Để đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch thu đƣợc, chúng tôi tiến hành xét nghiệm các mẫu lúa nhiễm virus SRBSDV và virus RRSV (Rice ragged stunt virus - gây bệnh lùn xoắn lá) bằng kĩ thuật ELISA. Mẫu dịch chiết protein lúa bệnh đƣợc pha loãng ở các nồng độ từ 1:1 đến 1:50, sử dụng kháng thể tinh sạch pha loãng ở nồng độ 1:5000. Kết quả thu đƣợc trên hình 26 và bảng 11 cho thấy kháng thể tinh sạch phản ứng đặc hiệu với mẫu lúa bệnh SRBSDV (hình 26, bảng 11, cột 7 và 8), cho chỉ số đọc cao hơn so với mẫu chuẩn là protein P10 tái tổ hợp (hình 26, bảng 11, cột 1 và 2). Ngƣợc lại, với mẫu đối chứng âm sử dụng dịch chiết tế bào vi khuẩn mang vector pET28a trống hay các mẫu lúa khỏe và mẫu lúa nhiễm RRSV, phản ứng màu có chỉ số đọc thấp hơn so với mẫu chuẩn. Kết quả này chứng tỏ, kháng thể thu đƣợc có khả năng nhận biết đặc hiệu sự có mặt của protein P10 trong các mẫu lúa nhiễm SRBSDV.
Hình 26: Thử độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch (1:5000)
Cột 1, 2: Mẫu chuẩn dương (protein P10 tái tổ hợp tinh sạch)
Cột 3, 4: Mẫu chuẩn âm (dịch chiết vi khuẩn mang vector pET28a trống) Cột 5, 6: Dịch chiết protein của lúa sạch bệnh
Cột 7, 8: Dịch chiết protein của lúa nhiễm bệnh SRBSDV
Giếng 9, 10: Dịch chiết protein của lúa nhiễm bệnh lùn xoắn lá (RRSV) Hàng A F: Mẫu dịch chiết pha loãng tương ứng ở các tỉ lệ 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:20; 1:50
65
Bảng 11: Kết quả đo OD492 thử độ đặc hiệu của kháng thể bằng phản ứng ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 0,260 0,250 0,105 0,106 0,135 0,172 0,988 1,087 0,171 0,161 B 0,245 0,222 0,109 0,166 0,224 0,264 0,886 0,659 0,164 0,181 C 0,237 0,228 0,109 0,136 0,129 0,188 0,391 0,300 0,098 0,115 D 0,170 0,169 0,102 0,098 0,130 0,134 0,105 0,140 0,096 0,091 E 0,158 0,126 0,097 0,108 0,101 0,102 0,086 0,097 0,090 0,094 F 0,211 0,213 0,152 0,179 0,122 0,096 0,082 0,100 0,114 0,105 Ngoài ra, để xác định khả phát hiện sớm sự có mặt của virus bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đã tinh sạch, chúng tôi tiến hành xét nghiệm trên các mẫu rầy đã nhiễm SRBSDV (bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo) và mẫu rầy không có virus. Trong thí nghiệm này chúng tôi trộn lẫn rầy nhiễm virus với rầy không nhiễm virus theo tỉ lệ “Số rầy bệnh : Số rầy khỏe” lần lƣợt là 5:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 và 0:5 để tạo thành các tổ hợp mẫu xét nghiệm khác nhau. Kết quả xét nghiệm trên bảng 12 cho thấy các mẫu có tỉ lệ rầy nhiễm virus cao hơn 50% có chỉ số OD cao hơn rõ rệt so với mẫu đối chứng. Kết quả này chứng tỏ kháng thể của chúng tôi hoàn toàn có thể phát hiện đƣợc sự có mặt của virus gây bệnh LSĐ trong những mẫu rầy thu thập trên đồng ruộng.
