Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn e coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Văn Phòng PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ ĐÔNG MÁU IX CỦA NGƢỜI Ở VI KHUẨN E COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Văn Phòng PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ ĐÔNG MÁU IX CỦA NGƢỜI Ở VI KHUẨN E COLI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NÔNG VĂN HẢI Hà Nội - 2012 CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicilin Ampicilin APS Amonium Persulphate Amonium Persulphate bp Base pair Cặp base cDNA Compelementary DNA ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Axít Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium Bromide Ethidium Bromide EtOH Ethanol Ethanol IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside Isopropyl-thio-β-D-galactoside Kb Kilo base 1000 cặp base (1000 bp) kD Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria Bertani Môi trường mRNA Messenger RNA RNA thông tin PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng nhân DNA DNA tạo khuôn mRNA enzyme phiên mã ngược pJET Vector pJET1.2/blunt Vector pJET1.2/blunt RNA Ribonucleic acid Axít Ribonucleic RNase Ribonuclease Ezyme Ribonuclease rRNA Ribosomal Ribonucleic acid ribosome RNA Reverse Transcriptase- Polymerase Kỹ thuật PCR enzyme phiên mã Chain Reaction ngược SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate SDSPAGE Sodium Dodecyl Sulphate polyacrylamide gel sulfate Điện di biến tính gel polyacrylamide TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA TEMED N, N, N’, N’-Tetramethyl Ethylendiamine N, N, N’, N’-Tetramethyl Ethylendiamine RT-PCR MỤC LỤC Nội dung Trang MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh Hemophilia 1.1.1 Giới thiệu chung bệnh Hemophilia .3 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Hemophilia 1.1.3 Phân loại Hemophilia 1.1.4 Biểu bệnh Hemophilia 1.1.5 Phương pháp điều trị bệnh Hemophilia 10 1.2 Vai trò yếu tố đông máu IX trình đông máu .11 1.3 Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX 13 1.4 Cấu trúc biến đổi sau dịch mã yếu tố đông máu IX 16 1.4.1 Cấu trúc phân tử protein FIX 16 1.4.2 Những biến đổi sau dịch mã phân tử protein FIX .18 1.5 Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX 22 1.6 Vector biểu pET32a 24 1.7 Chủng biểu E coli BL21(DE3) 26 1.8 Các hệ thống biểu dùng tạo protein tái tổ hợp 29 1.9 Tình hình nghiên cứu nước .30 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Vật liệu .32 2.2 Phương pháp .35 2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 35 2.2.2 Tổng hợp cDNA 36 2.2.3 Nhân đoạn cDNA phản ứng PCR 37 2.2.4 Phương pháp điện di DNA gel agarose 39 2.2.5 Xử lý DNA enzyme hạn chế 40 2.2.6 Tinh chế đoạn DNA gel agarose 41 2.2.7 Ghép nối DNA 42 2.2.8 Biến nạp plasmid vào E coli phương pháp sốc nhiệt .43 2.2.9 Tách chiết DNA plasmid 45 2.2.10 Xác định trình tự DNA 46 2.2.11 Biểu gen mã hóa cho protein FIX 47 2.2.12 Phân tích protein kỹ thuật điện di SDS-PAGE .48 2.3 Sơ đồ thí nghiệm 49 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .52 3.1 Phân lập gen mã hóa yêu tố đông máu IX người 52 3.1.1 Thu thập mẫu mô gan sinh thiết người 52 3.1.2 Tách chiết RNA tổng số 52 3.1.3 Tạo dòng xác định trình tự gen FIX 53 3.2 Thiết kế vector biểu FIX (pET32a/FIXnoSP) .60 3.2.1 Khuếch đại cDNA mã hóa FIXnoSP 62 3.2.2 Ghép nối cDNA mã hóa FIXnoSP vào vector biểu pET32a 63 3.2.3 Kiểm tra có mặt cDNA mã hóa FIXnoSP vector pET32a .64 3.3 Biểu cDNA mã hóa FIXnoSP vi khuẩn E coli BL21(DE3) .68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Bảng Kích thước exon intron gen mã hóa cho yếu tố Trang 14 đông máu IX Bảng Danh sách đối tượng cho mẫu gan sinh thiết 32 Bảng Trình tự cặp mồi sử dụng 33 Bảng Các vector tách dòng biểu 34 Bảng Môi trường nuôi cấy chủng vi sinh vật 35 Bảng Tương quan nộng độ gel agarose kích thước đoạn 39 DNA cần phân tách Bảng Thành phần loại gel sử dụng điện di SDS-PAGE 48 Bảng Danh sách người cho mẫu 52 