Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR

 Cơ sở lý thuyết của PCR

PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA

in vivo trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp DNA kéo dài từ mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả sau khoảng 2-3 giờ, lượng DNA sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần.

 Quy trình kỹ thuật

 Một chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn sau:

 Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép ban đầu tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao (94 – 95oC) trong thời gian ngắn.

 Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ thích hợp (khoảng 50 – 60oC), hai mồi là các oligonucleotide dài từ 15 – 30 nucleotide sẽ bám vào hai đầu của đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.

 Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên

khoảng 70 - 80oC là nhiệt độ thích hợp để Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi,

tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu.

 Thành phần của phản ứng:

 Một mẫu phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 μl gồm có các thành phần sau:

38 Thành phần Thể tích (μl) H2O (15,8 – X) Dung dịch đệm (10x) 2,5 dNTP (2,5 Mm) 2,5 MgCl2 (25 mM) 2,0

Mồi xuôi (10 pmol) 1,0

Mồi ngược (10 pmol) 1,0

DNA khuôn X

Pfu polymerase 0,2

 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:

 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân toàn bộ cDNA mã hóa FIX với cặp mồi (F1/R1) như sau:

 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân cDNA mã hóa cho FIX với chuỗi polypeptide cắt tín hiệu tiết (signal peptide) ở đầu N với cặp mồi (F4/R4) như sau:

2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose

Sản phẩm DNA (tách chiết từ E.coli, mô, từ phản ứng PCR…) được phân

tích định tính nhờ phương pháp điên di trên gel agarose. Agarose là một loại polyme tách từ rong biển, cấu tạo của chúng gồm 2 monome là D-galactose và 3,6- anhydro L-galactose [51].

 Nguyên tắc

DNA là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường đều có hiệu điện thế và cường độ dòng điện thích hợp, chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ nghịch với kích thước đoạn DNA. Từ đó mà DNA được tách thành các vạch khác nhau trên bản gel.

Nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách. Đoạn DNA có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng gel agarose càng lớn và ngược lại. Bảng 6 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự DNA có kích thước xác định [51].

Bảng 6. Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn DNA cần phân tách.

Hàm lƣợng agarose trong gel (%w/v) Kích thƣớc các đoạn DNA cần phân tách (kb) 0,3 5 - 60 0,6 1 - 20 0,7 0,8 - 10 0,9 0,5 - 7 1,2 0,4 - 6 1,5 0,2 - 3 2,0 0,1 - 2

Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) trong khoảng 10 phút. Các phân tử EtBr có khả năng gắn xen giữa các base

của DNA và phát huỳnh quang dưới tách dụng của tia UV, do đó các đoạn DNA sẽ được biểu hiện hiện thành vạch đỏ da cam dưới ánh sáng đèn UV. Để ước lượng kích thước các trình tự DNA trong gel agarose người ta dùng yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (Marker DNA).

 Các bƣớc tiến hành

 Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cho 0,8 g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X,

đem đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 60oC thì đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã cài lược sẵn. Bề dày gel khoảng 50 mm là thích hợp. Sau 30 - 40 phút khi agarose đã được polyme hóa hoàn toàn là có thể điện di được.

 Tra mẫu DNA vào giếng điện di: DNA được trộn với đệm tra mẫu, sau đó tra

vào các giếng trên bản gel. Mẫu DNA được chạy điện di cùng với marker DNA để xác định kích thước phân tử của DNA.

 Chạy điện di: Chạy điện di với chương trình: Hiệu điện thế (U = 50 - 100 V),

cường độ dòng điện (I = 80 - 100 mA).

 Nhuộm DNA: Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra và nhuộm trong

dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µg/ml khoảng 10 - 15 phút. Sau đó lấy bản gel ra và rửa bằng cách ngâm trong nước sạch 2 lần, mỗi lần 5-10 phút.

 Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại

UV254 nm, và được chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh gel tự động.

2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế

 Cơ sở lý thuyết

Sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính tại các vị trí xác định nhờ trình tự nhận biết đặc hiệu.

 Quy trình

Một phản ứng cắt của enzyme hạn chế thường được tiến hành trong tổng thể tích là 10 µl gồm các thành phần sau:

41 Thành phần Thể tích (µl) H2O 6,5 Đệm 10X của enzyme 1,0 DNA 2,0 Enzyme hạn chế 0,5

Hỗn hợp phản ứng cắt được trộn đều, ủ ở 370C với thời gian thích hợp tùy từng loại enzyme. Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%.

