Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học cây trâu cổ ficus pumỉla

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI • • • • KHOA HÓA HỌC PHẠM HỒNG CÚC NGHIÊN CỨU Sơ Bộ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY TRÂU CỔ Ficus pumila KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐẠI HỌC • ••• Chun ngành: Hóa học hữu TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI • • • • KHOA HĨA HỌC PHẠM HỒNG CÚC HÀ NỘI, tháng năm 2019 NGHIÊN CỨU Sơ Bộ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY TRÂU CỔ Ficus pumila KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐẠI HỌC • ••• Chun ngành: Hóa học hữu Ngưòi hướng dẫn khoa học PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG HÀ NỘI, tháng năm 2019 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng tận tình bảo giúp đỡ em trình thực hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Xuân Cường TS Trần Thị Hồng Hạnh, Yiện Hóa sinh biển, Yiện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Yiệt Nam tận tình hướng dẫn giúp đỡ em q trình hồn thiện khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện hóa sinh biển anh chị phòng Dược liệu biển, Viện hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho em sử dụng thiết bị tiên tiến viện để học tập, nghiên cứu hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Hóa học, Trường đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em q trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Qua em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè quan tâm, giúp đỡ, động viên em q trình học tập hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Trong q trình nghiên cứu thực khóa luận thiếu sót Vì vậy, em mong nhận đóng góp thày cơ, bạn bè để khóa luận em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh viên Phạm Hồng Cúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu, số liệu trình bày khóa luận: “Nghiên cứu sơ thành phần hóa học Trâu cổ - Ficus pumỉla” Dưới hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Văn Bằng hoàn toàn trung thực không trùng với kết tác giả khác Nếu có vấn đề khơng tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Sinh viên Phạm Hồng Cúc [a]D 13 C - NMR - NMR J H - JH COSY 2D - NMR CC DEPT El-MS FAB - MS HMBC HMQC ĐỘ quay cực Specific Optical Rotation Phô cộng hưởng tò hạt nhân cacbon 13 Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phơ cộng hưởng tò hạt nhân proton Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy ! H - !H Chemical Shift Correlation Spectroscopy Phô cộng hưởng từ hạt nhân hai chiêu Two Dimensional NMR Săc ký cột Column Chromatography Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phô khôi lượng va chạm electron Electron Impact Mass Spectrometry Phô khôi lượng băn phá nguyên tử nhanh Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry Hetoronuclear Multiple Bond Connectivity Hetoronuclear Multiple Quantum Coherence HR - FAB - MS IR Phô khôi lượng băn phá nguyên tử nhanh phân giải cao High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry Phô hông ngoại Infrared Spectroscopy Me MS Nhóm metyl NOESY TLC Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Săc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography Phơ khơi lượng Mass Spectroscopy DANH MỤC CÁC HÌNH, sơ ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU