Nguyên tắc: Kĩ thuật Dot blot là một kĩ thuật mới trong sinh học phân tử sử dụng để phát hiện các phân tử sinh học phục vụ cho việc phân tích và xác định protein. Kĩ thuật này thực hiện tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp Westen blot tuy nhiên nó đơn giản và dễ dàng thực hiện hơn. Thay vì phải chuyển các phân tử protein từ bản điện di gel SDS-PAGE lên màng nitrocellulose thì phƣơng pháp Dot blot cho phép thấm điểm trực tiếp trên màng nitrocellulose. Mẫu protein đƣợc thấm thành các điểm tròn lên màng và đƣợc giữ lại, sau đó các mẫu điểm tròn này đƣợc ủ với kháng thể sơ cấp và thứ cấp tƣơng tự nhƣ đối với phƣơng pháp Western blot.
Các bƣớc tiến hành:
- Protein sau khi đƣợc chấm điểm trực tiếp lên màng nitrocellulose bằng cách sử dụng micropipete nhỏ dung dịch thành giọt trên màng, đợi cho khô rồi tiếp tục nhỏ liên tiếp nhiều lần. Sau đó, để màng thật khô rồi thực hiện các phản ứng tiếp theo
- Cố định màng bằng dung dịch BSA 1% trong Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, có NaCl 150 mM (TBS) bằng cách lắc nhẹ (30 phút - 1 giờ) ở 37oC.
- Tráng rửa màng (3 lần) bằng đệm TBS để loại bỏ BSA thừa. - Ủ màng với kháng thể sơ cấp, lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC.
- Loại bỏ kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng bằng cách tráng rửa màng trong đệm TBS. Sau đó ủ màng với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatase kiềm.
- Hiện màu các băng protein bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất p- nitro blue tetrazolium chloridel 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphat (NBT/BCIP) pha trong đệm TBS pH 9,0 có MgCl2 5 mM. Đến khi các băng hiện rõ thì ngừng phản ứng bằng đệm TBS có chứa 20 mM EDTA.
36