Mọi sinh vật đều có một bộ máy phân tử để sản xuất các protein cần thiết, nói cách khác, mọi sinh vật đều có khả năng tạo ra protein nhờ vào bộ máy di truyền của chính các tế bào trong cơ thể. Bằng cách sử dụng kỹ thuật rDNA, các nhà khoa học có thể đưa một hoặc nhiều gen mã hóa cho một protein trị liệu vào một cơ thể/tế bào. Khi cơ thể/tế bào này sinh trưởng, nó sẽ đọc và dịch mã gen ngoại lai này và sinh ra protein mong muốn (sẽ được sử dụng vào mục đích chữa bệnh). Đối với dược phẩm sinh học tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện có thể là hệ thống nhân sơ (prokaryote) hoặc nhân chuẩn (eukaryote). Hầu hết các dược phẩm sinh học do Cơ quan Quản lý Lương thực và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration - FDA) phê chuẩn đều được sản xuất thông qua sử dụng các hệ thống biểu hiện này.
Hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn E. coli có rất nhiều ưu điểm quan trọng để đáp ứng là một vật chủ thích hợp cho quá trình biểu hiện gen ngoại lai như: dễ nuôi cấy; môi trường, trang thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản và không tốn kém. Do đó, góp phần hạ giá thành sản phẩm; tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp. Khả năng tạo sản phẩm cao từ 50 mg/l đến 500 mg/l. Bên cạnh đó, hệ thống biểu hiện rDNA ở vi khuẩn vẫn còn tồn tại một số điểm hạn chế. Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào cực kỳ đơn giản, do đó, không giống như các cơ thể đa bào, các vi khuẩn không có khả năng tiến hành các biến đổi hóa học đặc hiệu đối với protein sau khi protein đã được dịch mã từ trình tự DNA. Trong khi đó, hầu hết các protein trị liệu ở người lại cần các dạng biến đổi này để hoàn thiện cấu hình không gian chức năng của chúng. Tuy nhiên, những nhược điểm này có thể được cải thiện bằng cách sử dụng các vector biểu hiện thế hệ mới như: pET32a, pET32b... sẽ góp phần cải thiện được sự tính tan của các protein biểu hiện hay sử dụng các phương pháp hóa học để cải biến cấu trúc của phân tử protein sau khi biểu hiện ở vi khuẩn thành dạng hoạt hóa như biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn.
30
Để khắc phục những điểm yếu khi biểu hiện gen ở vi khuẩn, các hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, chẳng hạn như nấm men (ví dụ,
Saccharomyces cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) đang ngày
càng được sử dụng rộng rãi. Ưu điểm của nấm men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá đơn giản, không sản sinh nội độc tố và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy mô lớn. S. cerevisiae là nấm men được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các protein tái tổ hợp.
Hiện nay, hệ thống tế bào động vật có vú như tế bào thận người (Human Embryonic Kidney - HEK), tế bào thận chuột chưa trưởng thành (Baby Hamster Kidney - BHK) và tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary - CHO) thường được lựa chọn để sản xuất các protein trị liệu cho người. Mặc dù, hệ thống này có rất nhiều nhược điểm như: sản lượng protein thu được khá thấp và giá thành sản xuất các sản phẩm sử dụng các hệ thống này khá cao, do tốc độ sinh trưởng của tế bào chậm và môi trường nuôi cấy đắt tiền nhưng trong nhiều trường hợp tạo protein tái tổ hợp nó vẫn là lựa chọn duy nhất. Đến nay, trên thế giới đã có khoảng 60 - 70% dược phẩm sinh học là protein tái tổ hợp được sản xuất nhờ sử dụng hệ thống tế bào CHO. Đối với các glycoprotein có nguồn gốc từ người việc gắn nhóm đường là thiết yếu, do nó ảnh hưởng lên chức năng cũng như chu kỳ bán rã của protein. Nếu đường hóa sai hoặc không xảy ra protein sẽ không bao giờ thực hiện được hoàn toàn chức năng của nó. Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng chọn hệ biểu hiện là tế bào động vật (CHO) vì yếu tố đông máu IX cũng cần phải trải qua quá trình đường hóa để thực hiện được chức năng xúc tác.
