Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học cây trâu cổ ficus pumỉla

Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện hóa sinh biển và các anhchị phòng Dược liệu biển, Viện hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo

HÀ NỘI, tháng 5 năm 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

• • • • KHOA HÓA HỌC

PHẠM HỒNG CÚC

NGHIÊN CỨU Sơ Bộ THÀNH PHẦN

• • •

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 • • •

•

KHOA HÓA HỌC

PHẠM HỒNG CÚC

NGHIÊN CỨU Sơ Bộ THÀNH PHẦN

Ngưòi hướng dẫn khoa học

PGS.TS NGUYỄN VĂN BẰNG

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm

ơn đến thầy giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ

em trong quá trình thực hiện và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Xuân Cường và TS Trần Thị Hồng Hạnh, Yiện Hóa sinh biển, Yiện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Yiệt

Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình hoàn thiện khóaluận

Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện hóa sinh biển và các anhchị phòng Dược liệu biển, Viện hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em được sửdụng các thiết bị tiên tiến của viện để học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt đềtài khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Hóa học, Trường đạihọc Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình học tập vàhoàn thiện khóa luận tốt nghiệp

Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã quan tâm,giúp đỡ, động viên em trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận tốtnghiệp

Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận có thể còn nhữngthiếu sót Vì vậy, em rất mong nhận được những đóng góp của thày cô, bạn bè

để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Phạm Hồng Cúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận:

“Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học cây Trâu cổ - Ficus pumỉla”

Dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Bằng là hoàn toàn trung

thực và không trùng với kết quả của tác giả khác Nếu có vấn đề khôngđúng tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Sinh viên

Phạm Hồng Cúc

[a]D ĐỘ quay cực Specific Optical Rotation

13C - NMR Phô cộng hưởng tò hạt nhân cacbon 13

Carbon 13 Nuclear Magnetic ResonanceSpectroscopy

- NMR Phô cộng hưởng tò hạt nhân proton

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

JH - JH COSY !H - !H Chemical Shift Correlation Spectroscopy2D - NMR Phô cộng hưởng từ hạt nhân hai chiêu Two -

Dimensional NMR

Column ChromatographyDEPT Distortionless Enhancement by Polarisation TransferEl-MS Phô khôi lượng va chạm electron Electron Impact

Mass SpectrometryFAB - MS Phô khôi lượng băn phá nguyên tử nhanh Fast Atom

Bombardment Mass SpectrometryHMBC Hetoronuclear Multiple Bond Connectivity

HMQC Hetoronuclear Multiple Quantum Coherence

HR - FAB - MS Phô khôi lượng băn phá nguyên tử nhanh phân giải

caoHigh Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry

IR Phô hông ngoại Infrared Spectroscopy

MS Phô khôi lượng Mass Spectroscopy

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

Thin Layer Chromatography

Hình 1.1: Hình ảnh mẫu cây Trâu cổ (F ICUS PUMILA)

Hình 3.1 : Sơ đồ chiết phân lớp mẫu cây Trâu cổ

Hình 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn diclometan cây TrâuHình 3.3.a: cấu trúc hóa học của hợp chất 1

MỤC LỤC « «

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Những nghiên cứu tổng quan về cây Trâu cổ 3

1.1.1.Giới thiệu về cây Trâu cổ 3

1.1.2.Phân bố, sinh thái 4

1.1.3 Hoạt tính sinh học 4

1.1.4 Công ldụng 5

1.1.5 Thành phần hóa học 5

1.2 Giới thiệu về lớp chất ílavonoid [6, 7] 8

1.2.1.Giới thiệu chung 8

1.2.2.Các nhóm Aavonoid 9

1.3 Tổng quan về phương pháp chiết mẫu thực vật [8, 9] 13

1.3.1.Chọn dung môi chiết 13

1.3.2.Quá trình chiết 15

1.4 Phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 16

1.4.1.Đặc điểm chung 17

1.4.2.Cơ sở của phương pháp sắc kí 17

1.4.3.Phân loại phương pháp sắc kí 17

1.5 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [10] .' ! 1 21

1.5.1.Phổ hồng ngoại (IR) 22

1.5.2.Phổ khối lượng (MS) 22

1.5.3.Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 26

2.1 Mẩu thực vật 26

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 26

2.2.1.Sắc kí lớp mỏng (TLC) 26

2.2.2.Sắc kí cột (CC) 26

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 26

2.4 Dụng cụ và thiết bị 27

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 27 2.4.2 Dụ ng cụ và thiết bị xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 27

