với chủng Bacillus pumilus và Bacilus subtilis, còn với các chủng vi khuẩn Gr(+) khác, chúng có lác dụng yếu hoặc không rõ ràng. Riêng với Staphylococcus aureus, mộl số đẫn chất ihế cổ tác dụng ức chế mạnh.
- Với vi khuẩn Gr(-), ở nồng độ 4mg/ml, các chất có tác dụng khá tốt liên chủng Shigella flexneri, còn với các chủng Gr(-) khác tác dụng rất yếu.
- Trong các chất tổng hợp được có 4 chất (4/7) có tác dụng kháng nấm Candida albicans, trong đó acid 5- azobenzen salicylic có tác dụng kháng nấm tốt nhất.
- Ở nồng độ 4mg/ml, nhìn chung, tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn rõ rệt hơn.
3.6. NHẬN XÉT VẢ ĐÁNH GIÁ:
3.6.1. Tổng hợp hoá học:
- Từ acid salicylic (nguyên liệu sẵn có) thực hiện các phản ứng thế ái điôn tử vào nhân Ihơm của acid salicylic trong điều kiên nhiệl độ và xúc lác thích hợp, chúng tôi đã tổng hợp được 7 chất. Tiến hành kiểm tra cấu trúc qua phổ UV, IR, MS chúng tôi nhận thấy các dẫn chất thế này có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến lổng hợp.
- Phản ứng thế được tiến hành Irong dung môi khan nước (acid acetic đặc, ethanol tuyệt đối...)
- Hiệu suất của phán ứng không chỉ phụ thuộc vào cấu trúc hoá học mà còn phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, thời gian phản ứng. Hệ dung môi kết tinh lại cũng là một yếu tố rất ảnh hưởng tới hiệu suất. Một vài phản ứng tuy dễ xảy ra nhưng hiệu suất chưa cao.
- Các dẫn chất thế tổng hợp được đều là những chất rắn kết tinh không màu hoặc vàng nhạt tới vàng sẫm, tan tốt trong ethanol, methanol, DMF, aceton. ít tan trong nước lạnh, benzen.
3.6.2. Tác dụng sinh học: * Tác dụng kháng khuẩn:
- Các dẫn chất thế tổng hợp được tác dụng ít hay không có tác dụng trên các chủng vi khuẩn Gĩ(-). Các vi khuẩn Gr(-) thường là các vi khuẩn hay gây bệnh và các thuốc kháng khuẩn khó tác dụng. Với 2 chủng vi khuẩn Gr(-) Shigella ílexnerri và Proteus mirabilis, các chất trên có tác dụng song yếu (với nồng độ 4mg/ml nhưng đường kính vòng vô khuẩn nhỏ).
- Với các vi khuẩn Gr(+), các chất cho tác đụng tốt hơn. Hầu hết các chất tổng hợp được có tác đụng tốt trên chủng Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus.
+ Acid 5- azobenzen salicylic có tác dụng tốt trên cả 5 chủng Gr(+) + Các dãn chất thế đều cho tác dụng trên Bacillus subtilis và Sarcina lutea tuy yếu (đường kính vòng vô khuẩn nhổ).
+ Với chủng Staphylococcus atireus các đẫn chất thế có tác dụng tốt đó là: dẫn chất thê Clo, Iod, Brom và Azobenzen. Trong đó (lẫn chất azobenzen có tác dụng ức chế mạnh nhất (đường kính vòng vô kluiẩn lớn).
+ Các chất thế tổng hợp được cũng có tác dụng trên Bacillus pumilus và Bacillus cereus nhimg còn tác dụng yếu (đường kính vòng vô khuẩn nhỏ).
+ Khả năng kháng khuẩn của các chất tổng hợp được nói chung là mạnh hơn khả năng kháng khuẩn của aciđ salicylic.
* Tác đụng kháng nấm:
+ Các dẫn chất thế tổng hợp được đều cho tác dụng kháng nấm tốt trên nấm gảy bệnh Canđida albicans (trừ chất II và VII). Khả năng này .tăng hơn so với chất ban đầu là acid salicylic.
