BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP P10

3.2.1.1. Ghép nối đoạn gen P10 vào vector biểu hiện pET28a

a) Xử lý vector pGEMT/P10 và pET28a bằng BamHI và XhoI

Khi phân lập đoạn gen P10, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi có thiết kế vị trí nhận biết của 2 enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI (bảng 4), trong vùng đa điểm cắt (multi cloning site) của vector biểu hiện pET28a cũng có vị trí nhận biết của hai enzyme này (hình 12). Chính vì vậy, để đƣa trình tự mã hóa của gen P10 vào vector biểu hiện pET28a, chúng tôi đã xử lý hai vector pGEMT/P10 và pET28a với đồng thời hai enzyme BamHI/XhoI.

46

Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10 và pET28a Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Đê ̣m 10X 5,0

DNA plasmid 41

BamHI 2,0

XhoI 2,0

Tổng thể tích 50

Phản ứng cắt giới hạn đƣợc thực hiện v ới các thành phần nhƣ trong b ảng 8. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 37°C trong 30 phút, sau đó đun nóng lên 75oC trong 10 phút để bất hoạt enzyme . Sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

Hình 11: Điện di sản phẩm cắt giới ha ̣n bằng BamHI/XhoI

Giếng Mk: thang chuẩn DNA 1kb

Giếng 1: Sản phẩm cắt giới hạn vector pGEMT/S10 Giếng 2: Vector pGEMT/S10 nguyên bản

Giếng 3: Sản phẩm cắt giới hạn vector pET28a Giếng 4: Vector pET28a nguyên bản

Kết quả điện di trên hình 11 cho thấy đối với sản phẩm phản ứng cắt giớ i ha ̣n vector pGEMT/P10, chúng tôi thu đƣợc hai băng DNA có kích thƣớc 1,7 kb và 3,0 kb, tƣơng ƣ́ ng với kích thƣ ớc tính toán lý thuyết của đoạn gen P10 và vector

47

pGEMT (hình 11, giếng 1). Đối với sản phẩm cắt giới ha ̣n vector pET28a, chúng tôi thu đƣợc một băng DNA duy nhất có kích thƣớc 5,3 kb là kích thƣớc c ủa vector pET28a mạch thẳ ng (hình 11, giếng 3). Băng DNA 1,7 kb và 5,3 kb tƣơng ứng với đoạn gen P10 và vector pET28a mạch thẳng đƣợc chúng tôi cắt chính xác khỏi bản gel agarose 1% và tinh sạch bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Fermentas) theo quy trình đã mô tả trong phần 2.2.6. Sản phẩm DNA tinh sạch đƣợc bảo quản ở - 20oC để sử dụng cho thí nghiệm ghép nối đoạn gen P10 vào vector biểu hiện pET28a.

b) Ghép nối đoạn gen P10 vào vector biểu hiện pET28a

Vector pET28a là vector biểu hiê ̣n (hình 12) có kích thƣớc 5.639 bp, mang gen chỉ thị kháng chất kháng sinh Kanamycin, gen lacI và trình tự đa điểm cắt (MCS) nằm trong vùng điểu khiển của operon lac. Khi có một đoạn DNA ngoại lai đƣợc chèn vào vector ở vùng trình tƣ̣ đa điểm cắt nằm trong vùng biểu hiê ̣n , nó sẽ chịu tác đô ̣ng của gen lacI và operon lac.

48

Phản ứng ghép nối đoạn gen P10 vào vector pET28a đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n theo quy trình đã mô tả trong m ục 2.2.3. Hỗn hợp phản ứng ghép nối sau đó đƣợc chúng tôi biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 và cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ sung chất kháng sinh Kanamycin (100 µg/ml). Sau khi ủ đĩa thạch qua đêm, chúng tôi thu đƣợc một số khuẩn lạc xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc (hình 13). Các khuẩn lạc này có khả năng là những khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET28a chứa trình tự mã hóa của đoạn gen P10.

Hình 13. Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào E. coli DH5

3.2.1.2. PCR kiểm tra khuẩn lạc

Để kiểm tra các khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen P10

hay không, chúng tôi chọn ngẫu nhiên một số khuẩn lạc trên đĩa thạch nuôi cấy để tiến hành PCR với cặp mồi vector T7-Fw/T7-Rv. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho thấy cả 3 phản ứng sử dụng khuôn là 3 khuẩn lạc khác nhau đều cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 2 kb (Hình 14, giếng 2, 3, 4). Ngƣợc lại, với sản phẩm của phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn (Hình 14, giếng 5), chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào. Với phản ứng đối chứng dƣơng sử dụng vector pET28a nguyên bản làm khuôn, chúng tôi thu đƣợc băng DNA có kích thƣớc 0,3 kb (Hình 14, giếng 1).