1.9. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây. Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành phân lập, xác định trình tự một số gen từ các nguồn sinh vật khác nhau, bao gồm
31
các gen của người để nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất dược phẩm Công nghệ Sinh học. Viện Công nghệ Sinh học đã nghiên cứu biểu hiện và tinh chế được các protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật như: Trichobakin từ cây qua lâu, có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư; protein bất hoạt ribosome (RIP) từ cây mướp đắng có hoạt tính kháng virus, nấm [8], [9], [12], [14]. Viện cũng đã nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người, rh-IL2MM dạng đột
biến và kháng nguyên CD25 nhằm sử dụng trong điều trị và chẩn đoán ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng [1], [3], [4], [15]. Các nhà khoa học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã triển khai tạo dòng và biểu hiện mini-proinsulin của người trong E. coli [2]. Các nghiên cứu tạo vaccine tái tổ hợp cũng được quan tâm nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm [6]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Tạ Thành Văn và cộng sự tại Trường Đại học Y Hà Nội cũng bước đầu nghiên cứu phân lập và thiết kế vector biểu hiện một số vùng chức năng của gen FVIII [13]. Gần đây, nhóm chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mô người (h-tPA) ở tế bào nuôi cấy từ buồng trứng chuột Hamster [11].
32
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Mẫu nghiên cứu
Các mẫu gan sinh thiết được lấy từ những người Việt Nam khỏe mạnh do bệnh viện K cung cấp, chúng tôi đã có danh sách của 7 người nam và nữ tình nguyện cho mẫu gan sinh thiết ở Bảng 2.
Bảng 2. Danh sách các đối tượng cho mẫu gan sinh thiết.
STT Tên Giới tính Tuổi Mẫu mô gan (g)
1 Lương Mỹ H. Nữ 28 2-3
2 Nguyễn Hoàng Q. Nam 45 2-3
3 Nguyễn Tuấn N. Nam 30 2-3
4 Nguyễn Ánh H. Nữ 54 2-3
5 Phạm Thu T. Nữ 47 2-3
6 Đỗ Xuân H. Nam 17 2-3
7 Trương Văn S. Nam 20 2-3
Chủng vi sinh vật
Chủng E.coli DH5α [end AL shd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1∆ lac
U169 (80 lacZM15)] của hãng Invitrogen được sử dụng để chọn dòng và nhân dòng gen.
Chủng E. coli BL21(DE3) [F-, ompT, hsdS (rB- mB), gal] của hãng Bio-Rad
được sử dụng để biểu hiện gen mã hóa yếu tố đông máu IX ở người.
Các vector
Vector tách dòng: pJET1.2/blunt (Fermentas) được trình bày trong Bảng 4.
Vector biểu hiện: pET32a (Novagen) được trình bày trong Bảng 4.
33
Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa trên trình tự cDNA chuẩn công bố trên Genbank (NM_000133) và đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
Bảng 3. Trình tự các cặp mồi được sử dụng.
STT Tên mồi Trình tự nucleotide
1
FIX-F1 5’- GCT AGC AAA GGT TAT GCA GCG C- 3’ FIX-R1 5’- GGA AAT CCA TCT TTC ATT AAG TG- 3’
2
FIX-F4-NcoI 5’-TTC TGG TGC ACC ATG GTT TTT CTT GAT CAT GAA AAC GCC-3’
FIX-R5-XhoI 5’- ATATG CTC GAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGT GAG CTT TGT TTT TTC C- 3’
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F1/R1) để nhân toàn bộ cDNA mã hóa FIX từ mRNA được tách từ mô gan sinh thiết ở người. Trong khi biểu hiện, chúng tôi thiết kế cặp mồi (F4/R5) với mục đích nhân đoạn cDNA mã hóa FIX với chuỗi polypeptide cắt vùng tín hiệu tiết (signal peptide) ở đầu N để biểu hiện đoạn cDNA này trong tế bào vi khuẩn E. coli. Protein mã hóa từ cDNA
được nhân với cặp mồi (F4/R5), kí hiệu là FIXnoSP.