Hình 1.1: Hình ảnh mẫu Trâu cổ (FICUS PUMILA) Hình 3.1 : Sơ đồ chiết phân lớp mẫu Trâu cổ Hình 3.2: Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn diclometan Trâu Hình 3.3.a: cấu trúc hóa học hợp chất Hình 3.3.b: Phổ *H NMR hợp chất Hình 3.3.c: Phổ 13c NMR hợp chất Hình 3.3.d: Phổ HSQC hợp chất Hình 3.3.e: Phổ HMBC hợp chất Hình 3.3.f: Các tương tác HMBC hợp chất Hình 3.4.a: cấu trúc hóa học hợp chất Hình 3.4.b: Phổ *H NMR hợp chất Hình 3.5.a : cấu trúc hóa học hợp chất Hình 3.5.b: Phổ *H NMR hợp chất Hình 3.5.c: Phổ 13c NMR hợp chất FP9 Hình 3.5.d: Phổ HSQC hợp chất Hình 3.5.e: Phổ HMBC hợp chất Hình 3.5.f: Các tương tác HMBC hợp chất Bảng 3.1: Số liệu phổ hợp chất chất so sánh Bảng 3.2: số liệu phổ NMR hợp chất chất so sánh MỤC LỤC « « MỞ ĐẦU .1 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Những nghiên cứu tổng quan Trâu cổ 1.1.1 Giới thiệu Trâu cổ 1.1.2 Phân bố, sinh thái .4 1.1.3 Hoạt tính sinh học .4 1.1.4 Công ldụng 1.1.5 Thành phần hóa học 1.2 Giới thiệu lớp chất ílavonoid [6, 7] 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Các nhóm Aavonoid 1.3 Tổng quan phương pháp chiết mẫu thực vật [ 8, 9] .13 1.3.1 Chọn dung môi chiết 13 1.3.2 Quá trình chiết 15 1.4 Phương pháp sắc kí phân lập hợp chất hữu 16 1.4.1 Đặc điểm chung .17 1.4.2 Cơ sở phương pháp sắc kí 17 1.4.3 Phân loại phương pháp sắc kí 17 1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc hợp chất hữu [10] ' ! 21 1.5.1 Phổ hồng ngoại (IR) 22 1.5.2 Phổ khối lượng (MS) .22 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 26 2.1 Mẩu thực vật .26 2.2 Phương pháp phân lập hợp chất 26 2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC) 26 2.2.2 Sắc kí cột (CC) 26 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 26 2.4 Dụng cụ thiết bị 27 2.4.1 Dụng cụ thiết bị tách chiết 27 2.4.2 Dụ ng cụ thiết bị xác định cấu trúc hóa học hợp chất 27 2.5 Hoá chất 27 Chương 3: THựC NGHIỆM YÀ KẾT QUẢ 28 3.1 Chiết xuất phân lập chất 28 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 29 3.2.1 Hợp chất - Narigenin 29 3.2.2 .Hợp chất - Apigenin 35 3.2.3 .Hợp chất 3: Genistein 36 KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 MỞ ĐẦU “Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩm cao 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 - 27°c Đó điều kiện thích hợp cho thực vật phát triển Do hệ thực vật Yiệt Nam vô phong phú, đa dang với khoảng 12000 lồi, có tới 4000 lồi nhân dân ta dùng làm thảo dược” [1] Điều có ý nghĩa quan trong phát triển ngành y tế số ngành khác Hệ thực vật phong phú coi tiền đề cho phát triển ngành hóa học hợp chất thiên nhiên nước ta Từ xưa ông cha ta sử dụng nhiều loại cỏ tạo phương thuốc dân gian để chữa bệnh, bồi bổ thể hay tạo mùi thơm cam thảo để nhiệt, hạ huyết áp, tía tơ để giải cảm, nhân sâm để tăng cường sức đề kháng, sả để tạo mùi thơm Và từ nhiều kỷ hợp chất phân lập tò cỏ ứng dụng rộng rãi ngành khác nông nghiệp, công nghiệp, chúng dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm mỹ phẩm Ngày nay, sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày người quan tâm ứng dụng rộng rãi đặc tính độc, dễ hấp thụ không làm ảnh hưởng xấu đến môi trường xung quanh Theo tài liệu cơng bố nay, có khoảng 60% - 70% loại thuốc chữa bệnh lưu hành giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc thiên nhiên Với cơng