Quá trình carboxyl hóa
Phân tử protein FIX là một thành viên của nhóm protein phụ thuộc vào vitamin K, nhóm này bao gồm các protein liên quan trực tiếp tới sự đông máu như yếu tố VII, yếu tố IX, yếu tố X, prothrombin, protein C và protein S. Tất cả các protein phụ thuộc vào vitamin K đều chứa acid γ-carboxy glutamic (Gla). Một acid γ-carboxy glutamic được tạo thành bằng việc gắn thêm một nhóm carboxylate vào một acid glutamic tại vị trí carbon γ. Sự biến đổi này được thực hiện bởi enzyme γ- glutamyl carboxylase, một protein được nằm trong màng lưới nội chất của tế bào
19
mô gan [50]. Phản ứng carboxyl hóa thực hiện được cần sự tham gia của cả vitamin K và CO2 (Hình 12).
Trong quá trình phản ứng, đầu tiên vitamin K được oxy hóa để trở thành vitamin K 2,3-epoxide nhờ enzyme glutamyl carboxylase. Sau đó, sản phẩm oxy hóa này lại được quay vòng trở lại thành một dạng khử của vitamin K thông qua sự xúc tác của enzyme vitamin K reductase [30]. Một chất ức chế sự đông máu là warfarin, chất ngăn cản phản ứng chuyển hóa thành dạng khử của vitamin K. Do đó, làm gián đoạn phản ứng hình thành nên acid γ-carboxy glutamic của các protein thuộc nhóm protein phụ thuộc vào vitamin K. Quá trình carboxyl hóa đối với các protein phụ thuộc vào vitamin K là một quá trình cần thiết để giúp cho chúng thực hiện các chức năng sinh học [19].
Ở người, quá trình carboxyl hóa phân tử protein FIX được xúc tác bởi enzyme γ-glutamyl carboxylase xảy ra theo cơ chế dây chuyền. Đầu tiên, enzyme carboxylase nhận biết và bám vào trình tự propeptide trên phân tử protein FIX. Tiếp đó, enzyme carboxylase sẽ trượt trên trình tự amino acid của chuỗi polypeptide để nhận ra acid glutamic và biến đổi acid glutamic thành acid γ-carboxy glutamic (Gla) [55]. Tuy nhiên, enzyme carboxylase chỉ biến đổi các Glu gần vị trí mà nó biết trên trình tự propeotide, điều này giải thích tại sao các Glu lại tập trung ở đầu amino acid [33]. Tất cả các phản ứng carboxyl hóa xảy ra trên phân tử protein FIX theo một phản ứng đơn giữa enzyme và cơ chất, tức là một phân tử enzyme sẽ liên kết với một cơ chất.
20
Hình 12. Phản ứng carboxyl hóa [67].
Acid glutamic trong một protein phụ thuộc vào vitamin K được chuyển hóa trong lưới nội chất để trở thành acid γ-carboxy glutamic trong một phản ứng liên quan tới vitamin K, enzyme γ-glutamyl carboxylase và CO2.