2.5 Hoá chất 27

Chương 3: THựC NGHIỆM YÀ KẾT QUẢ 28

3.1 Chiết xuất và phân lập chất 28

3.2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 29

3.2.1 Hợp chất 1 - Narigenin 29 3.2.2 Hợp chất 2 - Apigenin 35 3.2.3 Hợp chất 3: Genistein 36 KẾT LUẬN 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

MỞ ĐẦU

“Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, độ ẩmcao trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15 - 27°c Đó làđiều kiện rất thích hợp cho thực vật phát triển Do vậy hệ thực vật Yiệt Nam

vô cùng phong phú, đa dang với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược” [1] Điều này có ý nghĩa quantrong trong sự phát triển của ngành y tế và một số ngành khác Hệ thực vậtphong phú trên được coi là tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợpchất thiên nhiên ở nước ta

Từ xưa ông cha ta đã sử dụng nhiều loại cây cỏ tạo ra những phươngthuốc dân gian để chữa bệnh, bồi bổ cơ thể hay tạo mùi thơm như câycam thảo để thanh nhiệt, hạ huyết áp, lá tía tô để giải cảm, nhân sâm để tăngcường sức đề kháng, sả để tạo mùi thơm Và từ nhiều thế kỷ nay những hợpchất được phân lập tò cây cỏ đã được ứng dụng rộng rãi trong các ngànhkhác nhau như nông nghiệp, công nghiệp, chúng được dùng để sản xuấtthuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho công nghiệpthực phẩm và mỹ phẩm

Ngày nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng đượccon người quan tâm và ứng dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ vàkhông làm ảnh hưởng xấu đến môi trường xung quanh Theo các tài liệucông bố hiện nay, có khoảng 60% - 70% các loại thuốc chữa bệnh đangđược lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốcthiên nhiên

Với những công trình nghiên cứu và bằng các phương pháp thử hoạttính sinh học hiện đại, có kết quả cao, con người đã tiến hành nghiên cứucác mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các chất đã tách ra từ các dịchchiết Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý

báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lọi cho việc phát triển ngành y dược trongcông cuộc chữa bệnh cứu người Chính vì vậy việc nghiên cứu các thànhphàn hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thựctiễn cao.Từ đó mà các loài thực vật đang được các nhà khoa học đặc biệtquan tâm

Cây Trâu cổ (F ICUS PUMILA) được biết là một loại cây được sử dụngtrong y học dân gian để chữa các bệnh như liệt dương, đau lưng, đau đầu,chóng mặt, đau khớp, đau thần kinh tọa, nhức mỏi chân tay, kinh nguyệtkhông đều Yiệc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học của cây Trâu cổnhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, hiệu quả có ýnghĩa quan trọng trong việc phát triển nền y học Yiệt Nam hiện đại dựa trêncác phương pháp cổ truyền

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên tôi lựa chọn đề tài cho khóa

luận tốt nghiệp là: “ Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của cây

hiểu biết về thành phần hóa học của cây Từ đó tạo điều kiện thuận lợi chonhững nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mớicũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyềnViệt Nam Đây là yếu tố quan trọng có ý nghĩa thực tiễn đối với nền y họcViệt Nam

Nhiệm vụ của đề tài:

1 Thu mẫu lá cây Trâu cổ, xử lí mẫu và tạo dịch chiết

2 Nghiên cứu phân lập các hợp chất hóa học từ cây Trâu cổ

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Những nghiên cứu tổng quan về cây Trâu cổ

1.1.1 Giới thiệu về cây Trâu cổ

Tên khoa học: Ficus pumiỉa

L.

Tên tiếng việt: Cây Trâu cổ (Sung thằn lằn, sộp, vảy

ốc, ) Bộ: Hoa hồng (Rosales)

Họ: Dâu tằm (Moraceae)

Chi: Sung (F ICUS )

Hình 1.1: Hình ảnh mẫu cây Trâu cổ (Ficus pumiỉa)

Dây leo nhỏ, mọc bám nhờ rễ phụ Cành ngắn và mềm màu nâu, lúc non

có lông sau nhẵn

“Lá mọc so le, lá ở cành sinh sản hình bàu dục hoặc hình trứng, dài 5 - 7

cm, rộng 2,5 - 4,5 cm, gốc tròn hoặc hơi hình tim, đàu tù hoặc hoi nhọn, hai mặtnhăn, méo nguyên, gân gốc 3-5, nổi rõ ở mặt dưới, gân phụ tạo thành mạngthưa; cuống lá dài 1,8 - 1,5 cm; có lông hung; lá có kèm lông; lá ở cành khôngsinh sản hình vảy ốc; gốc lệch mọc áp sát vào thân cây chủ, dài khoảng 2 -2,5 cm, cuống ngắn 2-3 mm” [1]

