Nghiên cứu thành phần hóa học của một vài cây có tác dụng chữa bệnh răng miệng

Phương pháp nghiên cứu 1.Định tính thành phần hoá học của Lá lốt và Trầu không: Alcaloid, Flavonoid, Anthraglycosid, Cumarin, Tanin, đường khử bằng các thuốc Ihử đặc hiệu và sắc ký lớp m

THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA MỘT VÀI CÂY

CÓ TÁC DỤNG CHỮA BỆNH RĂNG MIỆNG

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Đ ư ợ c SỸ ĐẠI HỌC KHOẢ 1995- 2000)

Người thực hiện : Nguyễn Trường (ỉiang.Ngưòi hướng dẫn : Tiến sỹ Giang Thị Sơn

Tiến sỹ Ngô Mai Anh.

Noi thực hiện : IỈỘ môn Hoá HỮƯ cơ.

Thời gian thực hiện : 1/3- 23/5/2000

LỜI CÁM ƠN.

Em xin chân thành gỏi lời cảm ơn đến Tiến sỹ Giatìg Thi Sơn và Tiến sỹ Ngô Mai Anh, những người đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện kììoá luận này, xin cảm ơn các cô đã luôn tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua, luôn động viên em những lúc khó khăn khúc mắc.

Em xin cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên trong bộ môn Hoá Hữu cơ và Tiến sỹ Cao Văn Thu vì sự giúp đỡ đ ể em có thể hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp này.

Nhân đây em cũng xin gởi lời cảm ơn đến tất cả cấc thầy cô giáo, các cán

bộ nhân viên của Trường Đợi học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em í rong suốt quá trình học tập tại trường.

Hà Nội, tháng 5 năm 2000 Sinh viên Nguyễn Trường Giang.

PHẦN I- ĐẶT VÂN ĐỂ

Đất nước Việt Nam có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú và có nền Y học dân tộc phát triển lâu đời Từ hàng ngàn năm về truớc con người Việt Nam đã biết sử dụng cây cỏ, động vật xung quanh để làm thuốc và đã có những nghiên cứu về Y dược lý rất đáng khâm phục Theo kinh nghiệm dân gian và một số nghiên cứu trong những năm gần đây thì Lá lỐt(Piper lolot C.DC) và Trầu không(Piper betle L.) là những cây thuốc có tác dụng chữa bệnh răng miệng rất tốt Những cây thuốc này lại rất dễ kiếm và đã được sử dụng rộng rãi trong nhân dân với các mục đích khác nhau Chính bởi các lí do

đó chúng tôi mong muốn được tìm hiểu về thành phần hoá học và tác dụng kháng khuẩn của 2 cây thuốc này để một phần nào lý giải được tác dụng của chúng trong điều trị bệnh lăng miệng, và đây chính là mục đích của khoá

luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học “Nghỉcn cứu thành phần hoá học của một vài cây có tác dụng chữa bệnh răng miệng “ của chúng tôi.

Trong thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này chúng tôi mong muốn hoàn thành được các mục tiêu như sau:

1 Định tính thành phẩn hoá học của 2 cây Lá lốt và Trầu không

2 Tìm cách tách được một thành phần hoá học có khả năng là thành phần tạo nên tác đụng chữa bệnh răng miệng của chúng

3 Thăm dò khả năng kháng khuẩn của 2 dược liệu này

PHẦN II- TỔNG QUAN

<

Tên khác : Tất bát, ana klùa táo

Tên khoa học : Piper lolot C.DC

Họ : Hổ tiêu (Piperaceae)

2.1.1 M ô tả[7, 16]

Lá lốt thuộc loài cây thảo, thường cao 50-60cm, có khi cao tới một mét, thân hơi có lông, có một ống tiết trong tuỷ Thân cây chia thành lừng đốt, mỗi đốt mang một lá, cuống lá có bẹ ngắn Lá hình trứng rộng, phía cuống hình tim, đầu lá nhọn, khi soi lên có những điểm trong Phiến lá rộng 8,5-9cm, dài 13cm Mặt trên lá nhẵn bóng có màu xanh (hẫm, mặt dưới lá nhạt hon và có lông mịn Ra hoa vào cuối mùa xuân, đẩu hè và mùa thu, hoa mọc thành bông, hoa cái đài lcm Quả kép nhỏ dài chừng 1-1,5cm gồm nhiều lá noãn mang hạt

