Phản ứng ghép nối đƣ ợc thực hiện để tạo ra vector tái tổ hợp mang đoạn DNA cần nhân dòng. Chúng tôi đã nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 bằng bộ kit pGEM®-T Vector System II củ a hãng Promega .
Vector pGEMT (hình 6) có kích thƣớc 3.015 bp, đƣợc thiết kế có chứa điểm khởi đầu sao chép ori của phage F 1 nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli, đồng thời chứa gen Ampr chỉ thị kháng kháng sinh Ampicillin, cho phép chọn lọc các thể biến nạp mang vector này trên môi trƣờng nuôi cấy có Ampicillin. Ngoài ra, pGEMT còn chứa gen chọn lọc lacZ và operon lac điều khiển hoa ̣t đô ̣ng của gen mã hoá β-galactosidase. Khi có đoạn DNA ngoại lai đƣợc chèn vào vector ở vùng trình tự đa điểm cắt nằm trong gen lacZ thì sẽ bất hoạt gen mã hoá enzyme β- galactosidase. Do đó, khi đƣơ ̣c nuôi cấy trên môi trƣờng có cơ chất X-gal, các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp sẽ không phân huỷ đƣợc cơ chất và có màu trắng; ngƣợc lại, các thể biến nạp mang plasmid pGEMT tƣ̣ đóng vòng sẽ sinh tổng hợp enzyme β- galactosidase có khả năng phân huỷ X-gal và có màu xanh.
40
Sản phẩm của phản ứng ghép nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli
chủng DH5 (mục 2.2.4) và cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc LB có bổ sung chất kháng sinh ampicillin 50 g/ml, chất cảm ứng IPTG và cơ ch ất X-Gal (hình 7). Theo lý thuyết các khuẩn lạc E. coli màu trắng là chứa plasmid tái tổ hợp, trong khi đó các khuẩn lạc xanh mang plasmid nguyên bản (hình 7). Kết quả thu đƣợc cho phép chúng tôi bƣớc đầu kết luận đã thu nhận đƣợc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen P10.
Hình 7. Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào tế bào E. coli