“Cụm hoa mọc ở kẽ lá; hoa đực rất nhiều, mọc tụ tập ở gần đỉnh, dài2

- 3 răng, nhị 2, bao phấn hẹp; hoa cái có 4 lá dài không bằng nhau; bầuthuôn dài, cong” [1]

Quả phức to, hình chóp ngược, đầu bằng, dài 3,5 cm, dày 3 cm, nhẵn,màu tím nâu khi chín, cùi nạc và mềm xốp

Mùa hoa quả: Tháng 5-10 [1]

1.1.2 Phân bố, sình thái

“Trâu cổ có nguồn gốc tò Nhật Bản, Trung Quốc, phân bố tự nhiên

từ Trung Quốc đến Việt Nam, Lào; cây còn được phân bố rộng khắp vùngnhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á, để làm cảnh và làm thuốc.ở Việt Namcây phân bố gần như khắp nơi, trừ vùng núi cao trên 1500m” [1],

Trâu cổ thường phụ sinh trên thân những cây gỗ ở vùng rừng thứsinh, dọc theo các bờ sông suối, hay trên những cây cổ thụ ở vùng đồngbằng, trung du, cũng như những cây lấy bóng mát ở các thành phố Cây cònmọc bám trên các tảng đá hay tường gạch xây lâu ngày

“Trâu cổ là cây ưa sáng, sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm vềmùa đông, cây gần như ngừng sinh trưởng nhưng lá vẫn xanh Cây ra hoaquả nhiều vào mùa hè - thu Khi quả chín rụng xuống đất, phần thịt thối rữa,hạt phát tán ra xung quanh Tuy nhiên, tất cả các cây Trâu cổ phụ sinh trênthân cây gỗ là do chim ăn quả chín, hạt theo phân chim dính trên vỏ cây giáthể Trâu cổ có khả năng tái sinh dinh dưỡng khỏe” [1]

1.1.3 Hoạt tính sinh học

« «

“Năm 1999, nghiên cứu được hợp chất tritecpen mới là neohopane

thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên các chủng E SCHERÌCHIA

“Năm 2008, hợp chất rutin thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnhnhất khi đánh giá khả năng thu dọn gốc tự do DPPH và superoxit” [4].

[ 3 ].

“Hợp chất dehydrovomifoliol và retro-a-ionol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư yếu trên các dòng tếbào Hela, MCF-7 và A549” [5]

(£)-3-oxo-retro-a-ionol(£)-3-oxo-1.1.4 Công dụng

Quả Trâu cổ là một vị thuốc bổ được nhân dân sử dụng tò lâu đời đểchữa liệt dương, đau lưng, tắc tia sữa

Thân, cành, lá chữa phong thấp, đau nhức chân tay

Rễ chữa đau đầu, chóng mặt, đau khớp, đau dây thần kinh tọa

Nhựa mủ bôi ngoài chữa mụn nhọt, đầu đinh, ghẻ lở, dị ứng sơn [1],

1.1.5 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cây Trâu cổ cho thấy thànhphần hóa học của loài này bao gồm các hợp chất: tritecpen, sesquitecpen,flavonoit, norisoprenoit, benzofuran

Năm 1999, nhóm nghiên cứu của các tác giả người Philippin và úc

công bố 01 hợp chất tritecpen mới là neohopane (1) từ cây F PUMỈLA Hợp

chất này thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên các chủng

E SCHERICHIA COLỈ , P SEUDOMONAS AERUGINOSA , B ACILLUS SUBTIỈIS và

C ANDIDA ALBICANS [2],

Năm 2000, ba hợp chất sesquitecpen mói là pumilaside A-C (2-4)

cùng với benzyl glucopyranoside, (£)-2-methyl-2-butenyl glucopyranoside và rutin (5) tiếp tục được Kitajima công bố tò loài cây này

p-D-1 5

5 thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất khi đánh giá khả năng thu dọngốc tự do DPPH và superoxit [4],

Mới đây, một dẫn xuất benzofuran glucosit mói là pumiloside (9),cùng vói các hợp chất flavonoit glycosit đã biết kaempferol 3-ớ-rutinoside(8), rutin (5), afzelin, asữagalin, quercitrin, isoquercitrin và kaempferol 3-0-

sophoroside cũng được phân lập và xác định cấu trúc từ loài này

Một hợp chất norisoprenoit mái là 3,9-dihydroxy dihydroactinidiolide (10) cùng với 11 hợp chất megastigman đã biết là 3a-hydroxy-5,6-epoxy-7~ megastìmen-9-one (11), dehydrovomifoliol (12), 3,9-dihydroxy-5,7~megastigmadien-4-one (13), 9,10-dihydrox~y-457~megastigmadien~3~one (14),8,9-dihydro-8,9-dihydroxymegastigmatxienone (15), (6i?,9S)-3-oxo-a-ionol (16),blumenol A (17), (E)~3-oxo-retro-a-ionol (18), (62?,92?)~3-oxo~a~ionol-ß- D-

