Nguyên tắc chung
Trình tự nucleotide quan tâm được xác định trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn DNA một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2 pM, DNA plasmid 200 ng, BigDye và đệm tương ứng với tổng thể tích 15 μl.
Chu trình nhiệt
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong máy GenAmp® PCR System 9700 như sau: 96o
C – 1 phút; (96oC – 10 giây; 50oC – 5 giây; 60oC – 4 phút)x 25 chu kỳ. Sau đó giữ sản phẩm ở 4oC.
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp EtOH/EDTA
Bổ sung vào sản phẩm PCR 5 μl EDTA 125 mM, 60 μl EtOH 100% và để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sau đó, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút để tủa DNA có trong đó.
47
Loại bỏ EtOH, rửa tủa bằng 60 μl EtOH 70%. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
Làm khô tủa và bổ sung 10 μl Hi-DiTM Formamide để biến tính ở 95oC trong 5 phút.
Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer.
Các ống được điện di trong ống vi mao quản 80 cm x 50 μl.
Kết quả được thu nhận và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 – Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis 5.2.
Phân tích trình tự gen
Kết quả nhận được phân tích trên máy tính bằng các phần mềm Sequencing Analysis 5.2; Bioedit 7.0; Seqscape 2.5. Từ các chương trình này tiến hành:
So sánh trình tự của đoạn DNA với trình tự chuẩn.
Phân tích những sai khác để đưa ra những dự đoán cần thiết.