Bảng 12: Kết quả đo OD492 của phản ứng ELISA xét nghiệm SRBSDV trong mẫu rầy Lần xét nghiệm OD492 5B 4B:1K 3B:2K 2B:3K 1B:4K 5K ĐC Lần 1 0,348 0,339 0,279 0,174 0,149 0,132 0,107 Lần 2 0,298 0,278 0,204 0,176 0,165 0,159 0,111 Trung bình 0,323 0,3085 0,2415 0,175 0,157 0,1455 0,109
66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ những kết quả trong quá trình nghiên cứu nhƣ đã trình bày ở trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Đã phân lập, nhân dòng và giải trình tự đoạn gen P10 mã hóa protein vỏ của SRBSDV (Southern rice black strike dwarf virus) gây bệnh lúa lùn sọc đen ở Việt Nam. Đoạn gen P10 phân lập đƣợc gồm 1.674 nucleotide, có hàm lƣợng GC 35,6%, mã hoá một chu ỗi polypeptide dài 557 axit amin và có độ tƣơng đồng đạt 99% so với trình tự đã đăng ký trên Ngân hàng Gen Thế giới (mã số JF803471.1).
- Đã thiết kế thành công vector biểu hiê ̣n pET28a mang trình tự mã hóa protein vỏ P10 và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp P10 trong tế bào vi khu ẩn E. coli
chủng Rossetta ở điều kiện nuôi cấy 16oC trong 16h, cảm ứng bằng IPTG 1,0 mM. Protein tái tổ hợp P10 đƣợc tinh sạch bằng cột sắc ký Ni2+
agarose. Sản phẩm protein tinh sạch có độ tinh khiết cao.
- Đã gây kháng thể kháng protein tái tổ hợp P10 thành công trên chuột bạch. Trên gel điện di polyacrylamide có SDS, kháng thể tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực protein A-sepharose cho 2 băng protein có khối lƣợng 25 và 53 kDa, tƣơng ứng với khối lƣợng của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kháng thể IgG. Kháng thể thu đƣợc có hiệu giá cao (1:6000), có thể nhận diện đặc hiệu sự có mặt của SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh LSĐ trong phƣơng pháp xét nghiệm bằng ELISA và trong mẫu rầy.
KIẾN NGHỊ
Với các kết quả đã thu đƣợc , chúng tôi đề ra một số hƣớng nghiên cứu tiếp theo nhƣ sau:
Hoàn thiện quy trình tinh sạch kháng thể từ kháng huyết thanh chuột để thu đƣợc kháng thể có độ tinh sạch cao hơn.
Đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch với nhiều mẫu lúa bệnh virus khác nhau nhằm nâng cao chất lƣợng và độ tin cậy của kháng thể thu đƣợc phục vụ chẩn đoán sớm bệnh virus SRBSDV.
Xây dƣ̣ng bô ̣ kit chuẩn đoán nhanh virus SRBSDV dƣ̣a trên phƣơng pháp ELISA, sử dụng kháng thể kháng đặc hiệu proteinP10.
67
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Bền (2009), “Bắt bệnh” lúa lùn: Chƣa ngã ngũ nguyên nhân”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 24/9/2009.
2. Bộ NN & PTNT (2009), Công điê ̣n (Số 31/CĐ-BNN-BVTV) v/v Cảnh giác đối với bê ̣nh vàng lùn , lùn xoắn lá trên lúa bộc phát lần đầu tiên ở phía Bắc để phát hiê ̣n, phòng trừ kịp thời.
3. Hà Viết Cƣờng, Nguyễn Viết Hải, Vũ Triệu Mân (2009), "Xác định nguyên nhân lúa lùn sọc đen (lùn lụi) trên lúa mùa năm 2009 tại miền Bắc", Tạp chí BVTV, 6, tr. 24-31.
4. Nguyễn Đình Hƣơng (2009), “Nghệ An: Ra quân tiêu diệt nguồn bệnh dịch “lùn lụi” lúa”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 14/9/2009.
5. Sao Mai (2009), “Chuyện khẩn cấp ở Nghệ An: Trên 5.500 ha lúa HT bị VL – LXL”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 7/9/2009.
6. Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương , Trƣờ ng Đa ̣i ho ̣c Nông nghiê ̣p I, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Vũ Triệu Mân (2010), Bê ̣nh virus hại thực vật ở Viê ̣t Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nô ̣i.