trình nghiên cứu phương pháp thử hoạt tính sinh học đại, có kết cao, người tiến hành nghiên cứu mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu chất tách từ dịch chiết Nhờ mà phát nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học q báu, tạo điều kiện vô thuận lọi cho việc phát triển ngành y dược công chữa bệnh cứu người Chính việc nghiên cứu thành phàn hóa học từ cỏ thiên nhiên có ý nghĩa khoa học thực tiễn cao.Từ mà loài thực vật nhà khoa học đặc biệt quan tâm Cây Trâu cổ (FICUS PUMILA) biết loại sử dụng y học dân gian để chữa bệnh liệt dương, đau lưng, đau đầu, chóng mặt, đau khớp, đau thần kinh tọa, nhức mỏi chân tay, kinh nguyệt không Yiệc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học Trâu cổ nhằm đặt sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, hiệu có ý nghĩa quan trọng việc phát triển y học Yiệt Nam đại dựa phương pháp cổ truyền Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nên tơi lựa chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu sơ thành phần hóa học Trâu cổ - FICUS pumỉỉa”, với mục đích nhằm góp phần làm rõ thêm hiểu biết thành phần hóa học Từ tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu lĩnh vực tìm kiếm phương thuốc giải thích tác dụng chữa bệnh thuốc cổ truyền Việt Nam Đây yếu tố quan trọng có ý nghĩa thực tiễn y học Việt Nam Nhiệm vụ đề tài: Thu mẫu Trâu cổ, xử lí mẫu tạo dịch chiết Nghiên cứu phân lập hợp chất hóa học từ Trâu cổ Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập sánh, kết hợp khác Đặc biệt phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định xác chiều dài mạch, phân tử có đơn vị đường việc xác định xác loại đường cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân xác định phương pháp so sánh LCMS GC-MS với đường chuẩn dự kiến CHƯƠNG2 ĐỐI TƯỢNG V PHNG PHP NGHIấN cu 2.1 Mu thc võt ô Đối tượng nghiên cứu mẫu cành nhỏ Trâu cổ (FICUS PUMỈLA) thu hái Nghĩa Đô - Hà Nội vào tháng 3/2014 Tên khoa học TS Nguyễn Thế Cường - Yiện Sinh thái tài nguyên sinh vật giám định Mau tiêu lưu giữ Yiện Hóa sinh biển , Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Yiệt Nam 2.2 Phương pháp phân lập họp chất 2.2.1 Sắc kí lớp mỏng (TLC) Thực mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254S F254 RPig (Merck-Đức) Các vết chất phát đèn tử ngoại hai bước sóng 254 365 nm dùng thuốc thử dung dịch H 2SO4 10% phun lên mỏng sấy nhiệt độ cao màu 2.2.2 Sắc kí cột (CC) Được tiến hành với chất hấp phụ Silica gel pha thường pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica gel pha đảo OSD YMC (30-50 |j.m, FuJisilisa Chemical Ltd) Phát chất đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm 368 rnn dùng thuốc thử dung dịch H2SO4 10% phun lên mỏng, sấy khơ hơ nóng tò từ đến màu 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN (NMR): Được đo máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.4 Dung cu v thit b ôo 2.4.1 Dng c thiết bị tách chiết Các dụng cụ thiết bị dùng cho tách chiết tinh chế chất sử dụng bao gồm: + Bình chiết 30 lít + Phễu chiết lít + Máy quay chân khơng + Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 368 nm + Tủ sấy chân không + Máy sấy + Micropipet + Bình sắc ký loại phân tích điều chế + Cột sắc ký pha thường pha đảo với kích cỡ khác + Dung dịch thuốc thử + Bếp điện 2.4.2 Dụng cụ thiết bị xác đinh cẩu trúc hóa học hợp