Hệ gen của virus gây bệnh lúa LSĐ có cấu trúc gồm nhiều phân đoạn RNA sợi đôi (dsRNA) đã đƣơ ̣c nhóm nghiên c ứu thuộc Bộ môn Bệnh học Phân tử thực vật (Viện Di truyền Nông nghiệp) phân lập và sƣ̉ du ̣ng làm khuôn trong phản ƣ́ng RT-PCR sinh tổng hợp cDNA của phân đoạn S10 có chiều dài 1.797 bp. Phân đoạn này có chứa một khung đọc mở có chiều dài 1.674 nucleotide, mã hóa cho protein hình thành lớp vỏ ngoài của phân tử virus . Đây là một protein quan trọng tham gia vào quá trình lây nhiễm của virus từ môi giới truyền bệnh và các loại cây chủ cũng nhƣ sự di chuyển của virus trong tế bào, đƣơ ̣c go ̣i là protein P10.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã s ử dụng cDNA của phân đoa ̣n S 10 để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 bằng cặp mồi đặc hiệu của gen. Cặp mồi đă ̣c hiê ̣u S 10-ORF-Fw/S10-ORF-Rv đƣơ ̣c thiết kế cho phép nhâ n bản trình tự đoạn gen P10 có kích thƣớc 1674 bp, ngoài ra có thiết kế thêm vị trí nhận biết 2 enzyme cắt giới ha ̣n BamHI và XhoI ở đầu 5’ để thuận tiê ̣n cho viê ̣c thi ết kế vector biểu hiê ̣n sau này (bảng 6).
Bảng 6: Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoạn gen P10
Thành phần Thể tích (µl) Đệm Taq polymerase 10X 5,0 dNTPs (2 mM) 5,0 S10-ORF-Fw (10 pmol/µl) 2,0 S10-ORF-Rv (10 pmol/µl) 2,0 Khuôn DNA 3,0
Taq DNA polymerase 0,2
H2O khử ion, khử trùng 32,8
38
Với các thành phần đƣợc trình bày trong bảng 6, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 theo chu trình nhiệt nhƣ sau:
Sản phẩm PCR sau đó đƣợc chúng tôi điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả điện di cho thấy chúng tôi đã nhân bản đƣợc một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1,7 kb, tƣơng ƣ́ ng với kích thƣớc tính toán lý thuyết của đoa ̣n gen P10 (hình 5, giếng 1). Ngƣợc lại, ở phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA này (hình 5, giếng 2).
Hình 5. Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 trên gel agarose 1%
Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1 kb
Giếng 1: Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen P10 Giếng 2: Đối chứng âm (khuôn là H2O)
39
Với kết quả này chúng tôi có thể bƣớc đầu kết luận đã nhân bản đƣợc đoa ̣n gen P10 của SRBSDV tƣ̀ cDNA của phân đoa ̣n S 10. Sản phẩm DNA nhân bản thu đƣợc có kích thƣớc tƣơng tự với tính toán lý thuyết là khoảng 1,7 kb.