8. Đinh Văn Thành, Nguyễn Thị Dƣơng, Lại Tiến Dũng, Phan Thị Bích Thu (2008), "Một số kết quả nghiên cứu về sinh thái rầy lƣng trắng ở phía Bắc Việt Nam", Hội nghị côn trùng toàn quốc Việt Nam lần thứ 6, Hà Nội, 9-10/5/2008, 281-287.
9. Ngô Vĩnh Viễn, Phạm Thị Vƣợng, Nguyễn Nhƣ Cƣờng, Tạ Hoàng Anh, Nguyễn Thị Me, Phan Bích Thu, Phạm Hồng Hiển, Hà Viết Cƣờng (2009), "Kết quả chẩn đoán bệnh virus lúa lùn sọc đen ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam", Tạp chí BVTV, 6, tr. 8-18.
68
Tài liệu tiếng Anh
10. Amero S. A., James T. C. and Elgin C. R. (1994), "Production of antibodies using protein in gel bands" In: Basic Protein and Peptide Protocols Vol.32 (Humana Press, editor), Springer, pp. 717-720.
11. Caspal D. L., Klug A. (1962), "Physical principles in the construction of regular viruses", Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 27, pp. 1-24.
12. Cuong H. V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J. L. (2008), "Design DNA application of two novel degenerate primer pairs for the detection DNA complete genomic characterization of potyvirus", Arch. Virol., 153, pp. 25-36.
13. Cuong H. V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J. L. (2008), “Molecular characterization of begomovirus DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminivirus were present in the Old World prior to continental separation”, J. Gener. Virol., 89, pp. 312-326.
14. Dodds J. A., Morris T. J., Jordan R. L. (1984), "Plant viral double-stranded RNA", Annu. Rev. Phytopathol., 22, pp. 151-168.
15. Goodman M. F. (2002) "Error-prone repair DNA polymerase in prokaryotes and eukaryotes", Annu. Rev. Biochem, 71, pp. 17 - 50.
16. GuoHui Z., Jung W. J., Jiang C. D., Peng L., Lin X. D., Guang Z. S. (2008), "Southern rice black–streaked dwarf virus: A new proposed Fijivirus species in the family Reoviridae", Chin. Sci. Bullet., 53, pp. 3677-3685.
17. Hibino H. (1989), "Insect-borne virus of rice", Advances in Disease Vector Research, Springer 6, pp. 209-41.
18. Hibino H. (1996), "Biology and epidemiology of rice viruses", Ann. Rev. Pathology., Springer 34, pp. 249-274.
69
19. Kishimoto R. (1979), "Brown planthopper migration", In Brown Planthopper: Threat to Rice Production in Asia, Los Ba˜nos, Philippines: IRRI, pp. 113–124.
20. Hoang A. T., Zhang H. M., Yang J., Chen J. P., Hebrard E., Zhou G. H., Vinh V. N., Cheng J. A. (2011), "Identification, characterization, and distribution of southern rice black-streaked dwarf virus in Viet-nam", Plant. Dis., 95, pp. 1063–1069.
21. Laemmli V. K. (1970) "Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacterophage T4", Nature 227, pp. 680 - 685.
22. Lee J. Y, Lee S. H., Cung B. J. (1977), "Studies on the occurrence of rice black- streaked dwarf virus in Korea", Korean J. Plant Prot., 16, pp.121–25.
23. Li Y., Xia Z., Peng J., Zhou T., Fan Z. (2013), "Evidence of recombination and genetic diversity in southern rice black-streaked dwarf virus", Arch. Virol., 158, pp, 2147-2151.
24. Michael G. R., Venigalla B. R. (2012), "Viral Molecular Machines", Advance in Experimental Medicine and Biology, pp. 726.
25. Mullis K. F., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G. and Erlich H. (1986) "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction", Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology, 51, pp. 263 – 273.
26. Sambrook J. and Russell D. W. (2001), Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
27. Shikata E. (1974), “Rice black streaked dwarf virus”, CMI/AAB Description of Plant Viruses. No 135.
28. Studier F. W. (2005), "Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures", Protein Expr. Purif, 41, pp. 207 – 234.