Hóa chất
Các enzyme giới hạn NcoI, XbaI, XhoI...; các hóa chất dùng cho kỹ thuật
PCR (đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq DNA polymerase, enzyme Pfu DNA
polymerase được đặt mua tại hãng Fermentas.
Các hóa chất dùng để tách RNA, DNA plasmid hay điện di protein của hãng Amersham Bioscien (Anh), BioRad (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merk (Đức).
Các bộ Kit tổng hợp cDNA, tinh sạch sản phẩm PCR, tinh sạch DNA plasmid... của hãng Promega (Mỹ), Invitrogen (Mỹ).
34 Trang thiết bị
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các trang thiết bị của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen: Tủ lạnh sâu -20o
C, -80oC (Sanyo, Nhật Bản); Lò vi sóng (Samsung, Hàn Quốc); Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phân tích (Mettler Toledo 10-4 g, Thụy Sĩ); Máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ); Máy ly tâm cao tốc (Avanti TM 30 Centrifuge Beckman, Mỹ); Máy soi DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ); Máy điện di (PowerPac 300, BioRad, Mỹ); Máy chụp ảnh GEL-DOC (Pharmacia Biotech, Thụy Điển); PCR (GeneAmp PCR System 9700); Máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer; Box nuôi cấy vi khuẩn….
Bảng 4. Các vector tách dòng và biểu hiện.
A. Vector tách dòng pJET1.2/blunt của hãng Fermentas, Canada
B. Vector biểu hiện pET32a của hãng Novagen, Mỹ
35
Bảng 5. Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật.
Môi trƣờng (1 lít) pH Cao nấm men (g) Trypton (g) NaCl (g) Thạch (g) Hóa chất khác (g) LB lỏng 7,0 5 10 10 NaOH: 0,144 LB đặc 7,0 5 10 10 15 NaOH: 0,144 SOC 7,0 5 20 0,584 KCl 0,186; MgSO4 1,203; MgCl2 0,952; Glucose 3,603 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số
Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô gan sinh thiết người được mô tả chi tiết theo quy trình sau:
Đồng nhất mẫu
Cân 50-100 mg mẫu (mô gan sinh thiết) được nghiền với 1 ml trizol thành dịch đồng nhất trong bộ nghiền mẫu thủy tinh, chuyển dịch nghiền mẫu vào ống eppendorf 1,5 ml.
Tách pha có chứa RNA
Bổ sung 0,2 ml chloroform, lắc đều trong 15 giây. Để hỗn hợp thu được ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40
C.
Hút pha lỏng không màu ở trên cùng sang một ống eppendorf sạch.
Kết tủa RNA
Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ thể tích (1:1), trộn đều và để hỗn hợp trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, thu tủa RNA.
36
Bổ sung 1 ml ethanol 70%, vortex để rửa RNA.
Ly tâm 7.000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C, thu RNA và để khô kết tủa trong không khí.
Hòa tan RNA
Bổ sung 50 µl H2O đã được xử lý với DEPC 0,01%.
Lắc đều và ủ hỗn hợp trong 10-15 phút ở nhiệt độ phòng.
Kiểm tra chất lƣợng và số lƣợng RNA
Xác định nồng độ RNA dựa trên giá trị OD260.
Điện di biến tính 4 l RNA tổng số để kiểm tra mức độ nguyên vẹn của RNA tổng số.
RNA được lưu giữ ở -800C.
2.2.2. Tổng hợp cDNA
cDNA sợi một được tổng hợp từ khuôn RNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn của Kit tổng hợp cDNA SuperScriptTM
First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Các phân tử RNA thông tin có đuôi polyA ở đầu 3’ nên các oligo (dT) sẽ bắt cặp bổ sung với đuôi poly A và dưới sự xúc tác của enzyme SuperScriptTM II Reverse Transcriptase tổng hợp nên các sợi cDNA. Sau cùng, RNase H sẽ phân hủy toàn bộ RNA khuôn và sản phẩm thu được sẽ chứa toàn các cDNA sợi một được gắn với đuôi oligo (dT) ở đầu 5’.