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hình Tên hình Hình Quá trình đông máu người bình thường người mắc Trang bệnhHemophilia (theo Hiệp hội Hemophilia giới) Hình Tỷ lệ người mắc bệnh Hemophilia Việt Nam so với giới theo đánh giá Hiệp hội Hemophilia quốc tế vào tháng năm 2012 Hình Sự di truyền bệnh Hemophilia trường hợp cha mắc bệnh Mẹ không mang gen gây bệnh Hình Sự di truyền bệnh Hemophilia trường hợp mẹ mang bệnh cha không mắc bệnh Hình Biểu bệnh Hemophilia thể nặng trẻ sơ sinh Hình Biểu đồ thể đông máu 12 Hình Vị trí gen mã hóa yếu tố đông máu IX nhiễm sắc thể 14 X Hình Cấu trúc gen FIX mã hóa cho yếu tố đông máu IX 15 Hình Cấu trúc phân tử mRNA phiên mã từ gen FIX 15 Hình 10 Trình tự amino acid biến đổi sau dịch mã protein 17 FIX Hình 11 Những biến đổi sau dịch mã protein FIX đường 18 chế tiết Hình 12 Phản ứng carboxyl hóa 20 Hình 13 Các đường hoạt hóa yếu FIX 23 Hình 14 Cấu trúc vector biểu pET32a 26 Hình 15 Cơ chế cảm ứng promoter T7 chất cảm ứng IPTG tế 28 bào E coli BL21(DE3) Hình 16 Sơ đồ trình phân lập dòng hóa cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX (FIX) 50 Hình 17 Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu mang cDNA mã hóa 51 FIXnoSP biểu hiệu tế bào vi khuẩn E coli BL21(DE3) Hình 18 Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số gel agarose 1% 52 Hình 19 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân gen cDNA mã hóa FIX 54 gel agarose 0,8% Hình 20 Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp gel agarose 0,8% 56 Hình 21 Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp mang cDNA gen 56 FIX enzyme hạn chế XbaI XhoI Hình 22 So sánh trình tự nucleotide amino acid suy diễn 60 dòng plasmid mang cDNA mã hóa protein FIX người trình tự công bố Hình 23 Sơ đồ vector biểu pET32a/FIXnoSP 61 Hình 24 Ảnh điện di đồ sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa FIXnoSP 63 Hình 25 Ảnh điện đồ sản phẩm PCR vector pET32a sau tinh 63 gel agarose 0,8% Hình 26 Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp gel agarose 0,8% 65 Hình 27 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme hạn 66 chế gel agarose 0,8% Hình 28 Trình tự nucleotide amino acid suy diễn plasmid 67 pET32a/FIXnoSP TVF mang cDNA mã hóa FIXnoSP trình tự công bố NM_000133 Hình 29 Điện di kết biểu protein gel polyacrylamide 12,6% 69 MỞ ĐẦU “Thu hẹp khoảng cách - Kết nối cộng đồng” thông điệp đưa Lễ mít tinh hưởng ứng ngày Hemophilia giới (17/4/) diễn Hà Nội, với mong muốn cải thiện tình hình chăm sóc bệnh nhân bị bệnh Hemophilia (hay gọi bệnh máu khó đông) phạm vi toàn cầu, hướng tới mục tiêu tất người bệnh máu khó đông có hội điều trị chăm sóc tốt Ở Việt Nam, theo thống kê Viện Huyết học Truyền máu Trung ương ước tính có khoảng 6.000 bệnh nhân bị bệnh Hemophilia, 20% bệnh nhân phát chăm sóc thường xuyên Hemophilia rối loạn chảy máu di truyền bất thường gen gây nên, bệnh nhân bị chảy máu khó cầm khắp phận thể, đặc biệt khớp Bệnh xuất thể thiếu hụt đủ yếu tố làm đông máu, thường gặp yếu tố VIII (hemophilia A) IX (hemophilia B) Trên giới, việc nghiên cứu sử dụng thuốc giúp làm máu đông nhanh để điều trị bệnh Hemophilia công nghệ sinh học cuối năm 1980 Cho tới nay, việc áp dụng kỹ thuật đại công nghệ gen protein để phân lập tách dòng cDNA nhằm sản xuất chể phẩm protein tái tổ hợp VIII IX tế bào vi khuẩn tế bào động vật phát triển vượt bậc [59] Người ta sản xuất chế phẩm VIII IX có giá trị điều trị với giá thành hạ, sản lượng tăng, độ tinh cao đáp ứng nhu cầu cấp bách thực tiễn [35] Người bệnh Hemophilia có sống gần người bình thường phát sớm điều trị cách Còn người bệnh để bệnh phát triển hậu chảy máu nhiều lần, gây biến dạng khớp, dẫn đến khó khăn việc lại, trở thành người tàn tật, chí tử vong sớm Ở nước ta, trình điều trị cho người mắc bệnh Hemophilia gặp phải nhiều khó khăn Điều trị phương pháp tiếp máu có khó khăn tốn để có nguồn máu phù hợp cho người bệnh khó Ngoài ra, cách điều trị tiềm Hình 26 Điện di đồ kiểm tra plasmid tái tổ hợp gel agarose 0,8% 1: Đối chứng âm (vector pET32a không mang đoạn DNA ngoại lai); - 6: DNA plasmid dòng vi khuẩn b Kiểm tra plasmid enzyme giới hạn Từ kết điện di sản phẩm DNA plasmid Hình 26, tiến hành lựa chọn dòng vi khuẩn để cắt kiểm tra hai enzyme hạn chế (NcoI XhoI) để kiểm tra kích thước đoạn chèn (Hình 27) Theo tính toán lý thuyết, xử lý pET32a/FIXnoSP cặp enzyme tạo đoạn DNA có kích thước ~ 1,3 kb (kích thước cDNA mã hóa cho FIXnoSP ~ 5,9 kb (kích thước vector pET32a) Kết ảnh điện di Hình 27 cho thấy, đường chạy số 2, xuất băng có kích thước tính toán Từ đó, kết luận thành công việc thiết kế vector biểu pET32a/FIXnoSP 65 Hình 27 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme hạn chế gel agarose 0,8% M: Marker 1kb; 1: Sản phẩm PCR cDNA mã hóa FIXnoSP; - 4: Sản phẩm xử lý pET32a/ FIXnoSP với enzyme NcoI + XhoI; 5: Sản phẩm xử lý pET32a với enzyme NcoI + XhoI c Kiểm tra độ xác trình tự nucleotide đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP vector tái tổ hợp pET32a/FIXnoSP Để chắn ghép nối thành công đoạn cDNA vào vector biểu pET32a, kiểm tra độ xác trình tự nucleotide sau ghép nối vào vector biểu có bị sai lệch hay không trước sử dụng vector tái tổ hợp vào mục đích biểu gen Chúng lựa chọn số ba dòng plasmid tái tổ hợp cắt kiểm tra thành công enzyme trước để tiến hành giải trình tự nucleotide so sánh với trình tự cDNA (GenBank: NM_000133) Sau phân tích trình tự dòng plasmid tái tổ hợp này, đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP có kích thước 1302 bp khung dịch mã xác định yếu tố đông máu IX với chuỗi polypeptide cắt đoạn tín hiệu đầu N tương ứng với 433 amino acid (Hình 28) 66 Hình 28 Trình tự nucleotide amino acid suy diễn plasmid pET32a/FIXnoSP TVF mang cDNA mã hóa FIXnoSP trình tự công bố NM_000133 67 Từ kết thu (Hình 28), khảng định cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX (FIXnoSP) tạo dòng vector biểu pET32a Như kết luận, thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET32a/FIXnoSP mang cDNA mã hóa cho FIXnoSP cấu trúc chọn dòng vi khuẩn E coli DH 5α Cấu trúc biểu tách chiết tinh trước sử dụng làm nguyên liệu cho việc biểu tế bào vi khuẩn E coi BL21(DE3) 3.3 Biểu cDNA mã hóa FIXnoSP vi khuẩn E coli BL21(DE3) Trong nghiên cứu này, sau thu dòng plasmid mang cDNA mã hoá FIXnoSP, để biểu vi khuẩn E coli, tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp (pET32a pET32a/FIXnoSP mang gen mã hoá FIXnoSP)vào tế bào vi khuẩn E coli chủng BL21(DE3) theo phương pháp sốc nhiệt Các chủng vi khuẩn E coli BL21(DE3) chứa tổ hợp gen pET32a/FIXnoSP vector pET32a nuôi cấy môi trường LB đặc Sau đó, chuyển sang môi trường LB lỏng bổ sung Amp đến nồng độ cuối 100 µg/ml Dịch tế bào sau cấy chuyển với tỷ lệ 1%, nuôi lắc 37oC OD600 đạt từ 0,6 – 0,8 cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối 0,5 mM Thu sinh khối tế bào thời điểm 0h, 1h 3h sau cảm ứng Kết thúc thí nghiệm, thu dịch tế bào có chứa protein tái tổ hợp Để kiểm tra kết biểu tiến hành điện di biến tính protein gel polyacrylamide 12,6% có SDS Kết điện di protein tổng số mẫu trình bày Hình 29 Kết biểu protein tái tổ hợp cho thấy, protein tổng số mẫu tế bào phân đoạn không tan thu thời điểm khác sau cảm ứng IPTG (các đường chạy từ - 6), có xuất băng protein có khối lượng phân tử khoảng 67 kDa so với mẫu đối chứng sau cảm ứng IPTG (các đường chạy từ - 3) Như trình bày trên, sản phẩm protein lai FIXnoSPTrx biểu bao gồm trình tự đoạn lai (158 aa) trình tự FIXnoSP (433 aa), tương đương với băng có kích thước khoảng 67 kDa Như protein có 68 trọng lượng phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết trọng lượng phân tử protein FIXnoSP-Trx Hình 29 Điện di kết biểu protein gel polyacrylamide 12,6% M: Marker protein (Fermentas); 1: Protein tổng số đối chứng (pET32a), thời điểm 0h (trước cảm ứng); 2-3: Protein tổng số đối chứng (pET32a), sau 1h 3h cảm ứng IPTG; 4-6: Protein tổng số mẫu tế bào E.coli mang pET32a/FIXnoSP pha không tan sau 0h, 1h 3h cảm ứng IPTG Kết điện di gel acrylamide 12,6% cho thấy protein dung hợp FIXnoSP-Trx