Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học cây trâu cổ ficus pumila

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC ====== PHẠM HỒNG CÚC NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY TRÂU CỔ Ficus pumila KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu HÀ NỘI, tháng năm 2019 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC ====== PHẠM HỒNG CÚC NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY TRÂU CỔ Ficus pumila KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI, tháng năm 2019 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng tận tình bảo giúp đỡ em trình thực hồn thiện khóa luận tốt nghiệp “Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Xuân Cƣờng TS Trần Thị Hồng Hạnh, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ em q trình hồn thiện khóa” luận “Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện hóa sinh biển anh chị phòng Dƣợc liệu biển, Viện hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện cho em đƣợc sử dụng thiết bị tiên tiến viện để học tập, nghiên cứu hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp mình.” Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Hóa học, Trƣờng đại học Sƣ phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em q trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Qua em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè quan tâm, giúp đỡ, động viên em q trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Trong q trình nghiên cứu thực khóa luận thiếu sót Vì vậy, em mong nhận đƣợc đóng góp thầy cơ, bạn bè để khóa luận em đƣợc hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh viên Phạm Hồng Cúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày khóa luận: “Nghiên cứu sơ thành phần hóa học Trâu cổ - Ficus pumila” “Dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Bằng hoàn toàn trung thực không trùng với kết tác giả khác” Nếu có vấn đề khơng tơi xin chịu hồn toàn trách nhiệm Sinh viên Phạm Hồng Cúc DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT [α]D 13 C - NMR H - NMR H - 1H COSY 2D - NMR CC DEPT EI - MS FAB - MS HMBC HMQC HR – FAB - MS IR Me MS NOESY TLC Độ quay cực Specific Optical Rotation Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 13 Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy H - 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều Two – Dimensional NMR Sắc ký cột Column Chromatography Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ khối lƣợng va chạm electron Electron Impact Mass Spectrometry Phổ khối lƣợng bắn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry Hetoronuclear Multiple Bond Connectivity Hetoronuclear Multiple Quantum Coherence Phổ khối lƣợng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy Nhóm metyl Phổ khối lƣợng Mass Spectroscopy Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU Hình 1.1: Hình ảnh mẫu Trâu cổ (Ficus pumila) Hình 3.1: Sơ đồ chiết phân lớp mẫu Trâu cổ Hình 3.2: Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn diclometan Trâu cổ Hình 3.3.a: Cấu trúc hóa học hợp chất Hình 3.3.b: Phổ 1H NMR hợp chất Hình 3.3.c: Phổ 13C NMR hợp chất Hình 3.3.d: Phổ HSQC hợp chất Hình 3.3.e: Phổ HMBC hợp chất Hình 3.3.f: Các tƣơng tác HMBC hợp chất Hình 3.4.a: Cấu trúc hóa học hợp chất Hình 3.4.b: Phổ 1H NMR hợp chất Hình 3.5.a: Cấu trúc hóa học hợp chất Hình 3.5.b: Phổ 1H NMR hợp chất Hình 3.5.c: Phổ 13C NMR hợp chất FP9 Hình 3.5.d: Phổ HSQC hợp chất Hình 3.5.e: Phổ HMBC hợp chất Hình 3.5.f: Các tƣơng tác HMBC hợp chất Bảng 3.1: Số liệu phổ hợp chất chất so sánh Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR hợp chất chất so sánh MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Những nghiên cứu tổng quan Trâu cổ 1.1.1 Giới thiệu Trâu cổ 1.1.2 Phân bố, sinh thái 1.1.3 Hoạt tính sinh học 1.1.4 Công 1dụng 1.1.5 Thành phần hóa học 1.2 Giới thiệu lớp chất flavonoid [6, 7] 