Để khẳng định các khuẩn lạc thu đƣợc có thực sự mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen P10 mong muốn hay không , chúng tôi đã chọn ng ẫu nhiên 1 khuẩn lạc trắng dƣơng tính để nuôi và tinh s ạch plasmid theo quy trình của bộ kit GenJETTM Plasmid Miniprep (mục 2.2.5). Sự có mặt của đoạn gen P10 trong plasmid đƣợc chúng tôi xác định bằn g 2 phƣơng pháp: phƣơng pháp PCR và phƣơng pháp xử lý với enzyme cắt giới hạn.
3.1.4.1. Kiểm tra sự có mặt đoạn gen P10 bằng phản ứng PCR
Phản ứng PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp đƣợc chúng tôi thực hiện với 2 cặp mồi: cặp mồi đặc hiệu của vector pGEMT (T7-Fw/SP6-Rv) có khoảng cách 186
42
bp trên vector pGEMT và cặp mồi đặc hiệu của đoa ̣n gen P10 (S10-ORF-Fw/S10- ORF-Rv). Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di trên gel agarose 1%.
Hình 9: PCR kiểm tra khuẩn lạc với thí nghiệm nhân đoa ̣n gen P10
Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1kb
Giếng 1-2: Sản phẩm PCR với cặp mồi T7-Fw/SP6-Rv
Giếng 3-4: Sản phẩm PCR với cặp mồi S10-ORF-Fw/S10-ORF-Rv Giếng 1-3: Đối chứng âm (khuôn là H2O)
Giếng 2-3: Sản phẩm PCR từ khuôn là plasmid tinh sạch
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% trên hình 9 cho thấy, sản phẩm PCR từ plasmid với cặp mồi đặc hiệu S10-ORF-Fw/S10-ORF-Rv cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,7 kb (hình 9, giếng 4). Sản phẩm PCR v ới cặp mồi vector cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,9 kb, kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA theo tính toán lý thuyết, bao gồm 1,7 kb của đoạn gen P10 và 186 bp của vector pGEMT (hình 9, giếng 2). Đối với phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA plasmid làm khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào (hình 9, giếng 1 và 3). Nhƣ vậy, với kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định plasmid tinh sạch đƣợc chính là plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen P10
43
3.1.4.2. Kiểm tra sự có mặt đoạn gen P10 bằng enzyme cắt giới hạn
Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã đƣợc chèn vào vector pGEMT là đoa ̣n gen P10, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xử lý plasmid tái tổ hợp đã đƣợc tinh sạch từ khuẩn lạc dƣơng tính với enzyme cắt giới hạn. Trên cặp mồi đă ̣c hiê ̣u đƣợc dùng để nhân bản đ oạn gen P10 có thi ết kế trình tự nhận biết của hai enzyme cắt giới ha ̣n BamHI và XhoI, ngoài ra trong trình tự của đoa ̣n gen P10 có vị trí nhận biết của enzyme HindIII tại vị trí 1.322 bp, trong khi trên vector pGEMT không có trình tƣ̣ nhâ ̣n biết của các enzyme này . Chính vì vậy, khi thƣ̣c hiê ̣n phản ƣ́ng cắt đồng thời v ới 2 enzyme BamHI/XhoI, vector tái tổ hợp pGEMT/P10 sẽ bị cắt thành hai đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau; khi xử lí vector tái tổ hợp với HindIII, enzyme sẽ cắt vector tại m ột điểm đ ể tạo ra một đoạn DNA mạch thẳng có kích thƣớc khoảng 4,7 kb là tổng kích thƣớc của vector pGEMT và đoạn gen P10.
Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10 Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Phản ứng I Phản ứng II Đê ̣m 10X 0,5 0,5 Plasmid pGEMT/P10 2,0 2,0 Enzyme BamHI 0,5 -- Enzyme XhoI 0,5 --
Enzyme HindIII -- 0,5
H2O cất khƣ̉ ion vô trùng 1,5 2,0
Tổng thể tích 5,0 5,0
Chúng tôi tiến hành phản ứng cắt giới hạn với các thành phần nhƣ trong bảng 7. Hỗn hợp phản ứng sau khi ủ ở 37°C trong 30 phút, đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc trên hình 10 cho thấy sản phẩm của phản ứng cắt đồng thời bằng BamHI/XhoI cho hai băng DNA, băng DNA thứ nhất có kích thƣớc khoảng 3,0 kb là kích thƣớc bộ khung nguyên bản của vector pGEMT và băng
44
DNA thứ hai có kích thƣớc khoảng 1,7 kb là kích thƣớc đoạn gen P10 (hình10, giếng 2). Tƣơng tƣ̣ đối với sản phẩm của phản ƣ́ng cắt bằng enzyme HindIII, chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm là mô ̣t băng DNA duy nhất có kích thƣớc khoảng 4,7 kb. Kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết c ủa vector tái tổ hợp pGEMT/P10 mạch thẳng.
Hình 10: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pGEMT/P10
Giếng Mk: Thang DNA chuẩn 1 kb; Giếng 1: Vector pGEMT/P10 nguyên bản;
Giếng 2: Sản phẩm cắt giới hạn pGEMT/P10 bằng BamHI/XhoI; Giếng 3: Sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII.
Kết quả thu đƣợc ở trên cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn việc nhân dòng thành công trình tự mã hóa của đoa ̣n gen P10.