Nhƣ đã nói ở trên, kháng thể có tính đặc hiệu rất cao với kháng nguyên tƣơng ứng của nó. Kháng thể có khả năng nhận ra một phân tử protein kháng nguyên trong hơn 108 phân tử protein tƣơng tự nhau. Lợi dụng đặc điểm này, ngƣời ta sử dụng kháng thể đa dòng vào rất nhiều mục đích khác nhau:
1.5.2.1. Sắc kí ái lực
Một kháng nguyên có thể tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực đƣợc chế tạo bằng chính kháng thể kháng kháng nguyên ấy. Kháng thể đƣợc gắn vào giá thể (gel) và nhồi lên cột, sau đó cho hỗn dịch có chứa kháng nguyên chảy qua cột. Kháng nguyên sẽ liên kết một cách đặc hiệu với kháng thể trong khi tất cả các thành phần khác bị đẩy ra. Cuối cùng kháng nguyên sẽ đƣợc thu lại bằng cách sử dụng đệm đẩy có pH 2,5 hoặc >11. ở giá trị pH này, liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể bị phá vỡ. Bằng phƣơng pháp này cũng có thể tinh sạch đƣợc kháng thể từ kháng huyết thanh với cột sắc kí sử dụng kháng nguyên gắn trên giá thể [15].
1.5.2.2. Kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) và hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)
Cả hai kĩ thuật đều có chung một nguyên tắc là dựa trên liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tuy nhiên cách phát hiện liên kết là khác nhau. Kĩ thuật ELISA sử dụng một enzyme gắn với kháng thể, sau khi kháng thể liên kết với kháng nguyên, liên kết này sẽ đƣợc phát hiện bằng cơ chất đặc hiệu của enzyme, có khả năng hiện màu khi tiếp xúc với enzyme. Trong khi đó, kĩ thuật RIA sử dụng phƣơng pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ để phát hiện ra liên kết kháng nguyên - kháng thể. Có nhiều cách đánh dấu đồng vị phóng xạ, phổ biến là sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp 125I. Do đặc điểm, tính phức tạp cũng nhƣ độ chính xác của hai kĩ thuật khác nhau, nên chúng có những ứng dụng khác nhau. Kĩ thuật RIA thƣờng đƣợc dùng để định lƣợng hormon có trong máu hay dịch mô, trong khi kĩ thuật ELISA thƣờng dùng trong chẩn đoán virus, ví dụ nhƣ HIV. Phƣơng pháp “ELISA
22
bánh kẹp” đƣợc cải tiến từ kĩ thuật ELISA, có thể dùng để phát hiện các sản phẩm tiết, ví dụ nhƣ cytokine.
1.5.2.3. Kĩ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
Kĩ thuật này cũng dựa trên nguyên tắc tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên nhƣ kĩ thuật ELISA, nhƣng có nhiều ƣu điểm hơn. Với những protein - kháng nguyên khó tinh sạch, muốn phát hiện, định lƣợng hay xác định khối lƣợng phân tử…ngƣời ta dùng kĩ thuật thẩm tách miễn dịch. Dịch chiết thô tế bào sau khi xử lí nhiệt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS- PAGE). Các băng protein trên gel đƣợc điện chuyển lên màng lai, sau đó xử lý với kháng thể đặc hiệu protein kháng nguyên quan tâm. Bằng cách sử dụng kháng kháng thể gắn với enzyme có khả năng hiện màu khi có mặt cơ chất, có thể phát hiện cũng nhƣ định lƣợng đƣợc protein quan tâm.
