Nguyên tắc : Các protein có thể đƣợc phân tách dựa trên khối lƣợng bằng điện di trên acrylamide dƣới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein đƣợc hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các liên kết không c ộng hóa trị của protein ban đầu. Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lƣợng của protein. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ đƣợc nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu nhƣ Coomassie blue. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Vì vậy, những protein chênh lệch về khối lƣợng có thể phân biệt đƣợc bằng SDS-PAGE.
Tiến hành: Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 6% và gel tách là 12%, với tỉ lệ các thành phần nhƣ trong bảng 5.
Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp đƣợc trộn đều và đúc vào khuôn kính đã đƣợc gắn sẵn trên giá đỡ. Sau khi phần gel tách đƣợc trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và để gel trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.
Mẫu protein đƣợc trộn vào đệm mẫu (nồng độ 4X) theo tỉ lệ thể tích 3:1, đun cách thủy trong 10 phút ở 95oC, làm lạnh và dùng để tra giếng chạy điện di. Đệm chạy điện di là Tris-glycin, pH 8,8 chứa SDS 1%, chạy điện di với điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Tiến hành nhuộm gel với dung dịch CBB 1% pha trong hỗn hợp methanol: axetic: H2O với tỉ lệ thể tích là 3: 6: 1, sau khoảng 20 phút tiến hành tẩy màu bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng.
32
Bảng 5: Thành phần gel SDS-PAGE
Thành phần Gel tách 12% Gel cô 6%
H2O khƣ̉ ion 1,6 ml 0,68 ml Dung dịch acrylamide 30% 2 ml 170 μl Tris-HCl 1,5M pH 8,8 1,3 ml -- Tris-HCl 1M pH 6,8 -- 130 μl SDS 10% 50 μl 10 μl APS 10% 50 μl 10 μl TEMED 2 μl 1 μl