2.Ỉ.4 Tác dụng dược lý và công dụng

Theo Tuệ Tĩnh và Đỗ Tát Lợi, Lá lốt sắc uống có vị cay, tính ấm chữa đau

Năm 1970 Til ạch Thị Thân trong báo cáo tốt nghiệp Dược sỹ đại học đã chứng minh Lá lốt có tác đụng kháng khuẩn với các chủng Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus subtilis và một số chủng vi khuẩn khác [18] Trong báo cáo này tác giả cũng chứng minh khả năng chống viêm của nước sắc lá lốt trên động vật Từ đó Lá lốt đã được sử đụng để điều trị bệnh lăng miệng với hai dạng bào chế là ống Pipelo ngậm và viên nén Pipelo[15].

Trong Tạp chí Y học thực hành số 7 năm 1962, tác giả Triều Đắc đã nêu phương pháp dùng nước sắc Lá lốt và đầu hạt dọc trộn cám để điều trị các vết thương nhiễm tiling, vết thương sẽ lành nhanh chóng[9]

Từ các tính chất đó của Lá lốt, bệnh viện Quân Y 115, 354 và 108 đã nghiên cứu đưa Lá lốt vào sử dụng trong điều trị các bệnh về răng miệng như viêm lợi, viêm quanh răng, sâu răng và đã đạt được một vài kết quả tương đối khả quan [20, 22], Theo thống kê của bác sĩ Lê Tưởng, Hội Răng Hàm Mặt thì trong 3 năm từ 1977 đến 1979 các bệnh viện trên đã điều trị 150 ca với các bệnh hôi miệng, cháy máu chân răng, viêm lợi bằng Lá lốt có tỷ lệ khỏi bệnh đạt 72- 85%[22]

2.2 Cây Trầu không

Tên khác: Trầu, thược tương,hrììe ehang, phù lưu, trầu lương

Tên khoa học : Piper betle L

Họ : Hồ tiêu ( Piperaceae )

2.2.1 M ô tả [7, 16]

Cây Trầu không là cỏ đa niên, mọc leo nhờ rễ mấu ,thân cây nhẵn Lá mọc

so le hình trái xoan, phía dưới hình tim, dài 10-13 cm rộng 4,5- 9 cm, đẩu lá nhọn khi soi lên có lất nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ Gân lá thường 5, lá

có bẹ cứng ở cuống dài 1,5- 3,5 cm Hoa đơn tính, mọc thành bông, lá hoa

không dính vào trục.Hoa đực có 2 nhị Hoa cái to đến 1 cm, đài 5 cm hay hơn,

có một bầu, một ô với hai đầu nhụy Quả mọng không có vòi sót lại

2.2.2 Phân b ố địa ỉý[7, 16]

* Trầu không được trổng khắp nơi trong nước ía với các địa hình và vùng đui

khác nhau Ngoài ra câv còn có ở một số nước khác trong vùng như Malaixia,

Indonexia

2.2.3 Thành phần hoá học

Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy Trầu không có chứa tinh dầu trong

đó có hai thành phần là betel-phenol và chavicol[16], ngoài ra còn có một số thành phần khác nhưTanin, Cumarin, Flavonoid[14]

2.2.4 Tác dụng dược lý và công dụng

Theo Dược liệu Việt Nam đo Bộ Y tế xây dựng năm 1978 thì Trầu không

vị cay, tính ấm, mùi thơm, có tác dụng trừ phong thấp, tiêu đờm, tiêu viêm, sát trùng Dùng lá và thân Trầu để chữa cảm mạo, phong thấp, nhức mỏi, đau bụng lạnh đầy hơi, rửa vết thương, chữa bỏng, chữa sưng đau[4]

Tuệ Tĩnh trong sách Nam được thần hiệu cũng đã đề câp đến Trẩu không như một vị thuốc có tác dụng chữa bỏng rất tốt [20]

Theo Đỗ Tất Lợi, Trầu không có tác dụng kháng khuẩn với các chủng E.coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtỉiis Dòng trẩu để rửa vết loét, trị mẩn ngứa, viêm mạch bạch huyết, viêm kết mạc, chàm mặt [16]