chất Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer 2.5 Hoá chất + Silica gel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck + Silica gel pha đảo ODS YMC RP18 (150 p,m, FuJisilisa Chemical Ltd) + Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) + Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck) + Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck) + Các loại dung môi hữu metanol, etanol, etyl axetate, clorofoc, diclometan, N-hexan, axetone, v.v Chương THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Chiết xuất phân lập chất Mau cành nhỏ khô trâu cổ FICUS PUMILA L.(2 kg) sau làm sạch, loại bỏ tạp chất nghiền thành bột mịn Bột khô sau xay đem chiết lần với methanol có dùng siêu âm Các dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc, gom lại loại bỏ dung môi áp suất giảm thu 150 g cặn chiết MeOH tổng Cặn hòa tan vào nước cất (2 lít) chiết phân pha với dung môi n-hexan, diclometan (CH2CI2) etyl axetat (EtOAc) ( x lít) thu cặn chiết tương ứng n-hexan (A,70 g), CH2C12 (B, g), EtOAc (C, 3.7 g) dịch nước HÌNH 3.1: SƠ ĐỒ CHIẤ PHÂN LỚP MẪU CÂY TRÂU CỔ Cặn CH2CI2 (B, 9g) tiến hành phân tách thô thành ba phân đoạn (BI - B3) sắc ký cột silica gel pha thường vói hệ dung môi N-hexan: axeton/5:l Phân đoạn BI (500mg) tiếp tục phân tách sắc ký cột - silica gel pha thường rửa giải hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (20:1) thu phân đoạn BIA (20mg) B1B Phân đoạn BIA tiếp tục tình chế sắc ký cột sephadex LH-20, sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH- H20 (1.5:1) thu hợp chất (6 mg) Phân đoạn B3 (382 mg) tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải hệ dung môi n-hexan: CH2C12: EtOAc (1.5:1:1) thu hợp chất (lOmg) phân đoạn B3A Tiếp tục tình chế phân đoạn B3A cột sắc ký pha đảo, dung môi axeton: nước 2:1 thu hợp chất (5mg) Hình 3.2: Sơ đồ phân ỉập hợp chất từ phân đoạn dỉcỉometan Trâu cổ 3.2 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 3.2.1 Hợp chải - Narigenin ĨH Ổ Hình 3.3.a: cẩu trúc hóa học hợp chất 3 Hợp chất thu dạng bột màu vàng nhạt Các phổ NMR cho thấy xuất hợp chất khung flavan với tín hiệu đặc trưng Phổ *H NMR xuất tín hiệu hệ vòng thơm kiểu A 2B2 xác định hai tín hiệu có cường độ pic mạnh gấp đôi ôc 6.83 (2H, d,J = 8.5 Hz, H-3', H-5') 7.32 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2', H-6'), hai proton dạng META ôc 5.90 (1H, d,J = 2.0 Hz, H-8), 6.14 (1H, d,J = 2.0 Hz, H-6) tín hiệu nhóm metin Ô H 5.34 (1H, dd, J = 2.5, 13.0 Hz, H-2) nhóm metylen Ơh 2.71 (1H, dd, J = 3.0, 17.0 Hz, Ha-3), 3.11 (1H, d, J = 2.5, 13.0 Hz, Hb-3) W/ "il I" JUU ẲL I .I .I .I .I .I VY 7.4 3.2 7.2 3.1 3.0 2.9 2.8 pptn S Il Ị| A 5.4 V ppm ¥ 13 HÌNH 3.3.B: PHỔ H NMR CỦA HỢP CHẮT Phổ c NMR xuất tín hiệu 15 nguyên tử cacbon đặc trưng cho khung flavan vói vòng B có dạng kaempferol dựa vào tín hiệu Sc 131.10 (C-l'), 129.02 (C-2', 6'), 116.33 (C-3', 5'), 159.02 (C-4'), hai tín hiệu ơc 97.06 (C-6) 96.17 (C-8) đặc trưng cho hai vị trí C-8, C-6 vòng A hai vị trí C-5 C-7 bị Ngồi phổ cacbon xuất tín hiệu vị trí lại khung flavan ôc 80.47 (C-2), 44.31 (C-3) 197.77 (C-4) Phổ HMBC cho thấy tương tác H-2 với C-4, C-l’, C-2’ C-6\ tương tác H-3 với C-2, C-4, C-l’ 3 =- ằe ôr tfợ KJ ^ Ê> exJ MO ** ir HợT CD o a a a fôi n( a D œ liHf Oi r* ■ « ■ ! ! â ô w in PQ *>1 r- J OH WDn > ° üü ü? JHI r~ đrằooooior-i>'ô DirnM3ôT