70
29. Wang Q., Yang J., Zhou G. H., Zhang H. M., Chen J. P., Adams M. J. (2010), "The complete genome sequence of two isolates of southern rice black-streaked dwarf virus, a new member of the genus Fijivirus", J. Phytopathol., 158, pp. 733–737
30. Wang Z., Fang S., Xu J., et al., (2003), “Sequence analysis of the complete genome of rice black-streaked dwarf virus isolated from maize with rough dwarf disease”, Virus Genes, 27, pp. 163-168.
31. Wang Z., Yu D., Li X., et al., (2012), “The Development and Application of a Dot-ELISA Assay for Diagnosis of Southern Rice Black-Streaked Dwarf Disease in the Field”, Viruses, 4, pp. 167 - 183.
32. Wang Z. H., Fang S. G., Zhang Z. Y., Han C. G., Li D. W., Yu J. L. (2006), "Development of an ID-ELISA for the detection of Rice black-streaked dwarf virus in plants", J. Virol. Methods., 134 (1-2), pp. 61-65. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
33. Xie L.H. (1986), "Research on rice virus diseases in China", Proc. Symp. Trop. Agric. Res. Trop. Agric. Res. Ser., 19, pp. 45–58
34. Yin X., Xu F. F., Zheng F. Q., Li X. D., Liu B. S., Zhang C. Q. (2011), "Molecular characterization of segments S7 to S10 of a southern rice black- streaked dwarf virus isolate from maize in Northern China", Virol. Sin., 26, pp. 47–53.
35. Zhang H. M., Yang J., Chen J. P., Adams M. J. (2008), "A black-streaked dwarf disease on rice in China is caused by a novel fijivirus", Arch. Virol., 153, pp. 1893–1898.
36. Zhenchao W., Dandan Y., Xiangyang L., Mengjiao Z., Zhuo C., Liang B., Jiaju L., Linhong J., Deyu H., Song Y. and Baoan S. (2012), “The Development and Application of a Dot-ELISA Assay for Diagnosis of Southern Rice Black- Streaked Dwarf Disease in the Field”, Viruses, 4(1), pp. 167-183.
71
37. Zhou T., Du L. L., Fan Y. J., Zhou Y. J. (2012), "Reverse transcription loop- mediated isothermal amplification of RNA for sensitive and rapid detection of southern rice black-streaked dwarf virus", J. Virol. Methods, 180, pp. 91–95.
i
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các virus hại lúa đƣợc công bố hiện nay [11, 12] STT
Virus Bộ Giống Vector Ký chủ
tự nhiên Phân bố
1 Rice black-streaked dwarf
virus (RBSDV) Reoviridae Fijivirus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy Laodelphax striatellus.
Virus nhân lên trong vector nhƣng không truyền qua trứng
Lúa, ngô, lúa mỳ, lúa miến, Alopecurus aequalis và một số loài cỏ. Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên 2
Southern rice black- streaked dwarf virus (SRBSDV)
Reoviridae Fijivirus Lan truyền theo kiểu bền vững
nhờ rầy Sogatella furcifera
Lúa, ngô và một số loài cỏ
Trung Quốc và Việt Nam
3 Rice bunchy stunt virus
(RBSV) Reoviridae
Phytoreo- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy Nephotettix cincticeps và
N. virescens. Virus nhân lên trong vector
Lúa
Trung Quốc (Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Hồ Bắc)
ii
STT (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Virus Bộ Giống Vector Ký chủ
tự nhiên Phân bố
4 Rice dwarf virus (RDV) Reoviridae Phytoreo- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy N. cincticeps, N.
nigropictus, Recilia dorsalis, và một số loài Nephotettix spp. Rầy N. cincticeps là vector quan trọng nhất. Virus nhân lên trong vector và truyền qua trứng
Lúa và một vài loài cỏ dại. Cỏ dại không phải là nguồn bệnh quan trọng Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Nêpan, và Philippin 5
Rice gall dwarf virus
(RGDV) Reoviridae Phytoreo-
virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy N. cincticeps, N.