Phản ứng tổng hợp cDNA được tiến hành trong tổng thể tích 10 µl (0,3 µg RNA tổng số, 1 µl dNTPS 10 mM, 1 µl mồi oligo (dT)12-18 0,5 µg/µl và H2O). Hỗn hợp được ủ ở 650C trong 5 phút và làm lạnh trong đá trong ít nhất 1 phút.
Bổ sung 9 µl thể tích hỗn hợp (2 µl 10X RT buffer, 4 µl MgCl2 25 mM, 2 µl DTT 0,1 M và 1 µl RNaseOUTTM 40 U/µl) vào hỗn hợp trên và ủ phản ứng ở 420C trong 2 phút.
Bổ sung 1 µl SuperScriptTM II RT 50U/µl vào hỗn hợp và tiếp tục phản ứng ở 420C trong 60 phút.
37
Dừng phản ứng ở 700C trong 15 phút và làm lạnh nhanh trên đá.
Bổ sung 1 µl RNaseH 2 U/µl được bổ sung vào hỗn hợp và ủ ở 370C trong 30 phút.
Giữ mẫu ở -200C.
2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR
Cơ sở lý thuyết của PCR
PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA
in vivo trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp DNA kéo dài từ mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả sau khoảng 2-3 giờ, lượng DNA sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần.
Quy trình kỹ thuật
Một chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn sau:
Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép ban đầu tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao (94 – 95oC) trong thời gian ngắn.
Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ thích hợp (khoảng 50 – 60oC), hai mồi là các oligonucleotide dài từ 15 – 30 nucleotide sẽ bám vào hai đầu của đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.
Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên
khoảng 70 - 80oC là nhiệt độ thích hợp để Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi,
tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu.
Thành phần của phản ứng:
Một mẫu phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 μl gồm có các thành phần sau:
38 Thành phần Thể tích (μl) H2O (15,8 – X) Dung dịch đệm (10x) 2,5 dNTP (2,5 Mm) 2,5 MgCl2 (25 mM) 2,0
Mồi xuôi (10 pmol) 1,0
Mồi ngược (10 pmol) 1,0
DNA khuôn X
Pfu polymerase 0,2
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân toàn bộ cDNA mã hóa FIX với cặp mồi (F1/R1) như sau:
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân cDNA mã hóa cho FIX với chuỗi polypeptide cắt tín hiệu tiết (signal peptide) ở đầu N với cặp mồi (F4/R4) như sau:
39
2.2.4. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose
Sản phẩm DNA (tách chiết từ E.coli, mô, từ phản ứng PCR…) được phân
tích định tính nhờ phương pháp điên di trên gel agarose. Agarose là một loại polyme tách từ rong biển, cấu tạo của chúng gồm 2 monome là D-galactose và 3,6- anhydro L-galactose [51].
Nguyên tắc
DNA là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường đều có hiệu điện thế và cường độ dòng điện thích hợp, chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ nghịch với kích thước đoạn DNA. Từ đó mà DNA được tách thành các vạch khác nhau trên bản gel.
Nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách. Đoạn DNA có kích thước càng nhỏ đòi hỏi hàm lượng gel agarose càng lớn và ngược lại. Bảng 6 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự DNA có kích thước xác định [51].
Bảng 6. Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn DNA cần phân tách.
Hàm lƣợng agarose trong gel (%w/v) Kích thƣớc các đoạn DNA cần phân tách (kb) 0,3 5 - 60 0,6 1 - 20 0,7 0,8 - 10 0,9 0,5 - 7 1,2 0,4 - 6 1,5 0,2 - 3 2,0 0,1 - 2
Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) trong khoảng 10 phút. Các phân tử EtBr có khả năng gắn xen giữa các base
40
của DNA và phát huỳnh quang dưới tách dụng của tia UV, do đó các đoạn DNA sẽ