49

Kết quả này phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết của sản phẩm PCR , bao gồm đoa ̣n gen P10 dài 1,7 kb và đoa ̣n trì nh tƣ̣ 0,3 kb là kích thƣớc giƣ̃a 2 mồi T7-Fw/T7-Rv trên vector pET28a nguyên bản.

Hình 14: Điện di sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv

Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1kb

Giếng 1: Sản phẩm PCR dùng khuôn là vector pET28a trống Giếng 2-4: Sản phẩm PCR khuôn là khuẩn lạc 1-3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Giếng 5: Đối chứng âm (khuôn là H2O)

Kết quả này cho phép chúng tôi bƣớc đầu kết luận đã thu nhận đƣợc các khuẩn lạc dƣơng tính mang plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen P10 mã hoá protein vỏ ngoài SRBSDV.

3.2.1.3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET28a mang đoạn gen P10

Để khẳng định các khuẩn lạc thu đƣợc có thực sự mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen P10 mong muốn hay không , chúng tôi đã chọn ng ẫu nhiên 1 khuẩn lạc để nuôi và tinh s ạch plasmid theo quy trình của bộ kit GenJETTM

Plasmid Miniprep (mục 2.2.5). Sự có mặt của đoạn gen P10 trong plasmid đƣợc chúng tôi xác định bằng 2 phƣơng pháp: phƣơng pháp PCR và phƣơng pháp xử lý với enzyme cắt giới hạn.

50

a) Kiểm tra sự có mặt gen P10 trong plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR

Phản ứng PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp đƣợc chúng tôi thực hiện với 2 cặp mồi: cặp mồi đặc hiệu của vector pET28a (T7-Fw/T7-Rv) có khoảng cách 1.990 bp và cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen P10 (S10-ORF-Fw/S10-ORF-Rv). Sản phẩm PCR sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

Hình 15: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid pET28a/P10

Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1kb

Giếng 1-2: Sản phẩm PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv

Giếng 3-4: Sản phẩm PCR với cặp mồi S10-ORF-Fw/S10-ORF-Rv Giếng 1-3: Đối chứng âm (khuôn là H2O)

Giếng 2-3: Sản phẩm PCR từ khuôn là plasmid tinh sạch

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% trên hình 15 cho thấy, sản phẩm PCR từ plasmid với cặp mồi đặc hiệu S10-ORF-Fw/S10-ORF-Rv cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 1,7 kb (hình 15, giếng 4); sản phẩm PCR với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv cho một băng DNA có kích thƣớc khoảng 2,0 kb (hình 15, giếng 2), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA theo tính toán lý thuyết. Đối với phản ứng hai đối chứng âm không sử dụng DNA plasmid làm khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào (hình 15, giếng 1 và 3). Nhƣ vậy, với kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định plasmid tinh sạch đƣợc chính là plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen P10 mã hóa cho protein vỏ SRBSDV.

51

b) Kiểm tra sự có mặt gen P10 trong plasmid tái tổ hợp bằng cách xử lý với enzyme cắt giới hạn

Để khẳng định chắc chắn đoạn DNA đã đƣợc chèn vào vector pET 28a là đoa ̣n gen P10, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xử lý plasmid tái tổ hợp với enzyme cắt giới hạn. Trên cặp mồi đă ̣c hiê ̣u đƣơ ̣c dùng để nhân bản đoa ̣n gen P10 có thiết kế trình tự nhận biết của hai enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI, ngoài ra trong trình tự của đoa ̣n gen P10 có vị trí nhận biết của enzyme HindIII tại vi ̣ trí 1.322 bp, trong khi trên vector pET 28a không có trình tƣ̣ nhâ ̣n biết của các enzyme này . Chính vì vậy, khi thƣ̣c hiê ̣n phản ƣ́ng cắt đồng thời v ới 2 enzyme BamHI/XhoI, vector tái tổ hợp pGEMT/P10 sẽ bị cắt thành hai đoạn DNA có kích thƣớc khác nhau; khi xử lí vector tái tổ hợp với HindIII, enzyme này s ẽ cắt vector ta ̣i một điểm để tạo ra một đoạn DNA mạch thẳng.