Quá trình loại bỏ trình tự propeptide
Trong phân tử protein FIX, việc loại bỏ trình từ propeptide có vai trò rất quan trọng cho sự hoạt hóa của phân tử protein FIX thành dạng protein có hoạt tính protease/FIXa. Sự loại bỏ trình tự propeptide khỏi phân tử protein FIX xảy ra trong thể Golgi của tế bào gan, trước khi nó được tiết vào máu [60]. Mặc dù vậy, enzyme chịu trách nhiệm chính cho việc loại bỏ trình tự propeptide khỏi phân tử FIX đến nay vẫn còn chưa được xác định. Tuy nhiên, một giả thuyết cho rằng enzyme furin (enzyme furin được tổng hợp từ gen furin) là enzyme chịu trách nhiệm cho việc loại bỏ trình từ propeptide. Enzyme furin được tìm thấy trong các tế bào gan, nó tham
21
gia xúc tác cho phản ứng cắt bỏ các amino acid ghép cặp. Ngoài ra, enzyme này còn có khả năng cắt bỏ trình từ propeptide trên phân tử protein FIX [38]. Thực tế, khi đồng biểu hiện enzyme furin và gen mã hóa cho phân tử protein FIX trong tế bào CHO, đã có được mức độ cao hơn trong việc loại bỏ trình tự propeptide trong phân tử protein FIX [60]. Sự có mặt của trình tự propeptide trong phân tử protein FIX sẽ ngăn cản sự hình thành cấu trúc bậc hai và ba trong vùng Gla (cấu trúc Gla có ái lực cao với ion Ca2+), cấu trúc này là rất cần thiết cho phân tử protein FIX bám vào màng phospholipid hoặc cofactor hoặc chất hoạt hóa. Ngoài ra, sự có mặt của trình tự propeptide trong phân tử protein FIX còn làm giảm mạnh khả năng hoạt hóa của phân tử protein FIX [21], [61]. Vì thế, người mang đột biết gen FIX sẽ ngăn cản sự loại bỏ trình tự propeptide trước khi phân tử protein FIX được tiết vào máu và thể hiện sự suy giảm quá trình đông máu.
Quá trình phosphoryl hóa và sulphat hóa
Ở người, hơn 90% phân tử protein FIX huyết thanh có chứa một serine được phosphoryl hóa (Ser-158), nằm trong vùng hoạt hóa [38]. Mục đích của sự hoạt hóa Ser-158 đến nay vẫn chưa được xác định. Phân tử protein FIX tái tổ hợp được tổng hợp trong tế bào CHO có chứa ít hơn 1% phân tử protein FIX được phosphoryl hóa, nhưng vẫn đảm bảo được hoạt tính sinh học tương tự như với phân tử protein FIX dạng tự nhiên. Điều này chỉ ra rằng sự phosphoryl hóa là biến đổi không cần thiết cho sự hoạt hóa protein FIX. Ngoài ra, mục đích khác của biến đổi này có thể ảnh hưởng tới tuổi thọ của phân tử protein FIX cũng đã được đưa ra, tuy nhiên điều này vẫn chưa được chứng minh và giải thích một cách rõ ràng.
Phân tử protein FIX còn chứa một vị trí được sunfat hóa, (Asp-157). Sự sunfat hóa Asp-157 được xem là có liên quan tới cả sự phục hồi và tuổi thọ của phân tử protein FIX [38].
Quá trình hydroxyl hóa
Sự hydroxyl hóa với phân tử protein FIX xảy ra ở vị trí carbon β của Asp-64 trong vùng EGF1 [29]. Chức năng của quá trình hydroxyl hóa này đến nay vẫn chưa
22
được xác định rõ. Tuy nhiên, sự biến đổi này được xác biết là không cần thiết cho sự hoạt hóa phân tử protein để thực hiện chức năng một protease. Điều này được minh chứng, khi biểu hiện protein FIX tái tổ hợp trong môi trường ức chế sự hydroxyl hóa thì thấy protein tái tổ hợp này vẫn bộc lộ hoạt tính đông máu như bình thường [26]. Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại Asp-64 trong vùng EGF vẫn thể hiện được ái lực cao với ion Ca2+ [57].
Quá trình glycosyl hóa
Phân tử protein FIX huyết thanh có chứa bốn vị trí gắn với chuỗi O-linked oliosaccharide và hai vị trí gắn với N-linked oligosaccharide. Hai vị trí gắn với O- linked oliosaccharide (Ser-53 và Ser-61), được glycosyl hóa đồng dạng và được tìm thấy ở vùng EGFI [38]. Hai vị trí gắn với O-linked oliosaccharide còn lại (Thr-159 và Thr-169) được glycosyl hóa một phần và được định vị ở trong vùng hoạt hóa [38]. Vùng hoạt hóa cũng chứa hai vị trí gắn với N-linked oligosaccharide (Asp-157 và Asp-164) [39].