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Các nhóm flavonoid 1.3 Tổng quan phƣơng pháp chiết mẫu thực vật [8, 9] 13 1.3.1 Chọn dung môi chiết 13 1.3.2 Quá trình chiết 15 1.4 Phƣơng pháp sắc kí phân lập hợp chất hữu 16 1.4.1 Đặc điểm chung 17 1.4.2 Cơ sở phƣơng pháp sắc kí 17 1.4.3 Phân loại phƣơng pháp sắc kí 17 1.5 Một số phƣơng pháp hóa lý xác định cấu trúc hợp chất hữu [10] 21 1.5.1 Phổ hồng ngoại (IR) 22 1.5.2 Phổ khối lƣợng (MS) 22 1.5.3 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) 23 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Mẫu thực vật 26 2.2 Phƣơng pháp phân lập hợp chất 26 2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC) 26 2.2.2 Sắc kí cột (CC) 26 2.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 26 2.4 Dụng cụ thiết bị 27 2.4.1 Dụng cụ thiết bị tách chiết 27 2.4.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc hóa học hợp chất 27 2.5 Hoá chất 27 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28 3.1 Chiết xuất phân lập chất 28 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 29 3.2.1 Hợp chất - Narigenin 29 3.2.2 Hợp chất - Apigenin 35 3.2.3 Hợp chất 3: Genistein 36 KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 MỞ ĐẦU “Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao 80%, lƣợng mƣa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 – 270C Đó điều kiện thích hợp cho thực vật phát triển Do hệ thực vật Việt Nam vô phong phú, đa dang với khoảng 12000 loài, có tới 4000 lồi đƣợc nhân dân ta dùng làm thảo dƣợc” [1] Điều có ý nghĩa quan trong phát triển ngành y tế số ngành khác Hệ thực vật phong phú đƣợc coi tiền đề cho phát triển ngành hóa học hợp chất thiên nhiên nƣớc ta Từ xƣa ông cha ta sử dụng nhiều loại cỏ tạo phƣơng thuốc dân gian để chữa bệnh, bồi bổ thể hay tạo mùi thơm…nhƣ cam thảo để nhiệt, hạ huyết áp, tía tơ để giải cảm, nhân sâm để tăng cƣờng sức đề kháng, sả để tạo mùi thơm Và từ nhiều kỷ hợp chất đƣợc phân lập từ cỏ đƣợc ứng dụng rộng rãi ngành khác nhƣ nông nghiệp, công nghiệp, chúng đƣợc dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm… “Ngày nay, sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày đƣợc ngƣời quan tâm ứng dụng rộng rãi đặc tính độc, dễ hấp thụ không làm ảnh hƣởng xấu đến môi trƣờng xung quanh Theo tài liệu cơng bố nay, có khoảng 60% - 70% loại thuốc chữa bệnh đƣợc lƣu hành giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc thiên nhiên” Với cơng trình nghiên cứu phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học đại, có kết cao, ngƣời tiến hành nghiên cứu mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu chất tách từ dịch chiết Nhờ mà phát nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô thuận lợi cho việc phát triển ngành y dƣợc công chữa bệnh cứu ngƣời Chính việc nghiên cứu thành phần hóa học từ cỏ thiên nhiên có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao.Từ mà lồi thực vật đƣợc nhà khoa học đặc biệt quan tâm Cây Trâu cổ (Ficus pumila) đƣợc biết loại đƣợc sử dụng y học dân gian để chữa bệnh nhƣ liệt dƣơng, đau lƣng, đau đầu, chóng mặt, đau khớp, đau thần kinh tọa, nhức mỏi chân tay, kinh nguyệt không Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học Trâu cổ nhằm đặt sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, hiệu có ý nghĩa quan trọng việc phát triển y học Việt Nam đại dựa phƣơng pháp cổ truyền Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên lựa chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu sơ thành phần hóa học Trâu cổ Ficus pumila”, với mục đích nhằm góp phần làm rõ thêm hiểu biết thành phần hóa học Từ tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu lĩnh vực tìm kiếm phƣơng thuốc nhƣ giải thích đƣợc tác dụng chữa bệnh thuốc cổ truyền Việt Nam Đây yếu tố quan trọng có ý nghĩa thực tiễn y học Việt Nam Nhiệm vụ đề tài: Thu mẫu Trâu cổ, xử lí mẫu tạo dịch chiết Nghiên cứu phân lập hợp chất hóa học từ Trâu