+ Riêng chất I, VII không có tác dụng trên nấm Candida albicans.
+ Chất VI (dẫn chất azobenzen) có tác dụng ức chế mạnh nhất (vòng vô khuẩn có đường kính rõ rệt).
* Từ kết quả thực nghiệm thu được có thể sơ bộ nhận xét mối liên quan giữa cấu trúc hoá học và tác đụng kháng khuẩn, kháng nấm:
+ Sự có mặt của nhóm nitro trong phân tử acid salicylic không làm tăng tác dụng kháng khuẩn, làm giảm khả năng kháng nấm.
+ Việc gắn nhóm halogen (-C1, -Br, -I) vào nhân thơm làm tăng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm rõ rệt. Trong đó Iod trên nhân thơm làm tăng khả năng kháng nấrn nhất so với chất ban đầu.
+ Nhóm thế sulfonic (-SO?H) làm giảm khả năng kháng nấm và tác dụng kháng nấm kém hơn.
+ Nhóm thế azobenzen (C6H5-N=N-) mở tông phổ kháng khuẩn Gr(+) và tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tăng lên rõ rệt.
* Tuy nhiên tất cả những nhận xét trên đây mới chỉ là thăm dò sơ bộ. Chúng tôi chỉ tiến hành thử trong 2 lần ở 2 nồng độ khác nhau, để đưa ra kết luận chính xác cần phải lặp lại các thử nghiệm nhiều lần hơn và mang tính chất định lượng. Song vì điều kiện thời gian không cho phép nên chúng tôi mới thực hiện được ở mức độ định tính. Hy vọng rằng, việc nghiên cứu tổng hợp và xác định tác dụng sinh học của các dẫn chất thế của acid alicylic sẽ được tiếp tục và ở mức độ nghiên cứu chuyên sâu hơn.
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.
- Qua kết quả thực nghiệm đã trình bày, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Đi từ acid salicylic (nguyên liệu sẩn có) chúng tôi đã được tổng hợp được 7 dẫn chất thế trên nhân thơm.
2. Các dẫn chất thế tổng hợp được cũng có một số chất đã được đề cập trong các tài liệu (có ghi ở phần phụ lục).
3. Tất cả các chất tổng hợp được đều được xác định độ tinh khiết bằng SKLM, đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc hoá học bằng phân tích phổ ƯV, IR, MS. Kêt quả thu được cho thấy các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến ban đầu.
4. Chúng tôi đã tiến hành thử sơ bộ tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được trên 10 chủng vi khuẩn và 1 chủng nấm. Kết quả cho thấy.
4- Các chất tổng hợp được có tác dụng tốt trên các chủng Gr(+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Các chủng Gr(+) còn lại có tác dụng, nhưng không mạnh hơn acid salicylic.
. + Trên chủng Gr(-) các chất tổng hợp được có tác dụng nhưng tác dụng không mạnh hơn ácid salicylic. Trên chủng: Shigella flexneri, Proteus mirabilis, các chủng Gr(-) khác không có tác dụng.
+ Các dẫn chất thế halogen, azobenzen có tác đụng tốt trên nấm Candida albicans và mạnh hơn tác đụng của aciđ salicylic. Các chất còn lại không có tác dụng trên nấm Candida albicans.
5. Qua quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, chúng tôi đã thu nhận được một số kiến thức về phương pháp tổng hợp hữu cơ, xác định cấu trúc hữu cơ tổng hợp được. Bước đầu làm quen vói nghiên cứu khoa học, tôi rút ra bài học đó là tính kiên trì, cẩn thận, trung thực và sáng tạo.
- Đề xuất: Trong điều kiện cho phép chúng tôi mong muốn được nghiên cứu tiếp các dẫn xuất thế khác của acid salicylic với các nhóm chức khác nhau gắn trên nhân thơm và thăm dò tác đụng sinh học. Qua đó giúp cho việc tìm ra những chát mới có tác đụng kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hơn có ý nghĩa trong việc điều trị lâm sàng.