1.5.2.4. Tạo kháng kháng thể (anti- antibody)
Kháng kháng thể đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng kháng thể của một loài nhất định (liên kết đặc hiệu với một kháng nguyên) làm kháng nguyên để gây miễn dịch trên một loài khác. Đặc điểm của kháng kháng thể là có thể liên kết đặc hiệu với tất cả các kháng thể của loài, vì vậy tránh đƣợc việc phải tạo ra nhiều loại kháng thể đánh dấu để phát hiện ra các kháng nguyên tƣơng ứng. Kháng kháng thể có đánh dấu huỳnh quang hiện nay đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong miễn dịch học và nhiều lĩnh vực khác của sinh học nhƣ là một nhân tố thứ cấp cho việc phát hiện kháng thể cần quan tâm, ví dụ nhƣ để xác định các cấu trúc trong tế bào, hay hỗ trợ trong kĩ thuật RIA và ELISA với những kháng thể không thể đánh dấu [15].
Một cải tiến trong việc phát hiện các kháng thể quan tâm là lợi dụng những protein vi khuẩn có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng thể. Một trong số những protein sử dụng phổ biến là protein A, một loại protein vỏ của vi khuẩn Staphylococcus aureus, đƣợc dùng rất nhiều trong tinh sạch kháng thể IgA, IgG... [15].
23
Để chọn lọc một gen từ ngân hàng gen, ngoài các phƣơng pháp lai DNA, RNA, còn có thể sử dụng phƣơng pháp kháng nguyên - kháng thể. Dùng sản phẩm protein của gen để tạo ra kháng thể đặc hiệu, sau đó dùng chính kháng thể này để phát hiện ra tế bào biểu hiện mang vector có chứa cDNA từ ngân hàng gen. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rất phổ biến trong chọn lọc các gen mã hoá protein bề mặt tế bào từ ngân hàng gen [15].
Dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể ngƣời ta cũng có thể xác định đƣợc sản phẩm protein chƣa biết của một gen nhân dòng. Từ trình tự nucleotit đã biết của gen, một đoạn peptit đƣợc tổng hợp và sử dụng để gây miễn dịch, tạo kháng thể đặc hiệu. Kháng thể kháng peptit này sau đó có thể sử dụng để phát hiện các sản phẩm protein của gen, cũng nhƣ có thể tìm hiểu sự phân bố hay chức năng của protein này trong tế bào và mô [15].
Những ứng dụng nêu trên chỉ là một trong số những ứng dụng chính của kháng thể đa dòng, ngoài ra còn rất nhiều các ứng dụng khác trong y học cũng nhƣ trong nghiên cứu sinh học. Mỗi phƣơng pháp, kĩ thuật có những ƣu, nhƣợc điểm riêng nhƣng đều có chung một nguyên tắc là dựa trên tính liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể.
24
CHƢƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Vật liệu thí nghiệm
cDNA của phân đoa ̣n S 10 đƣợc nhân bản tƣ̀ RNA hệ gen của SRBSDV phân lâ ̣p tƣ̀ mẫu lúa bê ̣nh thu thâ ̣p ta ̣i Sơn La , do bộ môn Bê ̣nh ho ̣c P hân tƣ̉ thực vật, Viê ̣n Di truyền Nông nghiê ̣p (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) cung cấp. Vi khuẩn E.coli chủng DH5α và chủng Rossetta đƣợc cung cấp bởi Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế (New Delhi, Ấn Độ). Chuột nhắt trắng dòng Swiss do Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp.
2.1.2. Hóa chất
Cặp oligonucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng PCR nhân bản đoạn gen P10 đƣợc thiết kế dựa trên trình tự đầy đủ của phân đoạn S10 đã đƣợc nhóm nghiên cứu của Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) phân lập (bảng 1).
