Phân lập và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ p10 của virus gây bệnh lúa lùn sọc đen ở việt nam

 M U 1 CHNG 1- TNG QUAN 3 1.1. GII THIU CHUNG V VIRUS H 3 1.2. BDV 5 1.2.1. B 5 ng Nam 11 N GEN P10   15 N SRBSDV 17 1. NG DNG THC TIN 18 1.5.1. Gii thiu chung v   18 1.5.2. Mt s ng dng ch  21 CHNG 2- VT LI 24 2.1. VT LIT 24 2.1.1. Vt lim 24 t 24 2.1.3. Thit b 25 2.2. PHU 25 c hiu bng k thut PCR 25 n gel agarose 26 i DNA bng enzyme DNA ligase 26 2.2.4. Bin np vi khun E. coli 27 t DNA plasmid t t n 27 2.2.6. Tinh sch DNA t gel agarose 28 2.n phm PCR 29 2.2.8. Phn ng ct DNA bng enzyme ct gii hn 29 2.2.9. Gi n DNA 30 a SDS 31 y E. coli n b dch chit t  32 2.2.12. Tinh s hp qua ct Ni 2+ agarose 32  nh lng protein b    hp th     ngoi (A 280 ) 33  t bch 33 2.2.15. Phn dch (Western blotting) 33 2.2.16. Tinh s IgG bng ct s-sepharose 34 2.2.17. Ph 35 2.2.18. Ph 36 N GEN P10 T cDNA CN S10 . 37 3.1.1. n gen P10 bng phn ng PCR 37 n gen P10  39 3.1.3. PCR kim tra s t ca pl hp 40 3.1.4. Ki hn gen P10 41 3.1.5. Gi n gen P10 ca chng SRBSDV 44 3.2. BIU HI HP P10 45 3.2.1. Thit k vector biu hin gen P10 45 3.2.2. Biu hi hp P10 52 3.3. G  58 ng min dt bch 58 N VIRUS SRBSDV B TINH SCH 63  nhy c 63 n SRBSDV bt ELISA 64 KT LUN NGH 66 U THAM KHO 67 PH LC i      i li cc ti PGS.TS. Phi TS. Phan Tu nhi th bng dn,  c t   , anh ch em trong B nh hc P Thc vt, Vin Di truyng d  t nhiu trong thi gian i B     i li c       c Khoa Sinh hc, i hc Khoa hc T nc bi   c vng kin th thi gian hc tp tng. Cu i li cng u kin tt nh  lun    03  H          Bng 1p oligonucleotide s du Bng 2n phn    Bng 3n phn ng ghn phT 4:      nhn bi         5: -PAGE 12 % Bng 6n phn   P10 Bng 7n phn ng ct gii hn pGEMT/P10 Bng 8n phn ng ct gii hn pGEMT/P10 28a Bng 9n phn ng ct gii hn pET28a/P10 Bng 10u kin cm ng biu hi hp Bng 11: Kt qu  492 th  c hiu c bng phn ng ELISA Bng 12: Kt qu  492 ca phn u ry.      Triu chng c nhim b Rng Sogatella furcifera truyn SRBSDV       =13 Fijivirus 4: Tinh th  virus SRBSDV n bn t  b bnh  ti Vi 5in di sn ph    P10  H6  i hn 7: Bin n h  P10  E. coli 8:          9: PCR kim tra khun lc v  P10 10: in di sn phm ct gii h hp pGEMT/P10 11:           BamHI/XhoI 2 vector pET28        P10 13: Bin n h  P10 E. coli DH5 14: in di sn phm PCR t n lc vi cp mi T7-Fw/T7-Rv 15: in di sn phm PCR kim tra plasmid pET28a/P10 16: in di sn phm ct gii h hp pET28a/P10 17: Bin np vector pET28a/P10 n E. coli Rossetta 18n di SDS-PAGE kim tra s t ca protein P10  hp trong u kin chun : Kim tra s t ca protein P10  hu ki v nhi i gian 20: in di sn phm sau tinh sch dch chit t  21: King min dch ct thanh bng thn dch  22: S  huyt thanh chu    n dch qua ct protein A- sepharose 23n di SDS- PAGE ki tinh sch c 24: PWestern blotting s d tinh sch (1:2000) 25: Th  nhy c tinh sch 26: Th  c hiu c tinh sch (1:5000) BNG U       APS Ammonium persulphate bp C CBB Coomassie Brillant Blue cDNA DNA b sung dNTPs Deoxy triphosphates nucleotides dsRNA    E. coli Escherichia coli EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid ELISA K thu hp th min dt vi enzyme (Enzyme- linked immunosorbent assay) EtBr Ethidium Bromide IPTG Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa Kilodalton LB ng Luria Bertani   ORF c m (open reading frame) PCR Phn ng chui polymerase (polymerase chain reaction) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide SRBSDV       strike dwarf virus) TAE Tris base  Acetic - EDTA TBE Tris base  Axit Boric  EDTA TEMED N,N,N'N'-Tetramethyl-Ethylenediamine 1   (Oryza sativa L.) c i nh cc quan trng cung cp nguc cho khong  th gii.  c ta c ch lc n vi p ca khong 80% s h . Trong nhng i mt vi nhic, nh hc bidch bnh x n sn xuo. m v  u, Vi ng di chuyn ca nhiu lon dch; dnh virus  din bin rt phc tp,  t hi ln.  ti Ngh An, b   i dim bn 3.510 ha b mt trng. i ti 28 tnh min Bi tng dim bi 24.000 ha. B, nh l   c Southern rice black strike dwarf virus - t   i c   Fijivirus  2, thuc h Reoviridae. H gen  n RNA sc t 1,8  t   n S10 d n RNA s c nh nht protein v   bo th c chu nh virus trong chi Fijivirus. Vic ch nhim SRBSDV hic thc hin bng -PCR nhn RNA sa virus  mu bi k thu ng thn tin cho vic tiu king rung. Vic nh mt nhiu thn t 2 trong vich bt hi nhiu hecta sng y, vic s n nay. Vi m       P10                ,       c hi                 P10 ca virus         Vit Namnhm phc v         . [...]