Bảng 9: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pET/P10 Thành phần phản ứng Thể tích (μl) Phản ứng 1 Phản ứng 2 Đê ̣m 10X 0,5 0,5 Plasmid pET/P10 2,0 2,0 Enzyme BamHI 0,5 -- Enzyme XhoI 0,5 --

Enzyme HindIII -- 0,5

H2O cất khƣ̉ ion vô trùng 1,5 2,0

Tổng thể tích 5,0 5,0

Chúng tôi tiến hành phản ứng cắt giới hạn với các thành phần nhƣ trong bảng 9. Hỗn hợp phản ứng sau khi đƣợc ủ ở 37°C trong 30 phút, đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc trên hình 16 cho thấy sản phẩm của phản ứng cắt đồng thời bằng BamHI/XhoI cho hai băng DNA, băng DNA thứ nhất có kích thƣớc khoảng 5,3 kb là bộ khung nguyên bản của vector pET28a và băng DNA thứ hai có kích thƣớc 1,7 kb là đoạn gen P10 (hình 16, giếng 2). Tƣơng tƣ̣ đối với sản phẩm của phản ƣ́ng cắt bằng enzyme HindIII, chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm là mô ̣t băng DNA duy nhất có

52

kích thƣớc 7,0 kb. Kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết c ủa vector tái tổ hợp pET28a/P10 mạch thẳng.

Hình 16: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pET28a/P10

Giếng Mk: thang DNA chuẩn 1 kb; Giếng 1: vector pET28a/P10 nguyên bản

Giếng 2: sản phẩm cắt giới hạn bằng BamHI/XhoI; Giếng 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng HindIII.

Kết quả thu đƣợc ở trên cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn việc thành công nhân dòng đoạn gen P10 vào vector pET28a.

3.2.2. Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp P10

3.2.2.1. Biến nạp pET28a/P10 vào vi khuẩn E. coli (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Hệ vector biểu hiện pET28a có mang trình tự của promoter T7 có khả năng điều khiển biểu hiện của gen đích, tuy nhiên promoter này cũng gây độc cho chính tế bào vật chủ. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chủng tế bào vi khuẩn

E.coli Rosetta là m ột chủng vi khuẩn đã đƣ ợc gây đột biến để kháng tính độc của promoter T7 trong vector pET 28a. Ngoài ra, chủng Rosetta đƣợc bổ sung plasmid mang gen mã hoá 7 loại tRNA mang các bộ ba đối mã hiếm gặp ở vi khuẩn nhƣng thƣờng gă ̣p ở sinh vâ ̣t nhân chuẩn, có thể hạn chế tác động của hiện tƣợng thiên vị bộ ba lên biểu hiê ̣n các protein có nguồn gốc tƣ̀ sinh vâ ̣t nhân chuẩn trên E.coli.

53

Plasmid tái tổ hơ ̣p pET28a/P10 đƣơ ̣c chúng tôi biến na ̣p vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng Rosetta theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.4 và cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung chất kháng sinh kanamycin (50 g/ml) và chloramphenicol (34

g/ml). Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc đƣơ ̣c kiểm tra bằng phản ƣ́ng PCR với că ̣p mồi T7-Fw/T7-Rv đă ̣c hiê ̣u cho vector pET28a (hình 17).

A B

Hình 17: Biến nạp vector pET28a/P10 vào vi khuẩn E. coli Rossetta

A: Thể biến nạp vector pET 28a/P10 trên môi trƣờng chọn lọc kanamycin (50

g/ml) và chloramphenicol (34 g/ml).

B: Điện di sản phẩm PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv

Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1kb

Giếng 1: Sản phẩm PCR từ khuôn là plasmid pET28a/P10 Giếng 2-6: Sản phẩm PCR khuôn là khuẩn lạc 1-5

Giếng 7: Đối chứng âm (khuôn là H2O)

Kết quả điê ̣n di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc trên gel agarose 1% cho thấy 4 phản ứng sử dụng khuôn là các khuẩn lạc số 1, 3, 4 và 5 cho một băng DNA duy nhất có kích thƣớc 2,0 kb (hình 17B, giếng 2, 4, 5 và 6). Kích thƣớc của băng DNA này tƣơng tự với kích thƣớc băng DNA của sản phẩm phản ứng đối chƣ́ng dƣơng sử dụng vector pET28a/P10 làm khuôn (hình 17B, giếng 1). Đối với phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn (hình 17B, giếng 7) và phản ứng PCR từ khuẩn lạc số 2 (hình 17B, giếng 3), chúng tôi không thu đƣợc băng DNA này. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thu đƣợc dòng tế bào E. coli chủng Rossetta mang vector tái tổ hợp

54

pET28a/P10. Dòng tế bào này đƣợc bảo quản trong dung dịch glycerol 10% ở -80oC để sử dụng cho thí nghiệm biểu hiện gen sau này.