Bảng 1: Trình tự các cặp oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự mồi
S10-ORF-Fw 5'-AGAGGATCCATGGCTGACATAAGACTTG-3'
S10-ORF-Rv 5'-TCTCTCGAGTCATCTGGTGACTTTATTTAACAC-3'
SP6-Rv 5'-ATTTAGGTGACACTATAGATAC-3'
T7-Fw 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
T7-Rv 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
Bộ kit tinh sạch plasmid GenJETTM Plasmid Miniprep, kit tinh sạch DNA từ gel agarose GenJETTM Gel Extraction, dNTPs, Taq DNA polymerase, thang DNA chuẩn 1kb đƣợc cung cấp bởi hãng Fermentas (Đức); bộ kit nhân dòng sản phẩm
25 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PCR pGEMT Easy Vector System I củ a hãng Promega ; gel Ni-NTA dùng cho thí nghiệm tinh sạch protein đƣợc đặt mua từ hãng Invitrogen. Cột sắc ký ái lực protein-A của hãng Pierce. Thang chuẩn protein Bench mark prestain, Novex sharp unstain của hãng Invitrogen. Các hóa chất cơ bản khác sử dụng cho sinh học phân tử đƣợc mua của công ty Sigma và Merk (Mỹ) đều đạt độ tinh khiết cần thiết dùng cho sinh học phân tử.
2.1.3. Thiết bị
Máy PCR 9700 của hãng Applied Biosystem, hệ thống điện di agarose, hệ thống điện di polyacrylamide của hãng Biorad. Máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus. Máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc Kary Mullis cùng cộng sự (1986) [25] và đƣợc tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất enzyme DNA polymerase bền nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số loài vi khuẩn khác. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng tổng hợp DNA in-vitro của DNA polymerase trong môi trƣờng thích hợp có dƣ các dNTPs và cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng nhiều triệu lần so với ban đầu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ đều có ba giai đoạn cơ bản:
+ Giai đoạn biến tính (Denaturing): Tách DNA mạch kép thành dạng mạch đơn ở nhiệt độ cao (94-95°C) trong thời gian ngắn.
+ Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung bằng cách hạ nhiệt độ xuống trong khoảng 30-65°C.
+ Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extending): Nhờ hoạt tính của enzyme DNA polymerase các dNTP đƣợc lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với
26
mạch DNA khuôn bắt đầu từ đoạn mồi. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ 68-72°C. Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào kích thƣớc đoạn gen cần nhân bản.
Phản ứng kết thúc sau khi ủ ở 72ºC trong vòng 10 phút và giữ sản phẩm ở 4ºC cho đến phân tích. Sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và nhuộm DNA bằng EtBr.
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý: Các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trƣờng trung tính và kiềm, dƣới tác dụng của điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng. Mức độ di chuyển của các phân tử DNA qua hệ thống các lỗ ma ̣ng lƣới của gel agarose dƣới tác du ̣ng của đi ện trƣờng phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc (hay khối lƣợng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thƣớc nhỏ sẽ di chuyển nhanh còn phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng thang chuẩn DNA với kích thƣớc đã biết có thể dễ dàng xác định đƣợc kích thƣớc tƣơng đối của DNA mẫu.
Tiến hành: 1g agarose đƣợc đun nóng để hòa tan trong 100 ml đệm TBE, sau đó đƣa về 65°C và đổ vào khuôn đúc gel. Gel agarose 1% sau khi đƣợc chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 l mẫu DNA đƣợc trộn với 1 l đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene cyanol. Bản gel đƣợc chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Gel đƣợc lấy ra nhuộm bằng cách ngâm trong EtBr ở nồng độ 50 g/l và rƣ̉a bằng nƣớc . Cuối cùng, soi gel dƣới ánh sáng tử ngoại của
máy soi gel, các băng DNA gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền tối.
2.2.3. Ghép nối DNA bằng enzyme DNA ligase
Nguyên tắc: Phản ứng ghép nối DNA đƣợc thực hiện dựa trên khả năng xúc tác của enzyme DNA ligase khi có mặt ATP cho phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH và đầu 5’-PO4 của 2 chuỗi DNA. DNA ligase sử dụng năng lƣợng giải phóng ra từ quá trình adenyl hóa đầu 5’-PO4 của chuỗi DNA thứ nhất (liên kết với AMP, giải phóng pyrophosphate) để hình thành liên kết
27
phosphodiester với đầu 3’-OH của chuỗi DNA thứ hai. Enzyme T4 DNA ligase có thể ghép nối DNA ở cả hai trƣờng hợp có đầu dính hoặc có đầu bằng.
