Để khẳng định chính xác đoạn gen đƣợc nhân bản và nhân dòng vào vector pGEMT có đúng là đoạn gen P10 mã hoá protein vỏ SRBSDV hay không, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn gen này trong vector tái tổ hợp pGEMT/P10 theo phƣơng pháp của Sanger và cộng sự và đọc bằng hệ thống máy giải trình tự ABI 3100.
45
Trong nghiên cứu này, máy đọc trình tự ABI 3100 đƣợc sử dụng để giải trình tự và phân tích kết quả trên phần mềm BioEdit. Kết quả giải trình tự cho thấy đoạn DNA phân lập đƣợc là một gen hoàn chỉnh có chiều dài 1.674 bp chứa bộ ba khởi đầu phiên mã ATG ở đầu 5’ và bộ ba kết thúc phiên mã TCA ở đầu 3’, đoạn gen P10 mã hóa cho 557 axit amin, hàm lƣợng GC là 35,6% (phụ lục 2). So sánh kết quả giải trình tự của đoa ̣n gen P10 của SRBSDV phân lập tại Việt Nam đã đƣợc chúng tôi nhân dòng với trình tự đoa ̣n gen P10 mã hoá protein vỏ SRBSDV đƣợc công bố trên GenBank (mã số JF803471.1), chúng tôi thu đƣợc kết quả tƣơng đồng 99%, vớ i 8 vị trí nucleotide sai khác (Phụ lục 3). Khi so sánh trình tự axit amin suy diễn, chúng tôi phát hiện có 2 vị trí sai khác, cụ thể ở vị trí 388 axit amin K đã đƣơ ̣c thay thế bởi axit amin N , ở vị trí 550 axit amin M đã đƣợc thay thế bởi axit amin I (Phụ lục 4). Tuy nhiên, bằng phân tích dự đoán cấu trúc protein (phƣơng pháp ma trâ ̣n BLOSUM 62), chúng tôi xác định đƣợc sự thay đổi axit amin này không làm ảnh hƣởng lớn đến cấu trúc hay hoạt tính của protein .
Tƣ̀ các kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi có thể kết luận đã nhân dòng thành công đoa ̣n gen mã hoá protein vỏ c ủa virus SRBSDV. Sản phẩm nhân dòng đƣợc chúng tôi tiếp tục sƣ̉ du ̣ng cho thí nghi ệm biểu hiê ̣n protein P10 tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli.
3.2. BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP P10 3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện pET28a mang đoạn gen P10