3.2.2.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện

Sau khi đã biến nạp thành công plasmid pET28a/P10 vào vi khuẩn E. coli

chủng Rossetta chúng tôi tiến hành biểu hiện gen mã hóa protein P10. Theo công bố của Studier (2005), quá trình tự cảm ứng xảy ra khi tế bào sử dụng hết nguồn glucose và chuyển sang sử dụng lactose [17]. Quá trình này xảy ra khi tế bào đạt trạng thái bão hòa, thƣờng là chỉ cần nuôi cấy ở 37oC. Ban đầu chúng tôi nuôi cấy biểu hiện protein P10 ở các điều kiện cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và 0,5 mM ở 370C trong ở 3 h. Sau khi nuôi cấy, dịch khuẩn đƣợc tiến hành ly tâm và siêu âm phá màng tế bào để thu dịch chiết nhƣ đã đƣợc trình bày ở mục 2.2.11. Dịch chiết sau đó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE.

A B

Hình 18: Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện chuẩn

A: Cảm ứng ở 3h, 370C, IPTG 1 mM B: Cảm ứng ở 3h, 370C, IPTG 0,5 mM

Đường chạy 1: Dịch chiết tổng số không có chất cảm ứng IPTG Đường chạy 2: Dịch chiết tổng số có chất cảm ứng IPTG Đường chạy 3: Dịch rửa khi qua cột tinh sạch

Đường chạy 4: Phân đoạn protein tinh sạch Đường chạy 5: Thang chuẩn protein

55

Kết quả kiểm tra các mẫu dịch chiết vi khuẩn bằng điện di SDS-PAGE cho thấy chúng tôi không thu đƣợc băng protein có kích thƣớc mong muốn (~66 kD) trên bản điện di với cả hai mẫu dịch chiết tổng số và mẫu tinh sạch protein. Mô hình điện di của 2 mẫu biểu hiện trong các điều kiện cảm ứng IPTG khác nhau đều cho mô hình điện di giống hệt đối chứng pET28a không chứa đoạn gen P10. Kết quả này chứng tỏ protein tái tổ hợp đã không biểu hiện, hoặc nếu biểu hiện thì ở dƣới ngƣỡng phát hiện của SDS-PAGE.

Nguyên nhân của việc không hình thành protein tái tổ hợp là do protein P10 của SRBSDV chứa nhiều bộ ba mã hiếm, do đó làm giảm hiệu suất biểu hiện trong tế bào E. coli. Những bộ ba hiếm nhƣ GGA, CAA, ATA và TTA sẽ là những trở ngại khi biểu hiện protein tái tổ hợp P10 trong E. coli. Khi muốn biểu hiện một lƣợng lớn protein tái tổ hợp trong E. coli từ một mRNA khác biệt về khả năng mã hóa của vật chủ, lƣợng sản phẩm protein biểu hiện sẽ không nhiều bằng protein khác đƣợc biểu hiện trong cùng một hệ thống do tế bào không đủ một hoặc một số tRNA nhất định. Việc thiếu tRNA này có thể làm dừng quá trình dịch mã giữa chừng hoặc làm lệch khung đọc dẫn đến thay đổi trình tự axit amin của protein. Để khắc phục đƣợc sự khác biệt này chúng tôi đã tối ƣu hóa các điều kiện biểu hiện bằng cách hạ nhiệt độ nuôi cấy khi cảm ứng xuống 16oC, tăng thời gian cảm ứng, thay đổi pH của môi trƣờng nuôi cấy, hoặc giảm nồng độ chất cảm ứng… Từ các phân tích trên, chúng tôi đã tiến hành thiết kế thí nghiệm để tìm ra điều kiện tối ƣu biểu hiện protein P10. Các công thức thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 10.

Bảng 10: Các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp Công thức Điều kiện biểu hiện

CT1 Cảm ứng ở 16h, 37oC, 1 mM IPTG CT2 Cảm ứng ở 16h, 28oC, 1 mM IPTG CT3 Cảm ứng ở 16h, 16oC, 1mM IPTG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Sau quá trình biểu hiện ở các khoảng thời gian và nhiệt độ khác nhau, chúng tôi tiến hành siêu âm phá màng tế bào thu dịch chiết và xác tế bào. Để xác định sự

56

có mặt của protein P10 chúng tôi tiến hành đồng thời hai phƣơng pháp điện di SDS- PAGE và phƣơng pháp lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể nhận biết đặc hiệu đuôi His-tag của protein tái tổ hợp dung hợp.

Kết quả trên hình 19 cho thấy chúng tôi đã biểu hiện thành công protein P10 ở các nhiệt độ nuôi cấy biểu hiện thấp 28o và 16oC. Kết quả lai thẩm tách miễn dịch cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc băng protein có kích thƣớc 66 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc tính toán lý thuyết của protein P10 (hình 19B). Kết quả này cũng cho thấy protein P10 biểu hiện mạnh nhất ở điều kiện nuôi cấy 16oC trong 16h, với 1