Tiến hành: Phản ứng ghé p nối hai đo ạn DNA đƣợc thực hiện bằng enzyme T4 ligase củ a hãng Invitrogen với thành phần nhƣ trong bảng 2. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 16oC qua đêm, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến.
Bảng 2: Thành phần phản ứng ghép nối
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Đê ̣m T4 DNA Ligase 5X 2,0
Đoạn DNA I 3,0
Đoạn DNA II 3,0
Enzyme T4 DNA Ligase (5 U/μl) 0,2 H2O cất khƣ̉ ion vô trùng 1,8
Tổng thể tích 10
2.2.4. Biến nạp vi khuẩn E. coli
Tế bào khả biến E. coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) đƣợc làm tan trên đá trong 10 phút. Tiếp đó, DNA plasmid đƣợc bổ sung vào dung dịch tế bào đã rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào. Tế bào đƣợc sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó đƣợc chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút. Tiếp theo, 450 µl LB lỏng đƣợc bổ sung vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 20 phút trƣớc khi đƣợc nuôi lắc với tốc độ 220 vòng/phút trong thời gian 30 phút. Hỗn hợp tế bào biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa môi trƣờng LB đặc có bổ sung chất kháng sinh thích hợp và ủ ở 37°C qua đêm [26]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.5. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn
DNA tái tổ hợp đƣợc tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E. coli bằng bộ kit GenJET™ Plasmid Miniprep (Fermentas). Một khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc nuôi lắc trong 5 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc
28
độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm. Tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4°C. Tế bào đƣợc hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNase A. 250 µl đệm P2 (Lysis solution) đƣợc bổ sung vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp đƣợc trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (Neutralization solution), đảo đều 4-6 lần. Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C. Dịch nổi sau khi ly tâm đƣợc đƣa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Plasmid đƣợc giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột đƣợc gạn bỏ. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣợc bổ sung và ly tâm 30-60 giây, sau đó gạn bỏ dịch qua cột. Bƣớc này đƣợc lặp lại một lần nữa. Cột tinh sạch chứa plasmid đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) đƣợc bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Plasmid đƣợc thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1 phút. Mẫu plasmid tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C.
2.2.6. Tinh sạch DNA từ gel agarose
Bộ kit GenJET Gel Extraction đƣợc thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn. Bộ kit sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thƣớc từ 25 bp đến 20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb. Quy trình đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành: Băng DNA quan tâm đƣợc cắt chính xác bằng lƣỡi dao sạch từ gel agarose và đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml. Đệm bám (binding buffer) đƣơ ̣c bổ sung vào với 1 thể tích bằng khối lƣợng miếng gel (1 µl : 1 mg) và ủ ở 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn. Dung dịch gel agarose đã hòa tan đƣợc chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ. 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đƣơ ̣c bổ sung vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc 10000 vòng/phút. Phần dịch đi qua màng đƣợc gạn bỏ. Lặp
29
lại bƣớc này một lần nữa. Cột tinh sạch có chứa DNA đƣợc chuyển sang ống eppendorf 1,5 mới và bổ sung 100 µl Elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột. Ly tâm 1 phút với tốc độ 10000 vòng/phút để thu DNA . Mẫu DNA tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20°C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7. Nhân dòng sản phẩm PCR
Đoạn gen P10 đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq DNA polymerase. Do vậy, sản phẩm PCR thu đƣợc là các đoạn DNA kích thƣớc 1,7 kb có đầu dính Adenin. Các đoạn DNA này dễ dàng ghép nối vào vector pGEMT có đầu dính Thymin nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase. Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT đƣợc thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit của hãng Promega với các thành phần nhƣ trong bảng 3. Hỗn hợp phản ứng gắn đƣợc ủ