r 2

5: R]~H, R 2 =OH, R 3 = 0-a-L-rhamnopyranosyl-(l— >6)-ß-D-glucopyranoside 6 : R^O-a-L-rhamnopyranosyl-fl— glucopyranoside, R 2 = R 3 = H 7: R 1 =R 2 =H, R 3 = 0-a-L-rhamnopyranosyl-(l—>6)-ß-D-galactopyranoside 8: R 1 =R 2 =H, R 3 = 0-a-L-rhamnopyranosyl-(l— >6)-ß-D-glucopyranoside

>6)-ß-D-glucopyranoside (19), roseoside (20), (Zs)-4~[3’-0ff-D~glucopyranosyloxy)~butylídene]~3,5,5-trímethyl-2-cyclohexen-l-one (21) tiếp tục được công bố từ loàinày Trong đó 12 và 18 thể hiện hoạt tính gây độc tể bào ung thư yếu trên các dòng

tế bào Hela, MCF-7 và A549 [5]

vòng benzen

A, B đượckết nối bởi 1

dị vòng c vớikhung cácbon C6-C3-

C6

Các

flavonoid làdẫn xuất của 2 -phenyl chroman(flavan)

2’ 3’

Flavan (2- phenyl chroman )

Cácílavonoid có ởtrong tất cả các

bộ phận củacây, bao gồmquả, phấn, hoa,rễ Một sốílavonoid cóhoạt tính sinhhọc thể hiện ởkhả năng chốngoxi hóa

tạo của hợpchất như sau:

Flavon

và ílavonol rấtphổ biến trong

tự nhiên, vị trí

và số lượng cácnhóm hydroxiliên kết với cácnguyên tửcacbon củakhung tạo nêncác chất khácnhau

Trongthực vật, cácílavon vàílavonol

thường khôngtồn tại dướidạng tự do màthường dưới

Plavon

phenyl cromon hay phenyl benzopyron hydroxi ílavon

2-+ Fỉavanon

(dihydroýlavon )

Các

ílavanon cócông thức cấutạo chung nhưsau:

Plavanon

Các

ílavanon nằmtrong cân bằng

hỗ biến với cácchalcol dovòng

dihydropyron

của ílavanonkém bền nên dễxảy ra mở vòngchuyển thànhchalcol

có vài chất ở dạng

glycozit.Flavanonol

nguyên tửcacbon bấtđối là C-2 vàC-3 nênchúng có tínhquang hoạt.Các hợp chấtflavanonol-3thường gặp làaromadendrin, fustin vàtaxifolin

+ Chacol

Chacol khácvới các loạiflavonoidkhác là nhómchacol cóphân tử gồmhai vòngbenzen A và

B được nốivới nhau bởimột mạch hở

có 3 nguyên

tử cacbon, sốthứ tự cácnguyên tốđược bắt đàuđánh từ vòngB

Hiệnnay người tabiết đếnkhoảng 20hợp chấtChalcol,ngoài ra cònthấy hợp chấtdihydrochalc

ol Tuy vậy,giữa chalcolvà

dihydrochalc

ol hàu nhưkhông có mốiquan hệkhăng khítnào Chalcol

có thể bịđồng phân

flavanon khiđun nóng vớiaxit clohydric(HC1).

+ Auron

Auron làhợp chất cóvòng c là một

dị vòng 5 cạnh.Công thức cấutạo chung củanhóm auronnhư sau:

Auron

có màu vàngđậm và khôngtạo màu khithực hiện phảnứng Shinoda(phản ứng địnhtính ílavonoit).Trong tự nhiên,các chalcol-glycozit dễ bịoxy hóa thànhauron-glycozitnên hai nhómchất này tồn tạicạnh nhau Các

Ö

Auron

Màu sắccủa

antoxianidinthay đổi theo

pH Trongdung dịch axit

antoxianidincho muối oxoni

có màu đỏ, còntrong môitrường kiềmchúng tạothành cácanhydrobazovới một nhómquinoid màuxanh:

Dạng oxoni (đỏ) Dạng phân tử trung tính (tím) Dạng anion (xanh)

(+) epicatechin (-) catechin

catechin và (-)- epicatechin xuất hiện trong thiên nhiên

+ Isoflavonoid

Isoflavonoid bao gồm các dẫn xuất của 3- phenyl chroman, được chiathành các nhóm nhỏ như sau: