3.3.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch
Sản phẩm protein P10 tinh sạch đƣợc chạy điện di trên gel SDS-PAGE, sau đó băng protein 66 kDa đƣợc cắt ra chính xác, nghiền với đệm PBS và tá dƣợc rồi tiêm cho chuột. Protein P10 bản thân nó là kháng nguyên yếu, không đủ gây đáp ứng miễn dịch mạnh, vì vậy phải đƣợc bổ sung tá dƣợc. Khi trộn với kháng nguyên, tá dƣợc sẽ làm kháng nguyên bị phân giải chậm hơn, phóng thích dần dần trong cơ thể, làm tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên. Tá dƣợc toàn phần (Freund’s complete adjuvant) là loại tá dƣợc đƣợc sử dụng phổ biến nhất, thành phần gồm huyền dịch dầu khoáng trong nƣớc và xác vi khuẩn Mycobacteria. Huyền dịch dầu khoáng tạo ra sự lan tỏa định khu và kéo dài của kháng nguyên trong cơ thể gây miễn dịch, xác vi khuẩn Mycobacteria có tác dụng hấp dẫn các tế bào của hệ miễn dịch tới vị trí tiêm để làm tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch. Tá dƣợc toàn phần chỉ dùng cho lần tiêm kháng nguyên đầu tiên, với các mũi tiêm nhắc lại sẽ sử dụng tá dƣợc một phần (có thành phần tƣơng tự nhƣ tá dƣợc toàn phần, nhƣng không có xác vi khuẩn Mycobacteria). Việc gây kháng thể ở chuột đƣợc thực hiện với 3 lần tiêm, trong đó lần tiêm đầu tiên chúng tôi sử dụng tá dƣợc toàn phần, với 2 lần tiêm nhắc lại chúng tôi sử dụng tá dƣợc một phần, khoảng cách giữa các lần tiêm là 1 tuần. Sau mũi tiêm thứ ba 1 tuần chúng tôi lấy máu chuột, ly tâm loại các tế bào máu, thu huyết thanh và tiến hành kiểm tra khả năng nhận mặt đặc hiệu kháng nguyên bằng kháng thể có trong kháng huyết thanh bằng kỹ thuật lai miễn dịch.
59
A B
Hình 21: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của kháng huyết thanh bằng thẩm tách miễn dịch
A: Mẫu kiểm tra huyết thanh chuột trƣớc khi tiêm (1:2000)
B: Mẫu kiểm tra kháng huyết thanh chuột sau khi tiêm 4 tuần (1:2000)
Mk: Thang protein chuẩn
Đường chạy 1, 2: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a (Đối chứng âm) Đường chạy 3, 4: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a/P10
Từ kết quả lai miễn dịch cho thấy kháng thể có trong huyết thanh trƣớc khi gây miễn dịch không có khả năng nhận ra hay phản ứng chéo với protein P10 trong dịch chiết thô cũng nhƣ trong chế phẩm tinh sạch (hình 21A, đƣờng chạy 3 và 4). Kháng thể có mặt trong kháng huyết thanh chuột sau khi gây miễn dịch 4 tuần ở độ pha loãng 2000 lần có khả năng nhận biết đặc hiệu với protein P10 kích thƣớc 66 kDa trong protein dịch chiết tổng số (hình 21B, đƣờng chạy 3 và 4). Kết quả thu đƣợc cho phép kết luận rằng việc gây kháng thể đa dòng kháng protein P10 trên chuột bạch đã thành công.
3.3.2. Tinh sạch kháng thể kháng protein tái tổ hợp P10 bằng sắc ký qua cột protein A-sepharose
Tuy đã thu đƣợc kháng huyết thanh có chứa chủ yếu là kháng thể IgG nhận biết đặc hiệu với protein P10, nhƣng thực tế trong huyết thanh vẫn còn có rất nhiều
60
các protein không mong muốn khác. Vì vậy chúng tôi đã sử dụng hệ thống cột sắc kí ái lực protein A-sepharose để loại các protein không mong muốn, nhằm thu đƣợc kháng thể IgG kháng protein tinh sạch.
Phƣơng pháp này dựa vào khả năng liên kết rất đặc hiệu của protein A (một thành phần của thành tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus) với vùng CH2 của chuỗi nặng kháng thể IgG, chính vì vậy mà chúng tôi dễ dàng loại bỏ đƣợc các protein không phải là IgG (không có khả năng gắn đặc hiệu) khỏi kháng huyết thanh.
Cột protein A-sepharose (1 x 2 cm) đƣợc cân bằng với đệm Tris-HCl 100 mM, pH 8,0. Dung dịch huyết thanh sau khi chuẩn về pH 8,0 đƣợc cho lên cột với tốc độ 20 ml/giờ. Dịch qua cột đƣợc cho lên cột lặp lại 3 - 5 lần để tăng khả năng bám cột của kháng thể. Sau khi rửa cột bằng đệm Tris-HCl 100 mM và 10 mM để loại các protein gắn không đặc hiệu, chúng tôi tiến hành rửa chiết kháng thể IgG (đã gắn đặc hiệu với gel) bằng đệm glycine 100 mM, pH 3,0. Các phân đoạn đẩy ra nhanh chóng đƣợc trung hòa về pH 8,0 bằng cách bổ sung 1/10 thể tích đệm Tris- HCl 1 M, pH 8,0 nhằm tránh cho kháng thể bị mất hoạt tính.
Các phân đoạn thu đƣợc qua cột protein A–sepharose đƣợc chúng tôi xác định protein bằng phƣơng pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 280nm (A280). Kết quả đƣợc trình bày ở hình 22.
Hình 22: Sắc kí huyết thanh chuột sau khi gây miễn dịch qua cột protein A- sepharose
61
Qua kết quả đo A280 của các phân đoạn sắc kí cho thấy ở các phân đoạn rửa cột cũng có chứa protein (protein không hấp phụ) nhƣng với một lƣợng nhỏ, trong khi đó phần protein hấp thụ (kháng thể IgG) khi đƣợc đẩy ra có lƣợng rất lớn, cho một đỉnh protein rất rõ rệt.
Để khẳng định độ tinh sạch của kháng thể thu đƣợc, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra phân đoạn phân đoạn protein gắn đặc hiệu thu đƣợc từ cột protein A- sepharose bằng SDS-PAGE. Kết quả thu đƣợc trên hình 23 cho thấy xuất hiện 2 băng protein có kích thƣớc khoảng 25 và 53 kDa (hình 23, giếng 1), tƣơng ứng với kích thƣớc của chuỗi nặng (53kDa) và chuỗi nhẹ (25kDa) của kháng thể IgG. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã tinh sạch thành công kháng thể IgG từ huyết thanh chuột bằng cột sắc kí ái lực protein A- sepharose.
Hình 23: Điện di SDS- PAGE kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể
Mk: Thang chuẩn protein
Đường chạy 1: Phân đoạn E9 tinh sạch kháng thể
Sau khi đã có đƣợc kháng thể IgG tinh sạch, để một lần nữa khẳng định đây đúng là kháng thể kháng protein P10, chúng tôi tiếp tục sử dụng kĩ thuật thẩm tách miễn dịch.
62
Hình 24: Kết quả phân tích Western blotting sử dụng kháng thể tinh sạch (1:2000)
Mk: Thang chuẩn Protein
Đường chạy 1: Protein P10 tinh sạch
Đường chạy 2: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a (Đối chứng âm) Đường chạy 3: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a/P10
Kết quả thu đƣợc cho thấy kháng thể tinh sạch có khả năng nhận biết đặc hiệu mẫu protein P10 đã tinh sạch cũng nhƣ protein P10 trong dịch chiết tổng số của tế bào E. coli (hình 24, đƣờng chạy 1 và 3) thông qua phƣơng pháp Western Blot. Hiện nay, mới chỉ có một công bố theo nghiên cứu của Zhenchao Wang và cộng sự (2012) [36] là đã sản xuất thành công kháng thể nhằm phát hiện virus SRBSDV bằng phƣơng pháp tổng hợp 3 đoạn polypeptide đƣợc thiết kế dựa trên trình tự của protein P10, sau đó gây đáp ứng miễn dịch và thu kháng thể. Ngƣợc lại, trong nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng toàn bộ đoạn gen mã hóa protein gai vỏ của virus SRBSDV chèn vào vector biểu hiện thích hợp và biểu hiện thành công protein P10, thu đƣợc kháng thể tinh sạch với khả năng nhận biết đặc hiệu cao với protein P10 tinh sạch. Sau khi tạo và tinh sạch thành công kháng thể IgG kháng protein gai vỏ P10, chúng tôi tiếp tục tiến hành các thí nghiệm kiểm tra độ nhạy cũng nhƣ độ đặc hiệu đối với kháng thể thu đƣợc trong các kết quả tiếp theo.
63
3.4. PHÁT HIỆN VIRUS SRBSDV BẰNG KHÁNG THỂ TINH SẠCH 3.4.1. Đánh giá độ nhạy của kháng thể 3.4.1. Đánh giá độ nhạy của kháng thể
Kháng thể tinh sạch đƣợc đem đánh giá độ nhạy với các dải nồng độ pha loãng khác nhau. Chúng tôi tiến hành pha loãng kháng thể tinh sạch ở các nồng độ: 1:1000, 1:2000, 1:3000; 1:4000; 1:5000; 1:6000 và tiến hành thực hiện phản ứng Dotblot. Thí nghiệm đƣợc thực hiện với mẫu protein tái tổ hợp P10 tinh sạch (10 ng) từ vi khuẩn E. coli.
Hình 25: Kết quả thử độ nhạy của kháng thể tinh sạch
1: Kháng huyết thanh kháng P10 2: Kháng thể tinh sạch kháng P10
Kết quả Dot-blot trên hình 25 cho thấy ở nồng độ pha loãng 1:6000, kháng thể tinh sạch của chúng tôi vẫn có thể nhận biết đƣợc sự có mặt của protein P10. Đối với kháng huyết thanh chƣa tinh sạch, ở nồng độ pha loãng 1:3000, chúng tôi đã không phát hiện đƣợc sự có mặt của protein P10 trong mẫu thử. Kết quả này chứng tỏ kháng thể IgG sau khi đƣợc tinh sạch có độ nhạy cao hơn so với mẫu
64
kháng huyết thanh ban đầu, đạt hiệu giá 1:6000, đủ đáp ứng yêu cầu phục vụ cho nghiên cứu chẩn đoán virus SRBSDV bằng kĩ thuật ELISA.
3.4.2. Phát hiện SRBSDV bằng kĩ thuật ELISA
Để đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch thu đƣợc, chúng tôi tiến hành xét nghiệm các mẫu lúa nhiễm virus SRBSDV và virus RRSV (Rice ragged stunt virus - gây bệnh lùn xoắn lá) bằng kĩ thuật ELISA. Mẫu dịch chiết protein lúa bệnh đƣợc pha loãng ở các nồng độ từ 1:1 đến 1:50, sử dụng kháng thể tinh sạch pha loãng ở nồng độ 1:5000. Kết quả thu đƣợc trên hình 26 và bảng 11 cho thấy kháng thể tinh sạch phản ứng đặc hiệu với mẫu lúa bệnh SRBSDV (hình 26, bảng 11, cột 7 và 8), cho chỉ số đọc cao hơn so với mẫu chuẩn là protein P10 tái tổ hợp (hình 26, bảng 11, cột 1 và 2). Ngƣợc lại, với mẫu đối chứng âm sử dụng dịch chiết tế bào vi khuẩn mang vector pET28a trống hay các mẫu lúa khỏe và mẫu lúa nhiễm RRSV, phản ứng màu có chỉ số đọc thấp hơn so với mẫu chuẩn. Kết quả này chứng tỏ, kháng thể thu đƣợc có khả năng nhận biết đặc hiệu sự có mặt của protein P10 trong các mẫu lúa nhiễm SRBSDV.
Hình 26: Thử độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch (1:5000)
Cột 1, 2: Mẫu chuẩn dương (protein P10 tái tổ hợp tinh sạch)
Cột 3, 4: Mẫu chuẩn âm (dịch chiết vi khuẩn mang vector pET28a trống) Cột 5, 6: Dịch chiết protein của lúa sạch bệnh
Cột 7, 8: Dịch chiết protein của lúa nhiễm bệnh SRBSDV
Giếng 9, 10: Dịch chiết protein của lúa nhiễm bệnh lùn xoắn lá (RRSV) Hàng A F: Mẫu dịch chiết pha loãng tương ứng ở các tỉ lệ 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:20; 1:50
65
Bảng 11: Kết quả đo OD492 thử độ đặc hiệu của kháng thể bằng phản ứng ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 0,260 0,250 0,105 0,106 0,135 0,172 0,988 1,087 0,171 0,161 B 0,245 0,222 0,109 0,166 0,224 0,264 0,886 0,659 0,164 0,181 C 0,237 0,228 0,109 0,136 0,129 0,188 0,391 0,300 0,098 0,115 D 0,170 0,169 0,102 0,098 0,130 0,134 0,105 0,140 0,096 0,091 E 0,158 0,126 0,097 0,108 0,101 0,102 0,086 0,097 0,090 0,094 F 0,211 0,213 0,152 0,179 0,122 0,096 0,082 0,100 0,114 0,105 Ngoài ra, để xác định khả phát hiện sớm sự có mặt của virus bằng kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đã tinh sạch, chúng tôi tiến hành xét nghiệm trên các mẫu rầy đã nhiễm SRBSDV (bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo) và mẫu rầy không có virus. Trong thí nghiệm này chúng tôi trộn lẫn rầy nhiễm virus với rầy không nhiễm virus theo tỉ lệ “Số rầy bệnh : Số rầy khỏe” lần lƣợt là 5:0, 4:1, 3:2, 2:3, 1:4 và 0:5 để tạo thành các tổ hợp mẫu xét nghiệm khác nhau. Kết quả xét nghiệm trên bảng 12 cho thấy các mẫu có tỉ lệ rầy nhiễm virus cao hơn 50% có chỉ số OD cao hơn rõ rệt so với mẫu đối chứng. Kết quả này chứng tỏ kháng thể của chúng tôi hoàn toàn có thể phát hiện đƣợc sự có mặt của virus gây bệnh LSĐ trong những mẫu rầy thu thập trên đồng ruộng.
Bảng 12: Kết quả đo OD492 của phản ứng ELISA xét nghiệm SRBSDV trong mẫu rầy Lần xét nghiệm OD492 5B 4B:1K 3B:2K 2B:3K 1B:4K 5K ĐC Lần 1 0,348 0,339 0,279 0,174 0,149 0,132 0,107 Lần 2 0,298 0,278 0,204 0,176 0,165 0,159 0,111 Trung bình 0,323 0,3085 0,2415 0,175 0,157 0,1455 0,109
66
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Từ những kết quả trong quá trình nghiên cứu nhƣ đã trình bày ở trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
- Đã phân lập, nhân dòng và giải trình tự đoạn gen P10 mã hóa protein vỏ của SRBSDV (Southern rice black strike dwarf virus) gây bệnh lúa lùn sọc đen ở Việt Nam. Đoạn gen P10 phân lập đƣợc gồm 1.674 nucleotide, có hàm lƣợng GC 35,6%, mã hoá một chu ỗi polypeptide dài 557 axit amin và có độ tƣơng đồng đạt 99% so với trình tự đã đăng ký trên Ngân hàng Gen Thế giới (mã số JF803471.1).
- Đã thiết kế thành công vector biểu hiê ̣n pET28a mang trình tự mã hóa protein vỏ P10 và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp P10 trong tế bào vi khu ẩn E. coli
chủng Rossetta ở điều kiện nuôi cấy 16oC trong 16h, cảm ứng bằng IPTG 1,0 mM. Protein tái tổ hợp P10 đƣợc tinh sạch bằng cột sắc ký Ni2+
agarose. Sản phẩm protein tinh sạch có độ tinh khiết cao.
- Đã gây kháng thể kháng protein tái tổ hợp P10 thành công trên chuột bạch. Trên gel điện di polyacrylamide có SDS, kháng thể tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực protein A-sepharose cho 2 băng protein có khối lƣợng 25 và 53 kDa, tƣơng ứng với khối lƣợng của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ kháng thể IgG. Kháng thể thu đƣợc có hiệu giá cao (1:6000), có thể nhận diện đặc hiệu sự có mặt của SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh LSĐ trong phƣơng pháp xét nghiệm bằng ELISA và trong mẫu rầy.
KIẾN NGHỊ
Với các kết quả đã thu đƣợc , chúng tôi đề ra một số hƣớng nghiên cứu tiếp theo nhƣ sau:
Hoàn thiện quy trình tinh sạch kháng thể từ kháng huyết thanh chuột để thu đƣợc kháng thể có độ tinh sạch cao hơn.
Đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch với nhiều mẫu lúa bệnh virus khác nhau nhằm nâng cao chất lƣợng và độ tin cậy của kháng thể thu đƣợc phục vụ chẩn đoán sớm bệnh virus SRBSDV.
Xây dƣ̣ng bô ̣ kit chuẩn đoán nhanh virus SRBSDV dƣ̣a trên phƣơng pháp ELISA, sử dụng kháng thể kháng đặc hiệu proteinP10.
67
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Lê Bền (2009), “Bắt bệnh” lúa lùn: Chƣa ngã ngũ nguyên nhân”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 24/9/2009.
2. Bộ NN & PTNT (2009), Công điê ̣n (Số 31/CĐ-BNN-BVTV) v/v Cảnh giác đối với bê ̣nh vàng lùn , lùn xoắn lá trên lúa bộc phát lần đầu tiên ở phía Bắc để phát hiê ̣n, phòng trừ kịp thời.
3. Hà Viết Cƣờng, Nguyễn Viết Hải, Vũ Triệu Mân (2009), "Xác định nguyên nhân lúa lùn sọc đen (lùn lụi) trên lúa mùa năm 2009 tại miền Bắc", Tạp chí BVTV, 6, tr. 24-31.
4. Nguyễn Đình Hƣơng (2009), “Nghệ An: Ra quân tiêu diệt nguồn bệnh dịch “lùn lụi” lúa”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 14/9/2009.
5. Sao Mai (2009), “Chuyện khẩn cấp ở Nghệ An: Trên 5.500 ha lúa HT bị VL – LXL”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 7/9/2009.
6. Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương , Trƣờ ng Đa ̣i ho ̣c Nông nghiê ̣p I, Hà Nội.
7. Vũ Triệu Mân (2010), Bê ̣nh virus hại thực vật ở Viê ̣t Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nô ̣i.
8. Đinh Văn Thành, Nguyễn Thị Dƣơng, Lại Tiến Dũng, Phan Thị Bích Thu (2008), "Một số kết quả nghiên cứu về sinh thái rầy lƣng trắng ở phía Bắc Việt Nam", Hội nghị côn trùng toàn quốc Việt Nam lần thứ 6, Hà Nội, 9-10/5/2008, 281-287.
9. Ngô Vĩnh Viễn, Phạm Thị Vƣợng, Nguyễn Nhƣ Cƣờng, Tạ Hoàng Anh, Nguyễn Thị Me, Phan Bích Thu, Phạm Hồng Hiển, Hà Viết Cƣờng (2009), "Kết quả chẩn đoán bệnh virus lúa lùn sọc đen ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam", Tạp chí BVTV, 6, tr. 8-18.
68
Tài liệu tiếng Anh
10. Amero S. A., James T. C. and Elgin C. R. (1994), "Production of antibodies using protein in gel bands" In: Basic Protein and Peptide Protocols Vol.32 (Humana Press, editor), Springer, pp. 717-720.
11. Caspal D. L., Klug A. (1962), "Physical principles in the construction of regular viruses", Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 27, pp. 1-24.
12. Cuong H. V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J. L. (2008), "Design DNA application of two novel degenerate primer pairs for the detection DNA complete genomic characterization of potyvirus", Arch. Virol., 153, pp. 25-36.
13. Cuong H. V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J. L. (2008), “Molecular characterization of begomovirus DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminivirus were present in the Old World prior to continental separation”, J. Gener. Virol., 89, pp. 312-326.
14. Dodds J. A., Morris T. J., Jordan R. L. (1984), "Plant viral double-stranded