Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp P10

3.2.2.1. Biến nạp pET28a/P10 vào vi khuẩn E. coli

Hệ vector biểu hiện pET28a có mang trình tự của promoter T7 có khả năng điều khiển biểu hiện của gen đích, tuy nhiên promoter này cũng gây độc cho chính tế bào vật chủ. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chủng tế bào vi khuẩn

E.coli Rosetta là m ột chủng vi khuẩn đã đƣ ợc gây đột biến để kháng tính độc của promoter T7 trong vector pET 28a. Ngoài ra, chủng Rosetta đƣợc bổ sung plasmid mang gen mã hoá 7 loại tRNA mang các bộ ba đối mã hiếm gặp ở vi khuẩn nhƣng thƣờng gă ̣p ở sinh vâ ̣t nhân chuẩn, có thể hạn chế tác động của hiện tƣợng thiên vị bộ ba lên biểu hiê ̣n các protein có nguồn gốc tƣ̀ sinh vâ ̣t nhân chuẩn trên E.coli.

53

Plasmid tái tổ hơ ̣p pET28a/P10 đƣơ ̣c chúng tôi biến na ̣p vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng Rosetta theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.4 và cấy trải trên môi trƣờng chọn lọc có bổ sung chất kháng sinh kanamycin (50 g/ml) và chloramphenicol (34

g/ml). Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trƣờng chọn lọc đƣơ ̣c kiểm tra bằng phản ƣ́ng PCR với că ̣p mồi T7-Fw/T7-Rv đă ̣c hiê ̣u cho vector pET28a (hình 17).

A B

Hình 17: Biến nạp vector pET28a/P10 vào vi khuẩn E. coli Rossetta

A: Thể biến nạp vector pET 28a/P10 trên môi trƣờng chọn lọc kanamycin (50

g/ml) và chloramphenicol (34 g/ml).

B: Điện di sản phẩm PCR từ khuẩn lạc với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv

Giếng Mk: Thang chuẩn DNA 1kb

Giếng 1: Sản phẩm PCR từ khuôn là plasmid pET28a/P10 Giếng 2-6: Sản phẩm PCR khuôn là khuẩn lạc 1-5

Giếng 7: Đối chứng âm (khuôn là H2O)

Kết quả điê ̣n di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc trên gel agarose 1% cho thấy 4 phản ứng sử dụng khuôn là các khuẩn lạc số 1, 3, 4 và 5 cho một băng DNA duy nhất có kích thƣớc 2,0 kb (hình 17B, giếng 2, 4, 5 và 6). Kích thƣớc của băng DNA này tƣơng tự với kích thƣớc băng DNA của sản phẩm phản ứng đối chƣ́ng dƣơng sử dụng vector pET28a/P10 làm khuôn (hình 17B, giếng 1). Đối với phản ứng đối chứng âm không sử dụng DNA khuôn (hình 17B, giếng 7) và phản ứng PCR từ khuẩn lạc số 2 (hình 17B, giếng 3), chúng tôi không thu đƣợc băng DNA này. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã thu đƣợc dòng tế bào E. coli chủng Rossetta mang vector tái tổ hợp

54

pET28a/P10. Dòng tế bào này đƣợc bảo quản trong dung dịch glycerol 10% ở -80oC để sử dụng cho thí nghiệm biểu hiện gen sau này.

3.2.2.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện

Sau khi đã biến nạp thành công plasmid pET28a/P10 vào vi khuẩn E. coli

chủng Rossetta chúng tôi tiến hành biểu hiện gen mã hóa protein P10. Theo công bố của Studier (2005), quá trình tự cảm ứng xảy ra khi tế bào sử dụng hết nguồn glucose và chuyển sang sử dụng lactose [17]. Quá trình này xảy ra khi tế bào đạt trạng thái bão hòa, thƣờng là chỉ cần nuôi cấy ở 37oC. Ban đầu chúng tôi nuôi cấy biểu hiện protein P10 ở các điều kiện cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và 0,5 mM ở 370C trong ở 3 h. Sau khi nuôi cấy, dịch khuẩn đƣợc tiến hành ly tâm và siêu âm phá màng tế bào để thu dịch chiết nhƣ đã đƣợc trình bày ở mục 2.2.11. Dịch chiết sau đó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE.

A B

Hình 18: Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện chuẩn

A: Cảm ứng ở 3h, 370C, IPTG 1 mM B: Cảm ứng ở 3h, 370C, IPTG 0,5 mM

Đường chạy 1: Dịch chiết tổng số không có chất cảm ứng IPTG Đường chạy 2: Dịch chiết tổng số có chất cảm ứng IPTG Đường chạy 3: Dịch rửa khi qua cột tinh sạch

Đường chạy 4: Phân đoạn protein tinh sạch Đường chạy 5: Thang chuẩn protein

55

Kết quả kiểm tra các mẫu dịch chiết vi khuẩn bằng điện di SDS-PAGE cho thấy chúng tôi không thu đƣợc băng protein có kích thƣớc mong muốn (~66 kD) trên bản điện di với cả hai mẫu dịch chiết tổng số và mẫu tinh sạch protein. Mô hình điện di của 2 mẫu biểu hiện trong các điều kiện cảm ứng IPTG khác nhau đều cho mô hình điện di giống hệt đối chứng pET28a không chứa đoạn gen P10. Kết quả này chứng tỏ protein tái tổ hợp đã không biểu hiện, hoặc nếu biểu hiện thì ở dƣới ngƣỡng phát hiện của SDS-PAGE.

Nguyên nhân của việc không hình thành protein tái tổ hợp là do protein P10 của SRBSDV chứa nhiều bộ ba mã hiếm, do đó làm giảm hiệu suất biểu hiện trong tế bào E. coli. Những bộ ba hiếm nhƣ GGA, CAA, ATA và TTA sẽ là những trở ngại khi biểu hiện protein tái tổ hợp P10 trong E. coli. Khi muốn biểu hiện một lƣợng lớn protein tái tổ hợp trong E. coli từ một mRNA khác biệt về khả năng mã hóa của vật chủ, lƣợng sản phẩm protein biểu hiện sẽ không nhiều bằng protein khác đƣợc biểu hiện trong cùng một hệ thống do tế bào không đủ một hoặc một số tRNA nhất định. Việc thiếu tRNA này có thể làm dừng quá trình dịch mã giữa chừng hoặc làm lệch khung đọc dẫn đến thay đổi trình tự axit amin của protein. Để khắc phục đƣợc sự khác biệt này chúng tôi đã tối ƣu hóa các điều kiện biểu hiện bằng cách hạ nhiệt độ nuôi cấy khi cảm ứng xuống 16oC, tăng thời gian cảm ứng, thay đổi pH của môi trƣờng nuôi cấy, hoặc giảm nồng độ chất cảm ứng… Từ các phân tích trên, chúng tôi đã tiến hành thiết kế thí nghiệm để tìm ra điều kiện tối ƣu biểu hiện protein P10. Các công thức thí nghiệm đƣợc trình bày trong bảng 10.

Bảng 10: Các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp Công thức Điều kiện biểu hiện

CT1 Cảm ứng ở 16h, 37oC, 1 mM IPTG CT2 Cảm ứng ở 16h, 28oC, 1 mM IPTG CT3 Cảm ứng ở 16h, 16oC, 1mM IPTG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Sau quá trình biểu hiện ở các khoảng thời gian và nhiệt độ khác nhau, chúng tôi tiến hành siêu âm phá màng tế bào thu dịch chiết và xác tế bào. Để xác định sự

56

có mặt của protein P10 chúng tôi tiến hành đồng thời hai phƣơng pháp điện di SDS- PAGE và phƣơng pháp lai thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể nhận biết đặc hiệu đuôi His-tag của protein tái tổ hợp dung hợp.