cổ Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc silica gel pha thƣờng rửa giải hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (20:1) thu đƣợc phân đoạn B1A (20mg) B1B Phân đoạn B1A đƣợc tiếp tục tinh chế sắc ký cột sephadex LH-20, sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOHH2O (1.5:1) thu đƣợc hợp chất (6 mg) Phân đoạn B3 (382 mg) đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel pha thƣờng rửa giải hệ dung môi n-hexan: CH2Cl2: EtOAc (1.5:1:1) thu đƣợc hợp chất (10mg) phân đoạn B3A Tiếp tục tinh chế phân đoạn B3A cột sắc ký pha đảo, dung môi axeton: nƣớc 2:1 thu đƣợc hợp chất (5mg) Hình 3.2: Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn diclometan Trâu cổ 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 3.2.1 Hợp chất - Narigenin Hình 3.3.a: Cấu trúc hóa học hợp chất 29 Hợp chất thu đƣợc dƣới dạng bột màu vàng nhạt Các phổ NMR cho thấy xuất hợp chất khung flavan với tín hiệu đặc trƣng Phổ 1H NMR xuất tín hiệu hệ vòng thơm kiểu A2B2 đƣợc xác định hai tín hiệu có cƣờng độ pic mạnh gấp đơi C 6.83 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3, H-5) 7.32 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2, H-6), hai proton dạng meta C 5.90 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 6.14 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6) tín hiệu nhóm metin δH 5.34 (1H, dd, J = 2.5, 13.0 Hz, H-2) nhóm metylen δH 2.71 (1H, dd, J = 3.0, 17.0 Hz, Ha-3), 3.11 (1H, d, J = 2.5, 13.0 Hz, Hb-3) Hình 3.3.b: Phổ 1H NMR hợp chất Phổ 13C NMR xuất tín hiệu 15 nguyên tử cacbon đặc trƣng cho khung flavan với vòng B có dạng kaempferol dựa vào tín hiệu C 131.10 (C-1), 129.02 (C-2, 6), 116.33 (C-3, 5), 159.02 (C-4), hai tín hiệu C 97.06 (C-6) 96.17 (C-8) đặc trƣng cho hai vị trí C-8, C-6 vòng A hai vị trí C-5 C-7 bị Ngồi phổ cacbon xuất tín hiệu vị trí lại khung flavan δC 80.47 (C-2), 44.31 (C-3) 197.77 (C-4) Phổ HMBC cho thấy tƣơng tác H-2 với C-4, C-1', C-2' C-6', tƣơng tác H-3 với C-2, C-4, C-1' 30 Hình 3.3.c: Phổ 13C NMR hợp chất So sánh số liệu phổ hợp chất với tài liệu cơng bố [11] khẳng định hợp chất flavan có tên gọi Naringenin 31 Hình 3.3.d: Phổ HSQC hợp chất 32 Hình 3.3.e: Phổ HMBC hợp chất 33 Bảng 3.1: Số liệu phổ hợp chất chất so sánh C # δC δCa,b 78.4 80.47 DEPT δHa,c dạng píc (J = Hz) CH 5.34 HMBC dd (2.5, 3, 4, 1, 2, 6 dd (3.0, 2, 4, 1 dd (2.5, 13.0) 42.1 44.31 CH2 2.71 17.0) 3.11 17.0) # 196.1 197.77 C - 163.6 165.42 C - 96.0 97.06 CH 5.89 d (2.0) 166.7 168.41 C - 95.1 96.17 CH 5.90 d (2.0) 162.9 164.86 C - 10 101.9 103.35 C - 1 129.0 131.10 C - 2, 6 128.2 129.02 CH 7.32 d (8.5) 2, 3, 4 3, 5 115.3 116.33 CH 6.83 d (8.5) 1, 2, 4 4 157.7 159.02 C - 5, 7, 8, 10 6, 7, δC Naringenin [12], ađo DMSO-d6, b 125 MHz, c 500 MHz Hình 3.3.f: Các tương tác HMBC hợp chất 34 3.2.2 Hợp chất - Apigenin Hình 3.4.a: Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất thu đƣợc dƣới dạng bột màu vàng Phổ 1H NMR cho phép dự đốn hợp chất có dạng khung flavon với tín hiệu proton thuộc vùng trƣờng đặc trƣng cho proton vòng thơm Phổ 1H NMR xuất tín hiệu hệ vòng thơm dạng A2B2 với tín hiệu pic có cƣờng độ mạnh gấp đôi δH 6.85 (2H, d, J = 9.0 Hz, H-2', H-6'), 7.79 (2H, d, J = 8.5 Hz, H3', H-5'), tín hiệu ba proton olefin C 5.79 (1H, s, H-8), 6.04 (1H, s, H6) 6.47 (1H, s, H-3) Cả proton có dạng singlet chứng tỏ nguyên tử cacbon xung quanh bị hồn tồn Nhƣ khẳng định hợp chất Apigenin, hợp chất flavon phổ biến loài thực vật Hình 3.4.b: Phổ 1H NMR hợp chất 35 3.2.3 Hợp chất - Genistein Hợp chất thu đƣợc dƣới dạng tinh thể màu trắng Phổ 1H NMR đặc trƣng cho hợp chất có khung flavon với tín hiệu hai cặp proton vòng thơm đối xứng δH 7.39 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2', H-6'), 6.86 (2H, dd, J = 8.5 Hz, H-3', H-5' ) gợi ý cấu trúc vòng B có dạng keampferol, tín hiệu hai proton dạng meta δH 6.23 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), 6.35 (1H, d, J = 2.0 Hz, H8) tín hiệu proton bị lập hồn tồn H 8.07 (1H, s), chuyển dịch mạnh phía trƣờng yếu proton H 8.07 gợi ý hợp chất có dạng isoflavon Hình 3.5.a: Cấu trúc hóa học hợp chất Hình 3.5.b: Phổ 1H NMR hợp chất 36 Phổ 13C NMR xuất tín hiệu 15 ngun tử cacbon, tín hiệu δC 123.38 (C-1), 131.39 (C-2, 6), 116.28 (C-3, 5), 158.81 (C-4) đặc trƣng cho vòng B với hai vị trí dạng para Cấu trúc isoflavon hợp chất FP9 đƣợc khẳng định chắn dựa vào tƣơng tác phổ HMBC Phổ HMBC cho thấy tƣơng tác H-2 (δH 8.07) với C-3 (δC 124.72), C-4 (δC 182.21), C-10 (δC 159.80) nhƣ tƣơng tác H-2' (δH 7.39) với C-3 So sánh số liệu phổ NMR hợp chất với hợp chất genistein cơng bố [11] thấy có phù hợp hồn tồn tất vị trí tƣơng ứng Nhƣ hợp chất có tên gọi Genistein Hình 3.5.c: Phổ 13C NMR hợp chất 37 Hình 3.5.d: Phổ HSQC hợp chất 38 Hình 3.5.e: Phổ HMBC hợp chất 39 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR hợp chất chất so sánh δHa,c δC δCa,b DEPT 153.6 154.74 CH 122.4 124.72 C - 180.2 182.21 C - 162.1 163.84 C - 98.6 100.35 CH 164.3 166.62 C 93.7 94.94 CH 157.6 159.80 C - 10 104.6 105.80 C - 1 121.4 123.38 C - 2, 6 130.0 131.39 CH 7.39 d (8.5) 2, 3, 4 3, 5 115.2 116.28 CH 6.86 d (8.5) 1, 2, 4 4 157.6 158.81 C C # # mult (J in Hz) 8.07 s 6.23 d (2.5) HMBC 3, 4, 5, 7, 8, 10 6.35 d (2.5) 6, 7, - δC genistein [11] đo DMSO, ađo methanol-d4, b125 MHz, c500 MHz Hình 3.5.f: Các tương tác HMBC hợp chất 40 KẾT LUẬN Từ dịch chiết Diclometan Trâu cổ (Ficus pumila), phƣơng pháp sắc ký kết hợp phân lập đƣợc hợp chất Cấu trúc hợp chất đƣợc xác định dựa phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều, hai chiều Các hợp chất đƣợc xác định là: naringenin (1), apigenin (2) genistein (3) 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập Trần Toàn, Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tập I, 2004, [tr 875-876] [2] Ragasa C Y., Juan E., Rideout J A A triterpene from Ficus pumila J Asian Nat Prod Res, 1999, 1(4), [tr 269-275] [3] Kitajima J., Kimizuka K., Tanaka Y Three new sesquiterpenoid glucosides of Ficus pumila fruit Chem Pharm Bull, 2000, 48(1), [tr 7780] [4] Leong C N., Tako M., Hanashiro I., Tamaki H Antioxidant flavonoid glycosides from the leaves of Ficus pumila L Food Chem, 2008, 109(2), [tr 415-420] [5] Bai M., Cai Y., Wu S Y., Song X P., Chen G Y., Zheng C J., Han C R A new norisoprenoid from the leaves of Ficus pumila Nat Prod Res, 2019, in press [6] K A P Carbon - 13 NMR of flavonoids Elsevier: 1989, Vol [7] Mabry F J., Markman R B., Thomas M B The sysrematic identification of flavonoids Springer Verlag: 1970, Vol [8] Sarker S D., Nahar L Natural Products Isolation Third Edition ed.; Humana Press Inc : Totowa, New Jersey, 2012, Vol [9] Bucar F., Wube A., Schmid M Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds Natural Product Reports, 2013, 30(4), [tr 525-545] [10] Silverstein R M., Webster F X., Kiemle D J., Bryce D L Spectrometric Identification of Organic Compounds 8th Edition ed.; Wiley: 2014, Vol 42 [11] Lane G A., Newman R H Isoflavones from Lupinus angustifolius root Phytochemistry, 1986, 26(1), [tr 295-300] [12] Shen C.-C., Chang Y.-S., Hott L.-K Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids Phytochemistry, 1993, 34(3), [tr 843-845] 43 ...TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA HÓA HỌC ====== PHẠM HỒNG CÚC NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY TRÂU CỔ Ficus pumila KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu Ngƣời... khóa luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu sơ thành phần hóa học Trâu cổ Ficus pumila , với mục đích nhằm góp phần làm rõ thêm hiểu biết thành phần hóa học Từ tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu. .. bơi ngồi chữa mụn nhọt, đầu đinh, ghẻ lở, dị ứng sơn [1] 1.1.5 Thành phần hóa học Các nghiên cứu thành phần hóa học Trâu cổ cho thấy thành phần hóa học lồi bao gồm hợp chất: tritecpen, sesquitecpen,