biểu tốt nhiệt độ 37oC, 0,5 mM IPTG thời gian nuôi cấy 3h sau cảm ứng (Hình 29) Các kết nhận cho thấy điều kiện sử dụng để biểu protein tái tổ hợp tương đối phù hợp Năm 1987, Lin cộng biểu FIX E coli dạng đoạn cDNA mã hóa FIX 13 đoạn nhỏ khác [44] Các protein tái tổ hợp biểu dạng protein dung hợp với trình tự mã hóa protein vỏ T7 sau codon 326 Tất protein dung hợp biểu thành công dạng thể vùi Trong nghiên cứu này, ứng dụng mô hình nhóm Lin để thiết kế vector mang cDNA mã hóa FIXnoSP Protein tái tổ hợp thiết kế vector pET32a dạng dung hợp với Trx Khác với nhóm Lin, đoạn tín hiệu tiết gồm 28 amino acid cắt khỏi protein FIX tạo nên protein hoàn chỉnh pET32a vector biểu mạnh tế bào chất E coli, tạo lượng lớn FIXnoSP dạng thể vùi (Hình 29), nguồn kháng nguyên để tạo kháng thể phục vụ cho nghiên cứu 69 Hầu hết protein dạng thể vùi không hoạt tính, đặc biệt enzyme, nhiều phương pháp phát triển để đưa protein dạng thể vùi dạng có cấu trúc cấu trúc tự nhiên chúng Quá trình gọi trình tái cấu trúc (refolding), công thức chung áp dụng cho protein Năm 2005, Singh cộng thành công việc biểu gen mã hóa hormone sinh trưởng người (human growth hormone) vi khuẩn E.coli [53] Tuy vậy, protein tái tổ hợp tổng hợp vi khuẩn E coli tồn dạng thể vùi Để thu protein tái tổ hợp dạng có hoạt tính sinh học, nhóm nghiên cứu Singh tiến hành phân lập protein thể vùi ly tâm Tiếp đó, protein thể vùi hòa tan dung dịch đệm biến tính Dạng protein biến tính phải tái cấu trúc xoắn cuộn để khôi phục cấu trúc tự nhiên Kết quả, nhóm nghiên cứu Singh tạo protein tái tổ hợp dạng hòa tan, có hoạt tính sinh học từ dạng thể vùi ban đầu Ở Việt Nam, năm gần có nhiều nghiên cứu biểu gen đối tượng tế bào chủ vi khuẩn E coli, gặp phải vấn đề, protein tái tổ hợp biểu dạng thể vùi Điều vấn đề trở ngại lớn cho hướng nghiên cứu biểu gen vi khuẩn E coli Tuy nhiên, công bố gần Thạc sĩ Lê Thu Ngọc (2009) thành công việc biến đổi từ protein tái tổ hợp dạng thể vùi sau biểu vi khuẩn E coli thành protein dạng hòa tan, có hoạt tính sinh học giống dạng protein tự nhiên [5] Kết có ý nghĩa đóng góp giải khó khăn gặp phải biểu gen vi khuẩn E coli Từ kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu trên, kết biểu gen mã hóa yếu tố đông máu IX người vi khuẩn E coli xem bước tiền đề quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo, để tạo chế phẩm điều trị bệnh Hemophilia Việt Nam tương lai 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu trên, có số kết luận sau:  Từ mô gan sinh thiết người Việt Nam khỏe mạnh, tách RNA tổng số có chất lượng đảm bảo, làm nguyên liệu tổng hợp cDNA mã hóa cho FIX  Đã nhân đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu người (FIX) Đoạn cDNA mã hóa FIX có độ dài tương ứng khoảng 1,4 kb mã hóa 461 amino acid tách dòng giải trình tự  Đã thiết kế vector biểu pET32a/FIXnoSP mang đoạn cDNA mã hóa FIXnoSP biểu gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX E coli Kiến nghị  Tiếp tục nghiên cứu biểu cDNA mã hóa FIXnoSP vector pET32a vi khuẩn E.coli  Nghiên cứu phương pháp biến tính, hồi tính cho protein dung hợp FIXnoSPTrx thể vùi để thu protein FIXnoSP dạng tan Từ đó, nghiên cứu phương pháp tinh protein FIXnoSP để bước tiến tới sản xuất chế phẩm 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng Quốc Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu xác định interleukin-2 người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr 143-148 Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng biểu mini-proinsulin người tái tổ hợp Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr 155-160 Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2005), “Biểu gen interleukin-2 người rh-IL2MM bị đột biến điểm glycosyl hóa gốc cysteine 125 Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 3(2), tr 149-154 Lã Thị Huyền, Nguyễn Phương Hoa, Đặng Thị Thu, Lê Quang Huấn (2009), “Biểu kháng nguyên CD25 tái tổ hợp vi khuẩn E.coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(3), tr 319-324 Lê Thu Ngọc (2009), “Tổng hợp biểu gen mã hóa cho enterocin P vi khuẩn Enterococcus faecium P13 tế bào Escherichia coli ER2566”, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), “Nghiên cứu phát triển sản xuất vaccine ăn thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr 133142 Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Đình Cường, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi (2004), “Tinh chế phân tích khối phổ protein bất hoạt ribosome 72 tái tổ hợp từ mướp đắng (Momordica charantia L.)”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(2), tr 217-226 Nguyễn Đình Cường, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Lương Thị Thu Hường, Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải (2003), “Biểu gen mã hóa protein bất hoạt ribosome mướp đắng vi khuẩn Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(4), tr 451-460 10 Nguyễn Đình Huyên (1998), Sinh học phân tử ADN, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 11 Nguyễn Hải Hà, Nguyễn Văn Phòng, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Huy Hoàng, Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2010), “Biểu yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (h-tPA) người tế bào”, Kỷ yếu hội nghị sinh học phân hóa sinh y học, tr 185-191 12 Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã hóa interleukin-2 người”, Y học Việt Nam 310(5), tr 26-30 13 Nguyễn Thu Thúy, Trần Vân Khánh, Phạm Đăng Khoa, Tạ Thành Văn (2008), “Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa yếu tố đông máu VIII người”, Tạp chí nghiên cứu Y học, tr 7-12 14 Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả ức chế dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro Trichobakin tái tổ hợp”, Y học Việt Nam, 284, tr 26-30 15 Vũ Ngọc Tân, Vũ Minh Đức, Lê Thị Lan Anh, Bùi Khánh Chi, Trương Nam Hải (2009), “Biểu gen mã hóa interleukin-2 người tế bào Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 7(1), tr 35-39 Tài liệu tiếng anh 16 Amphlett G W., Kisiel W., Castellino F J (1981), "The interaction of Ca2+ with human Factor IX", Arch Biochem Biophys, 208(2), pp 576-585 73 17 Anson D S., Choo K H., Rees D J., Giannelli F., Gould K., Huddleston J A., Brownlee G G (1984), "The gene structure of human anti-haemophilic factor IX", EMBO J, 3(5), pp 1053-1060 18 Bajaj S P., Sabharwal A K., Gorka J., Birktoft J J (1992), "Antibody-probed conformational transitions in the protease domain of human factor IX upon calcium binding and zymogen activation: putative high-affinity Ca2+-binding site in the protease domain", Proc Natl Acad Sci U S A, 89(1), pp 152-156 19 Bovill E G., Mann K G (1987), "Warfarin and the biochemistry of the vitamin K dependent proteins", Adv Exp Med Biol, 214, pp 17-46 20 Brandstetter H., Bauer M., Huber R., Lollar P., Bode W (1995), "X-ray structure of clotting factor IXa: active site and module structure related to Xase activity and hemophilia B", Proc Natl Acad Sci U S A, 92(21), pp 9796-9800 21 Bristol J A., Freedman S J., Furie B C., Furie B (1994), "Profactor IX: the propeptide inhibits binding to membrane surfaces and activation by factor XIa", Biochemistry, 33(47), pp 14136-14143 22 Broze G J., Jr., Gailani D (1993), "The role of factor XI in coagulation", Thromb Haemost, 70(1), pp 72-74 23 Chalmers E A (2004), "Haemophilia and the newborn", Blood Rev, 18(2), pp 85-92 24 Chavin S I., Weidner S M (1984), "Blood clotting factor IX Loss of activity after cleavage of sialic acid residues", J Biol Chem, 259(6), pp 3387-3390 25 Chen S H., Yoshitake S., Chance P F., Bray G L., Thompson A R., Scott C R., Kurachi K (1985), "An intragenic deletion of the factor IX gene in a family with hemophilia B", J Clin Invest, 76(6), pp 2161-2164 26 Derian C K., VanDusen W., Przysiecki C T., Walsh P N., Berkner K L., Kaufman R J., Friedman P A (1989), "Inhibitors of 2-ketoglutaratedependent dioxygenases block aspartyl beta-hydroxylation of recombinant 74 human factor IX in several mammalian expression systems", J Biol