2.2.6. Tinh chế các đoạn DNA trên gel agarose

Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoài vector pJET1.2 có sẵn trong bộ Kit tách dòng. Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi cần phải chuẩn bị xử lý các vector biểu hiện, các sản phẩm PCR bằng cách điện di chúng trên gel 0,8% agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV. Quy trình tinh sạch DNA gồm các bước sau:

 Làm tan gel:

 Sau khi điện di xong, cắt phần gel chứa băng DNA tương ứng và chuyển gel vào ống eppendorf, xác định lượng gel đã cắt được.

 Bổ sung dung dịch gắn màng với tỉ lệ: 10 μl dung dịch / 10 mg gel.

 Voltex và ủ ở 65oC cho đến khi gel tan hoàn toàn.

 Gắn DNA lên màng của cột tinh sạch:

 Đưa cột SV vào ống Collection (cột tinh sạch).

 Chuyển hỗn hợp gel đã tan vào cột tinh sạch và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút.

 Ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 2 phút, bỏ phần dịch ở cột Collection.

 Rửa màng:

 Bổ sung 700 μl dung dịch rửa màng (đã bổ sung cồn). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới cột Collection.

 Rửa lại một lần bằng cách bổ sung tiếp 500 μl dung dịch rửa, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 5 phút. Loại bỏ phần dịch phía dưới cột Collection.

 Thu DNA:

 Nhẹ nhàng chuyển cột SV sang một ống eppendorf 1,5 ml sạch.

 Bổ sung 50 μl nước không có nuclease, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, ly tâm 12000 vòng/phút trong thời gian 2 phút.

 Loại bỏ cột SV và giữa DNA ở 4oC hoặc -20oC.

 Kiểm tra DNA bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%.

2.2.7. Ghép nối DNA

 Cơ sở lý thuyết

Dưới sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase, các cầu nối phosphodieste sẽ được hình thành giữa hai nucleotide sát cạnh nhau trên cùng một mạch (gốc phosphat đầu 5’ của nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng thời giải phóng một phân tử nước.

 Quy trình

Thành phần của một phản ứng ghép nối (10 µl):

Thành phần Thể tích (µl)

T4 DNA ligase buffer 10X 1

Sản phẩm PCR 4

DNA plasmid 1

T4 DNA ligase 1

H2O 3

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 160C trong khoảng 3 giờ.

2.2.8. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt

 Cơ sở lý thuyết

Dưới tác dụng của CaCl2 0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai

đoạn sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua các lỗ xốp trên màng tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.

 Quy trình

 Tạo tế bào khả biến cho mục đích chọn dòng:

 Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli DH5α trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm.

 Chuyển 0,5 ml dịch nuôi tế bào qua đêm sang 50 ml môi trường LB lỏng (pha loãng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục nuôi lắc ở 200 vòng/phút, 370C đến khi OD600 nm đạt 0,4 - 0,6. Dịch nuôi cấy sau khi chuyển sang ống ly tâm được để trong đá 20 phút.

 Ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào.

 Tế bào sau khi ly tâm được hòa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phút ở 00C, ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút để thu tế bào.

 Hoàn tan tế bào vào 25 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 25 phút ở 00C, ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút để thu tủa tế bào.

 Hòa tế bào vào 1200 µl dung dịch chứa (800 µl CaCl2 0,1 M và 400 µl glycerol 60%).

 Chia vào các ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 µl dịch tế bào cho ngay vào nitơ lỏng và bảo quản ở -800C.

 Tạo tế bào khả biến cho mục đích biểu hiện gen:

 Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli BL21(DE3) trong 5 ml môi trường LB

 Ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào.

 Tế bào sau khi ly tâm được hòa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phút ở 00C, ly tâm 4.000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút để thu tế bào.

 Hòa tế bào vào 1200 µl dung dịch chứa (800 µl CaCl2 0,1 M và 400 µl glycerol 60%).

 Chia vào các ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 µl dịch tế bào ngay vào nitơ lỏng và bảo quả ở -800C.

 Biến nạp:

 Tế bào khả biến được lấy ra từ -800C và được làm tan trên đá trong 30 phút (tránh sốc nhiệt).

 Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 µl mẫu sản phẩm ligation (DNA + Vector + T4 DNA ligase), đảo nhẹ nhàng để DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đó, đặt toàn bộ trên đá trong thời gian 15 phút. Đối với quá trình biến nạp vào tế bào biểu hiện thì sản phẩm được biến nạp chính là plasmid tái tổ hợp (pET32a/FIXnoSP) đã được tách dòng.

 Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trên đá được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt có nhiệt

độ 420C trong 70 giây với sản phẩm ligation. Đối với tế bào khả biến cho sự biểu hiện gen [BL21(DE3)] thì biến nạp ở nhiệt độ 420C trong thời gian từ 45 giây. Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong thời gian 5 phút. Bổ sung 0,5 ml SOC, lắc hỗn hợp tế bào ở 370C trong 60 phút.

 Hút toàn bộ dịch tế bào và cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh Amp 100 µg/ml. Ủ đĩa ở 370C qua đêm.

2.2.9. Tách chiết DNA plasmid

 Cơ sở lý thuyết

Phương pháp tách chiết DNA plasmid dựa trên nguyên lý sử dụng các hóa chất (SDS, NaOH) có tác dụng phá vỡ cấu trúc thành tế bào vi khuẩn, biến tính các phân tử protein và giải phóng các plasmid của vi khuẩn. Khi thay đổi giá trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch có chứa kali-acetat, các phân tử protein và DNA hệ gen sẽ bị tủa, tách ra khỏi dung dịch bằng ly tâm tốc độ cao. RNA được loại bỏ bằng cách bổ sung RNase.

 Quy trình

 Cấy chuyển 1khuẩn lạc của tế bào E.coli mang plasmid cần tách vào trong

ống nghiệm chứa 1,7 ml môi trường LB có bổ sung Amp (100 µg/ml), nuôi lắc qua đêm ở 370C, 200 vòng/phút.

 Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tâm 6 phút tốc độ 7.000 vòng/phút. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào.

 Hòa đều tế bào thu được với 150 µl dung dịch Sol I bằng máy vortex, để trên đá 5 phút.

 Bổ sung 200 µl dung dịch Sol II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để tránh đứt gẫy DNA, ủ trên đá 5 phút.

 Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch Sol III và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết tủa trắng, ủ trong đá 5 phút.

 Ly tâm 15 phút với tốc độ 12.000 vòng/phút, 40

 Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 µl dung dịch phenol/chloroform, trộn thật đều và ly tâm 15 phút, tốc độ 12.000 vòng/phút.

 Hút pha trên chuyển sang ống eppendorf và lặp lại bước trên với 450 µl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1).

 Tủa dịch pha trên với 2,5 lần thể tích ethanol 100%, thêm dung dịch muối natri acetate (pH 5,2) tới nồng độ cuối cùng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa ở -200C khoảng 2 giờ.

 Thu DNA kết tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Phần tủa DNA được rửa 2 lần với ethanol 70%, mỗi lần 1 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.

 Tủa DNA được làm khô bằng máy Speed-Vac, hòa tan DNA plasmid bằng 50 µl H2O có chứa RNase nồng độ cuối cùng là 10 µg/ml, ủ hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phút.

 Điện di kiểm tra DNA plasmid trên gel agarose 0,8%.

2.2.10. Xác định trình tự DNA

 Nguyên tắc chung

Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 μl.

 Chu trình nhiệt

Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96o

C – 1 phút; (96oC – 10 giây; 50oC – 5 giây; 60oC – 4 phút)x 25 chu kỳ. Sau đó giữ sản phẩm ở 4oC.

 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp EtOH/EDTA

 Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 μl EDTA 125 mM, 60 μl EtOH 100% và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút để tủa DNA có trong đó.

 Loại bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 μl EtOH 70%. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút.

 Làm khô tủa và bổ sung 10 μl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95oC trong 5 phút.

 Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer.

 Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 μl.

 Kết quả được thu nhận và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2.

 Phân tích trình tự gen

Kết quả nhận được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2; Bioedit 7.0; Seqscape 2.5. Từ các chương trình này tiến hành:

 So sánh trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.

 Phân tích những sai khác để đưa ra những dự đoán cần thiết.

Vector biểu hiện pET32a

Xác định trình tự DNA