Trong báo cáo tốt nghiệp dược sỹ đại học năm 1970, Nguyễn Đình Lân đã nghiên cứu và kết luận Trầu không có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh[14]

v ề lác dụng chữa bệnh răng miệng của cãy thuốc này viện Quân Y 103 đã dùng Trầu không trong thành phần thuốc bôi cùng với bồ giác, xoan trà, cỏ lào điều trị viêm quanh răng, đạt kết quả tốt với tỷ lệ khỏi bệnh là 84%[13]

2.1.3 M ột sô'bài thuốc có Lá lốt và Trầu không

*Chữa đau nhức xương khớp, đau lưng, đau răng

Lá lốt, rễ bưởi bung, rễ cây vòi voi, lễ cỏ xước, tất cả thái mỏng sao vàng,mỗi vị 15 gam khô, sắc với 600 ml nước, cô còri 200 ml chia 3 lần uống trongngày[16]

*Chữa đau lưng, sưng đầu gối, bàn chân tê buốt, đau răng

Dùng 8-12 gam đây rễ Lá lốt, phối hợp với dây đau xương, rễ cỏ xước, cỏ cốt khí mỗi vị 8 gain sắc uống[7]

*ThuỐc Dentoxit chữa bệnh sâu răng, viêm lợi [20]

Cao cồn Lá lốt 10%

Menthol tinh thể

Tinh dầu hương nhu

Cỉorophil

*Hai dạng bào chế có tên Pipelo[15]

(2)Vién nén Pipelo: Cao mềm Lá lốt 0,25 gam

Tá dược vừa đủ 1 viên

Dùng điều trị sâu răng và viêm cận răng, viêm lợi có biến chứng

*Thuốc Đông Y chữa bệnh viêm quanh răng[13]

PHẦN III- THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Nguyên vật liệu và phưong pháp thực nghiệm

3.Â.I Nguyên vật liệu

Trầu không (Piper betle L.), và Lá lốt (Piper lolot C.DC) dùng nguyên liệu

là lá và cành mang lá, được thu hái từ vùng ngoại thành Hà Nội

Nguyên liệu tươi : là nguyên liệu sau khi thu hái được rưả sạch và để ráo nước

Nguyên liệu khô : là nguyên liệu tươi được thái nhỏ sau đó phơi hoặc sây

trong tủ sấy ở nhiệt độ 50 độ c đến khô.

3.1.2 Phương pháp nghiên cứu

1.Định tính thành phần hoá học của Lá lốt và Trầu không: Alcaloid, Flavonoid, Anthraglycosid, Cumarin, Tanin, đường khử bằng các thuốc Ihử đặc hiệu và sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp

2.Định lượng Tanin theo phương pháp oxy hoá với đung dịch chuẩn là kalipermanganat, chỉ thị sulfo inđigo

3.Tách Tanin trong dược liệu bằng phương pháp chiết nhiều lần với dung môi nước sau đó kết tủa và tinh chế

4.Thử tác đụng kháng khuẩn bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, dùng khoanh giấy lọc tẩm dung dịch thử

Cho 5,0 gam Lá lốt khô vào bình nón 100 ml, làm ẩm bằng 5 ml dung dịch amoniac đậm đặc, thêm 50 ml hỗn hợp Diethyl ether và Cloroform (1:1) lắc, lọc.Cho thêm 10 ml dung địch acid sulfuric 10% vào dịch lọc trong bình gạn Lắc, gạn lấy dịch acid (đung dịch A) làm phản ứng :

- Lấy 1 ml đung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt thuốc thử Bouchardat, trong ống nghiệm xuất hiện tuả đỏ nâu

-Lấy 1 ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt dung dịch acid picric trong Ethanol, trong ống nghiệm xuất hiện tủa trắng

- Lây 1 ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt thuốc thử Dragendoff, trong ống nghiệm xuất hiện tủa màu vàng cam

Các phản ứng trên đều dương tính cho thấy trong Lá lốt có thể có Alcaloicỉ.(••)Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Chứng tôi cũng tiến hành định tính Alcaloid trong Lá lốt bằng sắc ký lóp mỏng theo quy trình:

Cân 20,0 gam Lá lốt khô cho vào bình nón có nút mài 500 ml, thêm 50 ml Ethanol 90° đã kiềm hoá bằng amoniac (đến pH = 9), đậy nút để yên 18 giờ Gạn, lọc lấy địch chiết, lắc địch chiết với Cloroform Tách lớp Cloroform, sau

đó lắc lại với dung dịch acid sulfuric 20% Kiềm hoá lớp aciđ bằng dung dịch amoniac đặc, lắc lớp này với Cloroform, dịch Cloroform đùng để chạy sắc ký Với các hệ dung m ô i: (A)- cloroform: methanol (9 : 1)

(B )- cloroform: methanol (2 : 1)

Thuốc thử hiện màu : Dung dịch Dragendoff.