Chem, 264(12), pp 6615-6618 27 Di Scipio R G., Kurachi K., Davie E W (1978), "Activation of human factor IX (Christmas factor)", J Clin Invest, 61(6), pp 1528-1538 28 Doolittle R F., Feng D F., Johnson M S (1984), "Computer-based characterization of epidermal growth factor precursor", Nature, 307(5951), pp 558-560 29 Fernlund P., Stenflo J (1983), "Beta-hydroxyaspartic acid in vitamin Kdependent proteins", J Biol Chem, 258(20), pp 12509-12512 30 Furie B., Bouchard B A., Furie B C (1999), "Vitamin K-dependent biosynthesis of gamma-carboxyglutamic acid", Blood, 93(6), pp 1798-1808 31 Furie B., Furie B C (1988), "The molecular basis of blood coagulation", Cell, 53(4), pp 505-518 32 Furie B., Furie B C (2005), "Thrombus formation in vivo", J Clin Invest, 115(12), pp 3355-3362 33 Galeffi P., Brownlee G G (1987), "The propeptide region of clotting factor IX is a signal for a vitamin K dependent carboxylase: evidence from protein engineering of amino acid -4", Nucleic Acids Res, 15(22), pp 9505-9513 34 Green P M., Bentley D R., Mibashan R S., Nilsson I M., Giannelli F (1989), "Molecular pathology of haemophilia B", EMBO J, 8(4), pp 1067-1072 35 Hoag H., Gore J., Barry D., Mueller C (1999), "Gene therapy expression vectors based on the clotting Factor IX promoter", Gene Ther, 6(9), pp 1584-1589 36 Hoffman M., Monroe D M., 3rd (2001), "A cell-based model of hemostasis", Thromb Haemost, 85(6), pp 958-965 37 Hoffman M., Monroe D M., Oliver J A., Roberts H R (1995), "Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation", Blood, 86(5), pp 1794-1801 75 38 Kaufman R J (1998), "Post-translational modifications required for coagulation factor secretion and function", Thromb Haemost, 79(6), pp 1068-1079 39 Kurachi K., Davie E W (1982), "Isolation and characterization of a cDNA coding for human factor IX", Proc Natl Acad Sci U S A, 79(21), pp 64616464 40 Laemmli U K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature, 227(5259), pp 680-685 41 LaVallie E R., DiBlasio E A., Kovacic S., Grant K L., Schendel P F., McCoy J M (1993), "A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E coli cytoplasm", Biotechnology (N Y), 11(2), pp 187-193 42 Lawson J H., Mann K G (1991), "Cooperative activation of human factor IX by the human extrinsic pathway of blood coagulation", J Biol Chem, 266(17), pp 11317-11327 43 Lenting P J., Christophe O D., Maat H., Rees D J., Mertens K (1996), "Ca2+ binding to the first epidermal growth factor-like domain of human blood coagulation factor IX promotes enzyme activity and factor VIII light chain binding", J Biol Chem, 271(41), pp 25332-25337 44 Lin S W., Dunn J J., Studier F W., Stafford D W (1987), "Expression of human factor IX and its subfragments in Escherichia coli and generation of antibodies to the subfragments", Biochemistry, 26(17), pp 5267-5274 45 Lindquist P A., Fujikawa K., Davie E W (1978), "Activation of bovine factor IX (Christmas factor) by factor XIa (activated plasma thromboplastin antecedent) and a protease from Russell's viper venom", J Biol Chem, 253(6), pp 1902-1909 46 Mannucci P M., Ruggeri Z M., Pareti F I., Capitanio A (1977), "1-Deamino8-d-arginine vasopressin: a new pharmacological approach to the management of haemophilia and von Willebrands' diseases", Lancet, 1(8017), pp 869-872 76 47 Nemerson Y (1992), "The tissue factor pathway of blood coagulation", Semin Hematol, 29(3), pp 170-176 48 Park C H., Seo J Y., Kim H J., Jang J H., Kim S H "A diagnostic challenge: mild hemophilia B with normal activated partial thromboplastin time", Blood Coagul Fibrinolysis, 21(4), pp 368-371 49 pET system manual of Novagen (2003), 10th Edition Rev.B0403, pp 11-13 50 Presnell S R., Stafford D W (2002), "The vitamin K-dependent carboxylase", Thromb Haemost, 87(6), pp 937-946 51 Sambrook J., Russel W D (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd, ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 52 Siguret V., Amselem S., Vidaud M., Assouline Z., Kerbiriou-Nabias D., Pietu G., Goossens M., Larrieu M J., Bahnak B., Meyer D., et al (1988), "Identification of a CpG mutation in the coagulation factor-IX gene by analysis of amplified DNA sequences", Br J Haematol, 70(4), pp 411-416 53 Singh S M., Panda A K (2005), "Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins", J Biosci Bioeng, 99(4), pp 303-310 54 Sona P.S, Lingam C M (2010) "Hemophilia: An overview", International journal of pharma ceutical review and rechear, 5, pp 18-26 55 Stenina O., Pudota B N., McNally B A., Hommema E L., Berkner K L (2001), "Tethered processivity of the vitamin K-dependent carboxylase: factor IX is efficiently modified in a mechanism which distinguishes Gla's from Glu's and which accounts for comprehensive carboxylation in vivo", Biochemistry, 40(34), pp 10301-10309 56 Studier F W., Moffatt B A (1986), "Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes", J Mol Biol, 189(1), pp 113-130 57 Sunnerhagen M S., Persson E., Dahlqvist I., Drakenberg T., Stenflo J., Mayhew M., Robin M., Handford P., Tilley J W., Campbell I D., et al (1993), "The effect of aspartate hydroxylation on calcium binding to epidermal growth 77 factor-like modules in coagulation factors IX and X", J Biol Chem, 268(31), pp 23339-23344 58 Suttie J W (1980), "Mechanism of action of vitamin K: synthesis of gammacarboxyglutamic acid", CRC Crit Rev Biochem, 8(2), pp 191-223 59 Wang L., Zoppe M., Hackeng T M., Griffin J H., Lee K F., Verma I M (1997), "A factor IX-deficient mouse model for hemophilia B gene therapy", Proc Natl Acad Sci U S A, 94(21), pp 11563-11566 60 Wasley L C., Rehemtulla A., Bristol J A., Kaufman R J (1993), "PACE/furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway", J Biol Chem, 268(12), pp 8458-8465 61 Wojcik E G., Van Den Berg M., Poort S R., Bertina R M (1997), "Modification of the N-terminus of human factor IX by defective propeptide cleavage or acetylation results in a destabilized calcium-induced conformation: effects on phospholipid binding and activation by factor XIa", Biochem J, 323 (3), pp 629-636 62 Wolberg A S., Morris D P., Stafford D W (1997), "Factor IX activation by factor XIa proceeds without release of a free intermediate", Biochemistry, 36(14), pp 4074-4079 63 Yoshitake S., Schach B G., Foster D C., Davie E W., Kurachi K (1985), "Nucleotide sequence of the gene for human factor IX (antihemophilic factor B)", Biochemistry, 24(14), pp 3736-3750 Tài liệu trang Website 64 http://ghr.nlm.nih.gov/gene/F9 65 http://hemoviet.org.vn/detail-disease-c4-i9.html 66 http://hemoviet.org.vn/detail-intro-c4-i22.html 67 http://scholar.lib.vt.edu/theses/available/edt-12212004-143333/unrestricted/chap ter2-Backgroupd.pdf 68 http://www.cdc.gov/ncbddd/hemophilia/diagnosis.html 78 (Accessed June 19, 2012) 69 http://www.daviddarling.info/encyclopedia/H/hemophilia.html (Accessed December 29, 2009) 70.http://www.hemophilia.org/NHFWeb/MainPgs/MainNHF.aspx?menuid=180&c ontentid=45&rptname=bleeding (Accessed December 18, 2009) 71.http://www.hemophilia.org/NHFWeb/MainPgs/MainNHF.aspx?menuid=181&c onentid=46&rptname=bleeding (Accessed December 18, 2009) 72 http://www.umds.ac.uk 73 http://www.wfh.org/index.asp?lang=EN (Accessed March 8, 2012) 74 www.ahcdc.ca/publications.html 79 [...]... khi quá trình đông máu xảy ra trong môi trường thủy phân fibrin cao [22] Nhờ đó, yếu tố đông máu IX đóng một vài trò quan trọng trong cả sự khởi đầu hình thành cục máu và duy trì tính nguyên vẹn của cục máu thông qua sự hoạt hóa yếu tố đông máu X 1.3 Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX Gen FIX là gen mã hóa cho yếu tố đông máu IX (human factor IX, protein FIX), nằm trên cánh tay dài của nhiễm sắc... phần vào vi c chăm sóc sức kh e bệnh nhân Hemophilia trong tương lai Đề tài thực hiện với mục tiêu cụ thể sau: 1 Tách chiết được RNA tổng số từ mô gan sinh thiết của người 2 Phân lập được đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người 3 Thiết kế được vector biểu hiện mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người 