nigropictus, Recilia dorsalis, và một số loài Nephotettix spp. Rầy N. cincticeps là vector quan trọng nhất. Virus nhân lên trong vector và truyền qua trứng
Lúa và cỏ A.aequalis Trung Quốc (Phúc Kiến và Quảng Đông), Malaysia và Thái Lan 6
Rice giallume virus
(RGV) Luteo-
viridae
Luteo- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rệp Rhopalosiphum padi và một số loài rệp muội khác. Virus không nhân lên nhƣng tuần hoàn trong vector
Lúa, một số cây ngũ cốc và cỏ dại
Ý (miền Bắc) và Tây Ban Nha
iii
STT
Virus Bộ Giống Vector Ký chủ
tự nhiên Phân bố
7
Rice grassy stunt virus
(RGSV) Luteo-
viridae
Tenui- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy nâu Nilaparvata lugens
và 2 loài rầy Nilaparvata spp. khác. Virus nhân lên trong vector nhƣng không truyền qua trứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lúa Trung Quốc, Nhật
Bản và Đài Loan
8 Rice hoja blanca virus
(RHBV)
Luteo- viridae
Tenui- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững
nhờ Sogatodes orizicola Lúa Châu Mỹ (cả Trung Mỹ, Nam Mỹ và Hoa Kỳ)
9 Rice ragged stunt virus
(RRSV) Reoviridae
Oryza- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy nâu N. lugens và các loài rầy Nilaparvata spp. khác. Virus nhân lên trong vector nhƣng không truyền qua trứng
Lúa
Indonesia, Malaysia, Philippin, Thái Lan, Trung Quốc, Ấn Độ, Sri Lanka, Đài Loan và Nhật Bản
10 Rice necrosis mosaic
virus (RNMV) Potyviridae
Bymo-
virus Nấm đất Polymyxa graminis Lúa Nhật Bản, Ấn Độ 11
Rice stripe necrosis virus
(RSNV) Potyviridae Furovirus
Nấm đất P. graminis và có thể
lây nhiễm cơ học Lúa
Bờ Biển Ngà, Liberia, Nigeria và Sierra Leone
iv
STT
Virus Bộ Giống Vector Ký chủ
tự nhiên Phân bố
12 Rice stripe virus (RSV) Potyviridae Tenui- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy L. striatellus và một số loài rầy khác. Virus nhân lên trong vector và truyền qua trứng. Có thể truyền qua tiếp xúc cơ học nhƣng khó
Lúa, lúa mỳ, lúa miến, đại mạch, kê đuôi cáo và một số cỏ dại (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Nga (Siberi) và Đài Loan.
13
Rice transitory yellow-ing
virus (RTYV) Rhabdov-
iridae
Nucleo- rhabdo- virus
Lan truyền theo kiểu bền vững nhờ rầy N. cincticeps, N. nigropictus, và N. virescens.
Virus nhân lên trong vector nhƣng không truyền qua trứng
Lúa
Miền Trung và miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Thái Lan, Lào và Việt Nam
14
Rice tungro bacilli-form
virus (RTBV) Caulimo-
viriadae
Tungro- virus
Lan truyền theo kiểu bán bền vững nhờ rầy N. virescens, N. nigropictus, N. cincticeps,
Recilia dorsalis, và một số loài
Nephotettix spp. N. virescens là vector quan trọng nhất
v
STT
Virus Bộ Giống Vector Ký chủ
tự nhiên Phân bố
15
Rice tungro spherical
virus (RTSV) Sequi-
viridae
Waika- virus
Lan truyền theo kiểu bán bền vững nhờ rầy N. virescens, N. nigropictus, N. cincticeps,
Recilia dorsalis, và một số loài
Nephotettix spp. N. virescens là vector quan trọng nhất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lúa Các nƣớc trồng lúa châu Á
16
Rice yellow mottle virus
(RYMV) Sequi-
viridae
Sobem - virus
Lan truyền kiểu bán bền vững nhờ một số loài bọ cánh cứng họ Chrysomelidae. Virus không tuần hoàn trong vector và có thể