... necrosis virus (một furovirus, phân bố tại châu Phi) thì 13 virus còn lại đều phát hiện thấy tại các nƣớc trồng lúa châu Á Tuy nhiên, chỉ có 5 bệnh virus gây hại nghiệm trọng và phổ biến trên lúa là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời [7, 11-13, 16] Nghề trồng lúa ở Việt Nam đã và đang phải đối mặt với các đợt dịch bệnh virus diễn... 1.2.1 Bệnh lúa lùn sọc đen 1.2.1.1 Tình hình bệnh trên thế giới Bệnh lúa LSĐ là bệnh do virus lúa lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus- RBSDV) gây ra và đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1952 [27] RBSDV đƣợc ghi nhận gây hại và gây thành dịch ở các nƣớc Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc Đợt dịch bệnh đầu tiên ở Nhật bản đƣợc ghi nhận trên ngô vào những năm 1957 – 1961, rồi trên lúa và. .. virus gây bệnh là virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam (SRBSDV) 1.2.2.2 Đặc điểm sinh học của SRBSDV Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (O sativa) tại một số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc Cây lúa nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần nhỏ Lúc ban đầu, virus gây bệnh chỉ đƣợc coi nhƣ là một biến chủng của RBSDV... lƣợng thu hoạch lúa gạo của bà con nông dân các các tỉnh miền Bắc và miền Trung 1.2.1.3 Đặc điểm triệu chứng bệnh lúa lùn sọc đen Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm SRBSDV rất giống với biểu hiện của bệnh LSĐ do RBSDV gây ra Triệu chứng của lúa nhiễm bệnh bao gồm: cây lúa tƣơng đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc... trên lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: virus lúa cỏ (RGSV), lùn xoắn lá (RRSV), lùn sọc đen (RBSDV), lúa sọc (RSV), tungro (Rice tungro spherical virus- RTSV), tungro (Rice tungro bacilliform virus RTBV), bệnh lúa lùn 4 (Rice dwarf virus- RDV) và vết u lùn lúa (Rice gall dwarf virus- RGDV) với số lƣợng đủ cho hợp tác nghiên cứu và chẩn đoán Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong... cây này là ký chủ của rầy lƣng trắng và cũng là nguồn chứa virus để rầy lƣng trắng truyền sang cây lúa Bệnh cũng có thể lƣu tồn trên lúa chét của cây lúa bị bệnh trƣớc đó Virus gây bệnh tồn tại trong cơ thể rầy lƣng trắng sống qua đông hoặc di chuyển rất xa theo gió và bão để gây bệnh cho lúa và một số loài cây khác ở các vùng khác hoặc vụ tiếp theo 1.2.2 Virus lúa lùn sọc đen phƣơng Nam 1.2.2.1 Tình... grassy stunt virus- RGSV), lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus- RRSV), lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus- RBSDV), lúa sọc (Rice stripe virus- RSV), tungro (Rice tungro spherical virus- RTSV) và lùn sọc đen phƣơng Nam (Southern rice black strike dwarf virus- SRBSDV) Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng lùn và lùn xoắn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lƣng trắng) và biện... truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã đƣợc nghiên cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật Các nghiên cứu về virus hại lúa tại Viện Di truyền và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các nghiên cứu phân tử nhƣ giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng công nghệ gen nhƣ công nghệ RNAi Hiện Viện Di truyền đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn và lùn xoắn lá lúa trên... các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào hết Trong sản xuất nông nghiệp có khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp nhƣ cây ngô, đậu tƣơng… và khoảng 16 loại virus gây hại cho lúa (phụ lục 1) Trong số các virus hại lúa, ngoài Rice hoja blanca virus (một ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một luteovirus, phân bố tại châu Âu) và. .. tạp của dịch virus hiện nay, đặc biệt là SRBSDV Vì vậy các nghiên cứu về virus hại lúa cần phải nâng lên một bƣớc, tập trung vào các nghiên cứu chuyên sâu mang tính chất dài hơi để giải quyết tận gốc căn nguyên nhƣ các nghiên cứu về bản chất phân tử, diễn biến phát dịch và các biện pháp kiểm soát dựa trên kỹ thuật phân tử nhƣ siêu biểu hiện gen, bất hoạt gen và đột biến 1.2 BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS .   c v tip theo. 1.2.2. Virus   1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu virus gây bệnh lúa LSĐ ở Việt Nam bit ln nht gic. hn gen P10 41 3.1.5. Gi n gen P10 ca chng SRBSDV 44 3.2. BIU HI HP P10 45 3.2.1. Thit k vector biu hin gen P10 45 3.2.2 Ph 36 N GEN P10 T cDNA CN S10 . 37 3.1.1. n gen P10 bng phn ng PCR 37 n gen P10  39 3.1.3. PCR kim