4 Chuyển và biểu hiện vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX của người. .. gen marker khác như lacI, ind1, sam7, nin5 Tuy nhiên, các gen marker này sẽ không ảnh hưởng tới sự biểu hiện gen ngoại lai E coli BL21(DE3) là vật chủ có nhiều điểm thuận lợi cho vi c biểu hiện gen của DNA plasmid có mang gen đích được điều khiển bởi promoter T7 Thứ nhất, Trong DNA hệ gen của E coli BL21(DE3) có mang một bản sao của gen mã hóa T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase là một enzyme có tính... 1.4 Cấu trúc và những biến đổi sau dịch mã của yếu tố đông máu IX 1.4.1 Cấu trúc của phân tử protein FIX Ở người, phân tử protein FIX là một protein phụ thuộc vào vitamin K, tham gia vào quá trình đông máu Phân tử protein FIX được tổng hợp ở các tế bào của mô gan dưới dạng một protein tiền chất của một serine protease-FIXa Sau khi được tổng hợp, protein tiền chất này là một chuỗi polypeptide đơn gồm 461... Hình 13) 1.6 Vector biểu hiện pET32a Vector pET32a là một vector thuộc hệ vector pET của hãng Novagen Đây là vector được thiết kế với mục đích để chọn dòng và biểu hiện ở mức độ cao của các gen ngoại lai ở vi khuẩn E coli Vector pET32a (5.900 bp) thường được sử dụng với mục đích chính là biểu hiện gen Ưu điểm quan trọng nhất của vector này nằm ở chỗ, các gen đích ngoại lại được chèn vào vector sẽ được... tới yếu tố đông máu IX được thể hiện bằng màu chữ đỏ Theo Hình 6, yếu tố đông máu X không chỉ được hoạt hóa bằng FIXa mà còn được hoạt hóa bởi chính phức hệ TF-FVIIa Tuy nhiên, TF-FVIIa không thể 12 hoạt hóa đủ yếu tố đông máu X để ngăn cản sự xuất hiện bệnh Hemophilia ở mỗi cá thể khi có sự thiếu hụt yếu tố đông máu VIII hoặc IX [36] Yếu tố đông máu IX lưu thông trong mạch máu như là một zymogen bất... (Hình 7) Gen FIX có kích thước khoảng 34 kb gồm 8 exon và 7 intron [17], [63] Trong đó, trình tự nucleotide mã hóa cho protein FIX chỉ chiếm có 4% tổng số nucleotide của gen và kích thước của exon lớn nhất khoảng 1935 bp (Bảng 1) [63] 13 Hình 7 Vị trí của gen mã hóa yếu tố đông máu IX trên nhiễm sắc thể X [64] Về mặt cấu trúc, exon thứ nhất của gen FIX có chứa trình tự dẫn dầu và tín hiệu cho sự khởi đầu... là một zymogen bất hoạt và phải được chuyển hóa thành dạng enzyme hoạt động (FIXa) Trước khi nó thực hiện chức năng là một chất hoạt hóa yếu tố đông máu X thì yếu tố đông máu IX được hoạt hóa bằng phức hợp TF-FVIIa hoặc bằng FXIa (dạng hoạt hóa của yếu tố đông máu XI) [27] Sự hoạt hóa yếu tố đông máu IX bằng phức hợp TF-FVIIa được kết hợp với sự khởi đầu của quá trình đông máu hoặc xảy ra trên bề mặt... promoter lac, promoter này có ưu điểm là mạnh hơn rất nhiều so với promoter kiểu dại Toàn bộ sự sắp xếp của gen mã hóa T7 RNA polymerase và promoter lacUV5 được nằm trên hệ gen của phage λ, một phiên bản đặc biệt của phage λ mang toàn bộ cấu trúc này được gọi là λDE3 λDE3 được chèn vào nhiễm sắc thể của E coli BL21 để tạo thành chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) Ngoài ra, trên hệ gen của λDE3 còn có các gen. .. yế u tố đông máu IX tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn hay tế bào động vật được thực hiện Do những nhu cầ u cấ p thiế t trong điề u tri ̣bê ̣nh Hemophilia , chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu: Phân lập và biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX của người ở vi khuẩn E coli , nhằm tạo ra một bước tiền đề hướng tới vi c nghiên cứu và phát triển chế phẩm yếu tố đông máu IX tái tổ ... Deoxyribonucleic acid Axít Deoxyribonucleic dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic... thiết người Phân lập đoạn cDNA mã hóa yếu tố đông máu IX từ mô người Thiết kế vector biểu mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông máu IX người Chuyển biểu vector mang đoạn cDNA mã hóa cho yếu tố đông. .. IX đóng vài trò quan trọng khởi đầu hình thành cục máu trì tính nguyên vẹn cục máu thông qua hoạt hóa yếu tố đông máu X 1.3 Cấu trúc gen mã hóa yếu tố đông máu IX Gen FIX gen mã hóa cho yếu tố