Kết quả trên hình 19 cho thấy chúng tôi đã biểu hiện thành công protein P10 ở các nhiệt độ nuôi cấy biểu hiện thấp 28o và 16oC. Kết quả lai thẩm tách miễn dịch cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc băng protein có kích thƣớc 66 kDa, tƣơng ứng với kích thƣớc tính toán lý thuyết của protein P10 (hình 19B). Kết quả này cũng cho thấy protein P10 biểu hiện mạnh nhất ở điều kiện nuôi cấy 16oC trong 16h, với 1 mM IPTG cảm ứng. Protein tái tổ hợp biểu hiện ở cả trong dịch tan và xác tế bào (hình 19B, đƣờng chạy 3-6).

A B

Hình 19: Kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện khác nhau về nhiệt độ và thời gian

A: Kết quả điện di SDS-PAGE B: Kết quả lai thẩm tách miễn dịch

Đường chạy 1, 3, 5: Dịch nổi Đường chạy 2, 4, 6: Xác tế bào

Đường chạy 1, 2: Dịch chiết tế bào nuôi cấy theo CT 1 Đường chạy 3, 4: Dịch chiết tế bào nuôi cấy theo CT 2 Đường chạy 5, 6: Dịch chiết tế bào nuôi cấy theo CT 3

Đường chạy 7: Đối chứng âm (dịch chiết vi khuẩn được biến nạp vector pET28a) Đường chạy 8: Thang chuẩn protein

57

Cho tới nay, chƣa có công bố nào cho việc biểu hiện thành công protein tái tổ hợp P10 mã hóa protein vỏ SRBSDV gây bệnh lúa LSĐ. Từ thành công này, chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh sạch protein P10 và gây đáp ứng miễn dịch trên chuột, thu kháng thể trong những kết quả tiếp theo đây.

3.2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp P10

Để có thể sử dụng protein tái tổ hợp cho mục đích gây kháng thể trên chuột, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein đã biểu hiện ở điều kiện tối ƣu trên bằng phƣơng pháp sắc kí ái lực sử dụng cột sắc kí Ni2+

agarose của hãng Invitrogen. Do đoạn gen

P10 đƣợc chèn vào giƣ̃a vi ̣ trí nhâ ̣n biết của BamHI và XhoI trên vector pET28a, do đó khi đƣợc biểu hiện sẽ dung hợp với một trình tƣ̣ gồm 6 axit amin Histidine (His- tag) và một phần trình tự nhận biết và phân cắt của thrombin ở đầu N của chuỗi polypeptide. Trình tự His-tag trong protein dung hợp có ái lực cao với Ni2+ có trong thành phần cột sắc kí Ni2+

agarose. Chính vì vậy, protein tái tổ hợp sẽ đƣợc phân tách khỏi các protein khác có trong dịch chiết tế bào khi đi qua cột sắc kí Ni2+ agarose.

Protein P10 sau khi đã gắn lên cột sắc kí và rƣ̉ a bằng đê ̣m Tris -HCl pH 8,0 có imidazol 30 mM đƣợc chúng tôi tiến hành đẩy phân đoạn bằng đệm Tris-HCl pH 8,0 có imidazol 250 mM. Các phân đoạn tinh sạch sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE 12%.

Hình 20: Điê ̣n di sản phẩm sau tinh sa ̣ch di ̣ch chiết tế bào

Mk : Thang chuẩn protein Đường chạy 1: Dịch chiết tế bào Đường chạy 2: Dịch qua cột

Đường chạy 3,4: Phân đoạn rửa cột Đường chạy 5: Phân đoạn rửa cột cuối

58

Kết quả điê ̣n di protein trên gel SDS -PAGE ở hình 20 cho thấy ở các phân đoa ̣n 3 đến phân đoạn 6 chúng tôi đã thu đƣợc băng protein có kích thƣớc khoảng 66 kDa (hình 20, đƣờng chạy 8 – 11). Kích thƣớc này tƣơng ƣ́ng với kích thƣớc tính toán lý thuyết của protein tái tổ hợp, bao gồm 62 kDa của protein P10 và đoạn protein dung hơ ̣p tƣ̀ vector pET 28a có kích thƣớc 4 kDa. Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định đã t ối ƣu biểu hiê ̣n và tinh s ạch thành công protein tái tổ hợp P10 trong tế bào vi khuẩn E. coli.