Kết quả: -Với hệ (A ) bản sắc ký cho 4 vết màu vàng khi phun thuốcthử

-Với hệ (B ) bản sắc ký cho 5 vết màu vàng khi phun thuốc thử Như vậy, chúng tôi kết luận hệ (B) cho kết quả sắc ký tốt hơn và trong Lá lốt

có ít nhất 5 loại Aỉcaỉoid khác nhau Dưới đây sắc ký đồ Alcaloiđ của Lá lốtvới các hệ dung môi (A ) và (B )

Hình I-(3.2.1) Sắc ký đổ Alcơloid Lá lốt.

- Tác dụng với đung dịch kiềm: Trong ống nghiệm sạch cho 1 ml dung địch B, thêm 0,5 ml dung dịch natrihydroxyd 0,1 N, dung dịch trong ống chuyển sang màu vàng rơm đậm đần

-Phản ứng Cyanidin: Lấy 1 ml dung dịch B cho vào ống nghiệm, thêm0,5ml acid hydroclorid đặc và một ít bột Magie kim loại, dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ đo Flavonoid đã phản ứng với hydro mới sinh cho dẫn chất Cyanin có màu đỏ

-Tác dụng với dung dịch sắt(III)clorid: lấy 1 ml dung dịch B cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch sắt(III)clorid, ống nghiệm xuất hiện màu xanh đen của phức chất tạo bởi sắt(III) và các hợp chất có nhóm OH phenol

Bằng kết quả dương tính của các phản ứng trên chúng tôi nhận thây trong Lá lốt có thể có Flavonoid

Kết quả chạy sắc ký: -Với hệ (C) bản sắc ký cho vết màu vàng kéo dài.

-Với hệ (D) bản sắc ký cho 3 vết màu vàng khi hiện màu -Với hệ (E) bản sắc ký cho 5 vết màu vàng

Bằng kết quả trên chúng tôi kết luận hệ dung môi (E) cho kết quả tách tốt nhất

và trong Lá lốt có ít nhất 5 loại Flavonoid khác nhau Sau đây là hình mô tả kết quả sắc ký lớp mỏng Flavonoid trong Lá lốt:

Để định tính Anthraglycosid chúng tôi tiến hành chiết xuất như sau: Cho 10,0 gam Lá lốt khô vào bình nón 250 ml thêm 20 ml acid sulfuric 20%, lắp ống sinh hàn hồi lưu và đun cách thuỷ trong 20 phứt Để nguội, thêm 50 ml Dietylether vào bình, lắc kỹ, ỉọc, tách lấy lớp ether trong bình gạn.

Dịch ether được sử dụng làm các phản ứng định tính :

(*)Định tính bằng phương pháp hoá học với phản ứng Bortraeger: trong ống nghiệm lấy 1 ml dịch ether trên thêm 1 mi dung dịch natrihydroxid 10%, lớp kiềm có màu đỏ

(••)Phương pháp sắc ký lớp mỏng: dùng dịch ether trên để tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi benzen: methanol (2:1), hiện màu bằng kali hydroxid trong Ethanol Kết quả bản sắc ký cho 2 vết có màu vàng và đỏ với thuốc thử và có Rf lần lượt là 0,50 và 0,65

Với 2 kết quả trên có thể kết luận: Trong Lá lốt có dẫn chất Anthraglycosid

*Địiih tính âiíờng khử [6]

Chúng tôi tiến hành xác định đường khử trong Lá lốt bằng phản ứng khử thuốc thử Fehling và thuốc thử Tolens: Lấy 20 gam dược liệu tươi cho vào bình nón dung tích 100 mỉ, thêm 30 ml nước cất, đun sôi, lọc dịch chiết qua bông và đem tiến hành phản ứng

-Cho vào ống nghiệm I ml dịch chiết, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling, đun cách thu ỷ 10 phút, ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch

-Cho vào ống nghiệm I ml dịch chiết trên, thêm 0,5 ml thuốc thử bạc nitrat trong amoniac, đun cách tliuỷ trong 10 phút, xuất hiện tủa bạc kim loại trên thành ống nghiệm

Các phản ứng trên đã cho thấy trong Lá lốt có đường khử

*Định tính Cumarin hằìiqphươHg pháp hoá học ¡5, 101

Để định tính Cumarin trong Lá lốt chúng tôi tiến hành chiết và thử phán ứng theo quy trình sau: Cân 20,0 gam lá lốt tươi cho vào bình nón 100 ml,

thêm vào đó 50 nil Ethanol 90°, đun cách thuỷ sôi 30 phút Để nguội, lọc lấy dịch chiết.

-Phản ứng đóng 1Ĩ1Ở vòng lacton: lấy 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết trên, ống thứ nhất thêm 1 ml natri hydroxyd 10% Đun cách thuỷ cả

2 ống trong 10 phút sau đó cho vào mỗi ống 3 ml nước cất: ống thứ nhất trong, Ống thứ hai đục Acid hoá ống thứ nhất bằng 1 ml acid hyđroclorid đậm đặc thì ống này đục như ống thứ hai như vậy trong Lá lốt có thể có Cumarin vì tính tan của hợp chất này thay đổi theo pH môi trường đã tạo hiện tượng trên.-Phản ứng huỳnh quang: trên một tờ giấy lọc, nhỏ một giọt dịch chiết, hơ khô rồi nhỏ chồng lên một giọt natri hydroxid 10%, sấy nhẹ ơ ie một nửa vết dịch chiết rồi đặt dưới ánh sáng tử ngoại, nửa vết không bị che có huỳnh quang xanh.Khi không che nữa thì nửa vết còn lại cũng có huỳnh quang đậm dần lên bằng nửa kia

Từ hai thí nghiệm trên chúng tôi kết luận trong Lá lốt có hợp chất Cumarin

*Định tính Tanin bằng phản ứtig hoá học [5]

Tanin là những hợp chất đa phenol, dễ tan trong nước và các dung môi pliân cực, ít tan trong các dung môi không phân cực, do vậy chúng tôi đã chiết xuất và định tính như sau:

Trong một bình nón đung tích 250 ml, cho 50,0 gam Lá lốt khô thái nhỏ, thêm vào bình TOO ml nước cất Đun sôi trong 1 giờ, lọc qua bông Dịch lọc được thử các phản ứng:

-Tạo phức với dung dịch sắt(IIĨ): Lấy Iml dịch lọc cho vào ống nghiệm,

thêm một giọt dung dịch sắt(III)clorid ] %, dung dịch trong ống có màu xanh

đen

-Phản ứng kết tủa với Gelatin: Trong ống nghiệm, lấy 1 ml địch lọc, cho

thêm vào ống một giọt dung dịch Gelatin ị %, có tủa trắng xuất hiện.

formch và 5 ml acid hydroclorid đặc Đun nóng bình trong 10 phút, không có tủa xuất hiện.

Qua các kết quả trên, có thể kết luận trong Lá lốt có Tanin thuộc loại Pyrogalic

3.2.2 Định tính thành phần hoá học của trầu không

đó được lắc với Diethyỉether Chiết Alcaloid trong dịch Diethylether bằng dung địch acid sulfuric 20% Dung địch acid này được sử dụng để định tính AlcaIoid(dung địch A)

-Cho 1 ml dung dịch A vào ống nghiệm, thêm 1 giọl thuốc thử Mayer, trong Ống nghiệm xuất hiện tủa trắng

-Lấy 1 ml dung dịch A cho vào ống nghiệm, thêm 1 giọt thuốc thử Dragendoff, xuất hiện tủa vàng cam

-Trong ống nghiệm cho 1 ml dung địch A và 1 giọt thuốc thử Bouchardat,

có tủa nâu xuất hiện

Căn cứ vào các kết quả thu được (rong các thí nhgiệm trên chúng tôi sơ bộ kết luận trong lá Trầu có hợp chất Alcaloid

(••)ĐỊnh tính bằng sắc ký lớp mỏng

Chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng Alcaloid trong lá Trầu bằng cách kiềm hoá dung dịch acid (dung địch A) trên, lắc với ether và sắc ký dịch ether này